用于細(xì)胞擴(kuò)增的輻照膜的制作方法

專利名稱：用于細(xì)胞擴(kuò)增的輻照膜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于培養(yǎng)貼壁或懸浮細(xì)胞，尤其是貼壁細(xì)胞的膜，其中由于使用從12.5到175kGy劑量的伽馬-或貝塔-射線或電子束在氧氣存在下輻照濕的或干的膜，使得所述膜允許細(xì)胞的粘附和增殖。得到的膜的使用可以不需任何表面改性物質(zhì)的預(yù)處理。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備所述輻照膜的方法，該膜能夠用于細(xì)胞，尤其是貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，并涉及將這樣的膜應(yīng)用于細(xì)胞，尤其是貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明旨在確定一種膜，其表現(xiàn)出與代表了當(dāng)今使用培養(yǎng)燒瓶或多層細(xì)胞培養(yǎng)器的細(xì)胞擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)聚苯乙烯(TCPQ板大致相似的生長特性。需要測量的首要特性是細(xì)胞擴(kuò)增率，細(xì)胞在膜上的再附著效率，和包括形態(tài)控制、表型和分化潛能在內(nèi)的擴(kuò)增后細(xì)胞的特性。這樣的膜應(yīng)當(dāng)適于制成不同的幾何形狀，例如平板或中空纖維膜。本發(fā)明尤其涉及能夠用于例如培養(yǎng)、生長、儲存和/或擴(kuò)增不同種類的貼壁細(xì)胞的膜。在本發(fā)明中，“細(xì)胞培養(yǎng)”或“細(xì)胞的培養(yǎng)”的表達(dá)形式包括以下全部應(yīng)用，即不同類型細(xì)胞的貼壁、維持、生長、擴(kuò)增、分化、分子生物修飾(如轉(zhuǎn)染)、和/或儲存。與體內(nèi)的大部分細(xì)胞相類似，許多細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，或錨定依賴性細(xì)胞；也就是說，只有當(dāng)它們附著在表面或基質(zhì)上時才能夠新陳代謝和分裂。僅有循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞和紅血球)和其它類型的細(xì)胞例如造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、CHO細(xì)胞等能夠在體外溶液中懸浮地和非附著地生長。當(dāng)許多錨定依賴性細(xì)胞在玻璃器皿或合成的表面上生長時， 這些細(xì)胞通常會喪失其分化和對激素產(chǎn)生響應(yīng)的能力。細(xì)胞形態(tài)的損失不僅使細(xì)胞蒙受了功能上的損失，而且阻止了長期培養(yǎng)系統(tǒng)的再生能力。然而長期培養(yǎng)具有重要意義，例如， 在使用人體細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)方面，并且許多細(xì)胞無論在任何數(shù)量都是不能用的。鑒于此種原因，這樣的組織培養(yǎng)盤通常涂覆有細(xì)胞外基質(zhì)組分如膠原或纖連蛋白。但是，異體因子的使用顯然是不利的，尤其是當(dāng)這樣的細(xì)胞或其所處的基質(zhì)是用于人類醫(yī)療時，因為其將會帶來污染的風(fēng)險并可能導(dǎo)致被治療患者的有害反應(yīng)。例如，細(xì)胞在這樣的表面上生長或是保持其能力的喪失，是目前組織培養(yǎng)技術(shù)的一個主要限制。組織培養(yǎng)是那些能用來移植到人體中的組織和器官的一個潛在的來源。例如，組織培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞能夠潛在地用于皮膚移植。其目的旨在研發(fā)能夠恢復(fù)和保持正常功能的生物替代品，例如，通過使用無細(xì)胞基質(zhì)，這取決于身體在新組織生長的適當(dāng)取向和方向方面再生的能力；或是通過使用帶有粘附著其上的細(xì)胞的膜或基質(zhì)(Atal乂2006) Recent development in tissue engineering and regenerative medicine，Curr. Opin. Pediatr. 16，167-171)。細(xì)胞還能夠通過注射與載體一起或單獨(dú)用于治療。此時，細(xì)胞需要在培養(yǎng)中擴(kuò)增、附著在載體基質(zhì)上，并隨后在擴(kuò)增后再植入到宿主體內(nèi)。獸醫(yī)治療方面的應(yīng)用在當(dāng)今是可行的，并且代表了用于細(xì)胞培養(yǎng)的膜的一個附加用途。培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是貼壁細(xì)胞的能力也是重要的，因其代表著能夠生產(chǎn)大量的生物產(chǎn)品例如生長因子、抗體和病毒的生物“工廠”。隨后這些產(chǎn)品能夠從細(xì)胞培養(yǎng)中分離出來
3并用于例如治療人類疾病。此外，細(xì)胞培養(yǎng)是在制藥和生命科學(xué)工業(yè)領(lǐng)域進(jìn)行生物相容性和毒理學(xué)研究的新興工具。最后，組織培養(yǎng)通常包括僅來自一個或少數(shù)幾個組織或器官的細(xì)胞。其結(jié)果是，細(xì)胞培養(yǎng)為科學(xué)家提供了一個系統(tǒng)用于研究某個細(xì)胞類型的性質(zhì)，而不會產(chǎn)生使用整個有機(jī)體進(jìn)行研究的復(fù)雜性。一種已知用于培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的方法涉及中空纖維膜生物反應(yīng)器。在該系統(tǒng)中，細(xì)胞通常附著到柱狀中空纖維膜的內(nèi)腔中。培養(yǎng)介質(zhì)和氧氣流過該柱狀中空纖維膜的中心， 膜的分子量截止性能允許營養(yǎng)和氧氣到達(dá)細(xì)胞而不會使得細(xì)胞逃逸。已經(jīng)有多種聚合物被建議用來生產(chǎn)用于細(xì)胞和組織培養(yǎng)方面的半透膜 (US2007/269489)。其包括聚藻酸鹽，聚氯乙烯，聚偏二氟乙烯，聚氨酯異氰酸酯，醋酸纖維素，二醋酸纖維素，三醋酸纖維素，硝化纖維素，聚砜，聚醚砜，聚苯乙烯，聚氨酯，聚乙烯醇， 聚丙烯腈，聚酰胺，聚甲基丙烯酸甲酯，聚四氟乙烯，聚環(huán)氧乙烷以及這些聚合物的組合。聚合物支持體也可以由聚乙烯對苯二甲酸酯(PET)或聚碳酸酯組成。進(jìn)一步建議的材料，例如，作為支架用于可移植的組織材料，是纖維素或大孔膠原載體或可生物降解的基質(zhì)。W093/00439A1公開了在生物相容的半透膜中保持細(xì)胞培養(yǎng)，其中該細(xì)胞被刺激并分泌活性因子。所用的半透膜允許該活性因子的穿透擴(kuò)散卻拒絕外部環(huán)境中的有害物質(zhì)到達(dá)該培養(yǎng)物。所述的膜具有管狀形狀并且據(jù)稱能夠允許分子量高達(dá)150kDa的分子的擴(kuò)散。 建議用于所述膜的材料是丙烯酸共聚物，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚氨酯，聚酰胺，聚甲基丙烯酸酯，聚砜，聚丙烯酸酯，聚偏二氟乙烯，聚氨酯異氰酸酯，聚藻酸酯，醋酸纖維素，聚砜，聚乙烯醇，聚丙烯腈，聚環(huán)氧乙烷及其衍生物和它們的混合物。在制備這些膜的過程中未見到使用任何輻照的描述。由此該膜不能用作本發(fā)明中細(xì)胞粘附的基質(zhì)。W090/11820A2公開了平板膜，其表面可以用于體外的細(xì)胞生長或作為體內(nèi)人工植入體。根據(jù)描述，該膜是多孔的，具有在0.1到100微米范圍的孔徑并且在一個中間層上具有指狀形狀。該膜包括疏水聚合物和親水聚合物。疏水聚合物的例子包括聚砜，聚酰胺，聚醚砜，聚酯，聚碳酸酯，優(yōu)選聚醚聚氨酯及其共聚物。該參考文獻(xiàn)并未報導(dǎo)該膜是否能夠用于粘附和培養(yǎng)細(xì)胞。也未描述使用任何的輻照技術(shù)。除了鑒定膜組成能夠作為基質(zhì)用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的問題外，目前現(xiàn)有技術(shù)中已知的膜沒有能力充分地促進(jìn)和維持粘附、擴(kuò)增，分化和延長生命周期，如果不對這些膜或基質(zhì)加以預(yù)處理或添加外源因子如纖連蛋白，層粘連蛋白或膠原的話。例如，F(xiàn)issellQ006)在 Expert Rev. Med. Devices 3 O)，155 中對基于將腎小管細(xì)胞粘附到合成的聚砜基中空纖維膜的人工腎臟的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。在這種情況下， 膜必須涂覆ftONectin-L以促進(jìn)細(xì)胞的附著。US-A 6，150，164和US-A 6，942，879均詳細(xì)展示了得到基于腎細(xì)胞的生物人工腎臟的方式，將例如內(nèi)皮細(xì)胞或所謂的腎干細(xì)胞種植到中空纖維膜內(nèi)部。其中提到有用的中空纖維膜是基于纖維素，聚丙烯腈，聚砜或其它組分及其共聚物。該中空纖維的內(nèi)表面和外表面都預(yù)涂覆有適用的細(xì)胞外基質(zhì)組分(EMC)包括I型膠原，IV型膠原，層粘連蛋白，基質(zhì)膠，蛋白多糖，纖連蛋白及其組合。只有在進(jìn)行這樣的處理之后才能夠進(jìn)行細(xì)胞的種植。在已知的程序中使合成膜例如聚砜基膜經(jīng)受伽馬-輻照以使膜內(nèi)部的特定組分例如PVP交聯(lián)，或是使膜消毒。輻照劑量通常在10到50kGy，優(yōu)選在20到35kGy的范圍內(nèi) (參見例如US 6，960，297B2或US-A 6，103，117)。通常避免更高的劑量以使得膜的降解最小化。此外，所述的已知方法通常設(shè)計成避免氧氣的存在，也是出于同樣的原因，即形成侵蝕性的氧衍生物例如氧自由基或H2A使膜降解。通過伽馬-輻照消毒通常在水溶液條件下進(jìn)行，即使用濕膜，其中該溶液經(jīng)過脫氣以去除氧氣。當(dāng)使用干的條件時，也要通過使用惰性氣氛，除氧劑等從系統(tǒng)中去除氧氣。更進(jìn)一步地，現(xiàn)有技術(shù)中所述的膜和方法的目標(biāo)是避免細(xì)胞在通常用于滲析治療的膜上的粘附或使其最小化。這與本發(fā)明致力于提供有利于細(xì)胞粘附和生長的表面的目的相對立。因此，現(xiàn)有技術(shù)中所述的用于提供膜的方法無助于本發(fā)明的目的，即細(xì)胞的培養(yǎng)。EP 1 795 254 Al公開了一種聚砜基膜的制備，其中在一定條件下將膜暴露于放射性射線，例如伽馬射線中，該條件為膜周圍環(huán)境空氣中氧濃度從0. 001到0. 或更低， 膜的含濕量從0.2到7wt. %，相對于其重量。在該參考文獻(xiàn)中提到更高的氧濃度，尤其是環(huán)境空氣的使用，會導(dǎo)致激發(fā)氧自由基破壞聚合物的主鏈并使其分解，由此期望使用惰性氣氛，優(yōu)選還有除氧劑的存在。由于難以絕對地排除氧氣，以上提到的限止建議作為最高的氧氣水平。EP 1 795 254 Al進(jìn)一步指出在使用伽馬射線的情況下，輻照劑量應(yīng)當(dāng)為1到 50kGy,或者最好為10到30kGy。更低的劑量會導(dǎo)致不夠充分地消毒而更高的劑量會使膜的組分解體。該參考文獻(xiàn)并未考慮該膜在細(xì)胞培養(yǎng)方面的用途。JP 2003/^455 還描述了一種不需要使用濕(充水)纖維的中空纖維膜的輻照方法。在該方法中，含濕量調(diào)整到該中空纖維膜重量的至少4%。中空纖維膜組件中的氧濃度調(diào)整到0. 1到3.6%。US2006/191844描述了膜組件的處理方法，通過將膜組件中充滿脫氣的RO水溶液，然后密封，之后將該組件暴露于10到60kGy的伽馬射線中。當(dāng)伽馬射線的劑量過高時， 疏水聚合物，親水聚合物和/或殼體可能會解體和劣化。由此，公開的伽馬射線的劑量優(yōu)選在50kGy或更低，尤其是30kGy或更低。當(dāng)使用未脫氣的水時，溶解在水中的氧使得膜的組分氧化并劣化。W02006/135966 Al公開了一種用于使膜的親水組分，例如PVP交聯(lián)的方法，其使用伽馬射線，可選地與化學(xué)溶液處理方法結(jié)合。使用的劑量從1到IOOkGy,優(yōu)選10到 50kGy。據(jù)稱該輻照可以用于干膜或濕膜。但是，其給出的實(shí)施例是使用濕膜并且劑量不超過35kGy。未提到根據(jù)該參考文獻(xiàn)制備的膜用于培養(yǎng)細(xì)胞。EP 1 439 212 Al還描述了對聚砜和PVP基膜使用伽馬射線輻照。又是將膜在濕的狀態(tài)下輻照，其中膜應(yīng)當(dāng)含有至少Iwt. %或更多的水或者浸沒在水中，并且劑量不超過 50kGy以避免膜的降解。其教導(dǎo)輻照會減少血小板在膜表面的粘附，這與本發(fā)明的目標(biāo)，即細(xì)胞在臘表面的粘附相對立。JP 2004/305840描述了由疏水性聚合物和親水性聚合物組成的中空纖維膜，其在紡絲后使用伽馬射線輻照消毒。輻照是在干的低溫脫氧密封狀態(tài)下進(jìn)行。需要再次指出的很重要的一點(diǎn)是氧氣的排除是很關(guān)鍵的。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，公開的膜是在制備出來后，在氧的存在下以伽馬-或貝塔-射線或電子束以從12. 5到175kGy的劑量處理過的。在輻照過程中，膜可以是處于干的或濕的狀態(tài)， 并且可以分別被空氣，水，或者水溶液覆蓋。本發(fā)明還指出了制備這樣的膜的方法。本發(fā)明還指出了使用該膜用于促進(jìn)細(xì)胞粘附和培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是貼壁細(xì)胞的方法，而無需預(yù)處理該膜或使用任何細(xì)胞外基質(zhì)組分來預(yù)涂覆該膜。本發(fā)明中優(yōu)選的膜是聚砜基，聚醚砜基或聚(芳基)醚砜基的合成膜，此外還包括PVP和可選地少量其它聚合物，例如聚酰胺或聚氨
附圖簡介

圖1顯示了在第一(14天)和第二(7天)生長階段后，未處理的骨髓在不同類型的膜上生長的MSC數(shù)目相對于在標(biāo)準(zhǔn)的TCPS上生長的MSC數(shù)目，以[% ]形式計(試驗1)。 水平線表示TCPS水平。使用的簡寫見表I。圖2顯示了在第一(14天)和第二(7天)生長階段后，未處理的骨髓在不同類型的膜上生長的MSC數(shù)目相對于在標(biāo)準(zhǔn)的TCPS上生長的MSC數(shù)目，以[% ]形式計(試驗2)。 水平線表示TCPS水平。使用的簡寫見表I。圖3顯示了在第二生長階段的第5天在常規(guī)的TCPS盤上再涂覆的MSC的形態(tài)。 該MSC來自如實(shí)施例10所述的試驗2。簡寫如表I所述。(A) VTK膜，水覆蓋，0%的丙烯酸，75kGy。(B) VTK膜，水覆蓋，0. 0001%的丙烯酸，75kGy。(C) VTK膜，水覆蓋，0. 001 %的丙烯酸，75kGy。(D) VTK膜，水覆蓋，0.01%的丙烯酸，75kGy。(E)TCPS0 (F) VTK膜，空氣覆蓋， 25kGy。出)￥1￥膜，空氣覆蓋，751^7。(H) VTK膜，未經(jīng)處理。(J) VTK膜+FN涂層。圖4顯示了在第一(9天)和第二(7天)生長階段后，預(yù)先選擇的MSC在不同類型的膜上生長的MSC數(shù)目相對于在標(biāo)準(zhǔn)的TCPS上生長的MSC數(shù)目，以[%]形式計(試驗 1)。水平線表示TCPS水平。使用的簡寫見表II和實(shí)施例11。圖5顯示了在第一(10天)和第二(11天)生長階段后，預(yù)先選擇的MSC在不同類型的膜上生長的MSC數(shù)目相對于在標(biāo)準(zhǔn)的TCPS上生長的MSC數(shù)目，以[%]形式計(試驗2)。水平線表示TCPS水平。使用的簡寫見表II和實(shí)施例11。圖6顯示了直接用伽馬射線輻照過的膜與在伽馬射線輻照前用蒸汽消毒的膜之間的對比。如實(shí)施例12所述的試驗表明粘附到給定的膜表面的MSC數(shù)目相對于粘附到標(biāo)準(zhǔn)的TCPS表面的MSC數(shù)目，以[%]形式計。水平線表示TCPS水平。圖7顯示了在第一(11天)和第二(7天)生長階段后，未處理的骨髓在使用75kGy 輻照與w/o蒸汽和ETO消毒的膜上生長的MSC數(shù)目相對于在標(biāo)準(zhǔn)的TCPS上生長的MSC數(shù)目，以[% ]形式計。水平線表示TCPS水平。圖8顯示了在本發(fā)明的膜上生長的MSC的成功的脂肪形成。(A)VTK膜，水覆蓋， 0.01%的丙烯酸，75kGy。(B) VTK膜，水覆蓋，0.01%的烯丙胺，75kGy。(C) VTK膜，水覆蓋， 0.01%的丙烯酸和0. 01%的烯丙胺，25kGy。圖9顯示了在本發(fā)明的膜上生長的MSC的成功的骨生成。(A)TCPS膜(對照)。⑶ VTK膜，水覆蓋，0.01%的丙烯酸，75kGy。(C) VTK膜，水覆蓋，0.01%的烯丙胺，75kGy。(D) VTK膜，水覆蓋，0.01%的丙烯酸+0.01%的烯丙胺，75kGy。(E) VTK膜，水覆蓋，0. 01 %的丙烯酸，25kGy。(F) VTK膜，水覆蓋，0. 5%的丙烯酸，25kGy。圖10顯示了人體皮成纖維細(xì)胞(NHDF)在使用25kGy (空氣覆蓋)或75kGy (水覆蓋)輻照過的VTK膜上短期細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果與TCPS進(jìn)行對比。左邊的柱顯示了在1天后 NHDF細(xì)胞的數(shù)目相對于TCPS上的細(xì)胞數(shù)目，即顯示了細(xì)胞粘附的效率。右邊的柱顯示了在 5天后NHDF細(xì)胞的數(shù)目相對于TCPS上的細(xì)胞數(shù)目，即顯示了細(xì)胞增殖的效率。圖11顯示了人體肝癌細(xì)胞0fepG2)在使用25kGy (空氣覆蓋)或75kGy (水覆蓋) 輻照過的VTK膜上短期細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果與TCPS進(jìn)行對比。左邊的柱顯示了在1天后H印G2 細(xì)胞的數(shù)目相對于TCPS上的細(xì)胞數(shù)目，即顯示了細(xì)胞粘附的效率。右邊的柱顯示了在5天后HepG2細(xì)胞的數(shù)目相對于TCPS上的細(xì)胞數(shù)目，即顯示了細(xì)胞增殖的效率。本發(fā)明的膜表現(xiàn)出優(yōu)于TCPS表面的細(xì)胞粘附和增殖性能。圖12顯示了人體腎上皮細(xì)胞(HK-2)在使用25kGy (空氣覆蓋)或75kGy (水覆蓋) 輻照過的VTK膜上短期細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果與TCPS進(jìn)行對比。左邊的柱顯示了在1天后HK-2 細(xì)胞的數(shù)目相對于TCPS上的細(xì)胞數(shù)目，即顯示了細(xì)胞粘附的效率。右邊的柱顯示了在5天后HK-2細(xì)胞的數(shù)目相對于TCPS上的細(xì)胞數(shù)目，即顯示了細(xì)胞增殖的效率。圖13顯示了犬的腎上皮細(xì)胞(MDCK)在使用25kGy (空氣覆蓋)或75kGy (水覆蓋) 輻照過的VTK膜上短期細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果與TCPS進(jìn)行對比。左邊的柱顯示了在1天后MDCK 細(xì)胞的數(shù)目相對于TCPS上的細(xì)胞數(shù)目，即顯示了細(xì)胞粘附的效率。右邊的柱顯示了在5天后MDCK細(xì)胞的數(shù)目相對于TCPS上的細(xì)胞數(shù)目，即顯示了細(xì)胞增殖的效率。圖14顯示了基于本發(fā)明的膜的生物反應(yīng)器中細(xì)胞的倍增時間比與標(biāo)準(zhǔn)的燒瓶培養(yǎng)(見實(shí)施例1 進(jìn)行對比。該倍增時間是指在給定的生物反應(yīng)器中的細(xì)胞倍增時間/在對照燒瓶中的細(xì)胞倍增時間。圖15顯示了由未處理的骨髓培養(yǎng)的MSC的成活率。對于全部的生物反應(yīng)器測試， 收獲細(xì)胞的成活率在90%以上。圖16顯示了從本發(fā)明的生物反應(yīng)器中收獲的細(xì)胞的表型。MSC是由未處理的骨髓培養(yǎng)而來。正如能夠看出的那樣，在充水的VTK生物反應(yīng)器(75kGy)中擴(kuò)增的細(xì)胞對于 ⑶45和HLA-DR表現(xiàn)出比較高的值。從其它全部的生物反應(yīng)器中收獲的細(xì)胞表現(xiàn)出與⑶34， CD45, CD73, CD90, CD105和HLA-DR有關(guān)的期望得到的MSC表型。圖17顯示了在第一(10天)和第二(11天)生長階段后，預(yù)先選擇的MSC在不同類型的膜上生長的MSC數(shù)目相對于在標(biāo)準(zhǔn)的TCPS上生長的MSC數(shù)目，以]形式計。結(jié)果表明了伽馬射線的劑量對于膜上的細(xì)胞增殖性質(zhì)的影響。水平線表示TCPS水平。發(fā)明詳述本發(fā)明的目標(biāo)之一是一種聚合物膜，其在干的或濕的狀態(tài)下，在氧的存在下受到貝塔-或伽馬-射線或電子束以從12. 5到175kGy劑量的輻照。該膜在輻照過程中可以被空氣包圍，其中在輻照過程中存在的氧氣的濃度從4到100vol. %，例如5到30vol. %，或 15到25vol. %，或者被水或含有少量添加劑的水溶液包圍。該聚合物膜包括疏水或親水聚合物或二者兼有。在一種具體實(shí)施方式
中，該膜包括至少一種親水聚合物和至少一種疏水聚合物的共混體。在另一種具體實(shí)施方式
中，該膜包括親水共聚物。在另一種具體實(shí)施方式
中，該膜包括親水共聚物和疏水聚合物。在另一種具體實(shí)施方式
中，該膜包括親水均聚物。在更進(jìn)一步的具體實(shí)施方式
中，該膜包括親水均聚物和疏水聚合物。在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式
中，用于制備該膜的聚合物溶液中包括的疏水和親水聚合物在數(shù)量上如下疏水聚合物在聚合物溶液中的份額在5到20%重量百分比，而親水聚合物的份額在2到13%重量百分比。在一種特定的具體實(shí)施方式
中，該膜包括一種第一疏水聚合物組分，第二親水聚合物組分，和可選地，一種第三疏水聚合物組分。所述的第一疏水聚合物優(yōu)選地選自聚酰胺(PA)，聚芳酰胺(PAA)，聚(芳基)醚砜 (PAES)，聚醚砜(PES)，聚砜(PSU)，聚芳砜(PASU)，聚碳酸酯(PC)，聚醚，聚氨酯(PUR)，聚醚聚氨酯及所述聚合物的共聚物。所述的第二親水聚合物優(yōu)選地選自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)， 聚乙烯醇(PEG)，聚乙二醇單酯，水溶性纖維素衍生物，聚山梨醇酯和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。所述的第三疏水聚合物優(yōu)選地選自聚酰胺(PA)，聚芳酰胺(PAA)，聚(芳基)醚砜 (PAES)，聚醚砜(PES)，聚砜(PSU)，聚芳砜(PASU)，聚碳酸酯(PC)，聚醚，聚氨酯(PUR)，聚醚聚氨酯及所述聚合物的共聚物。該膜可以制備成平板膜或中空纖維膜的形式。在本發(fā)明的一個方面，該膜可以用于細(xì)胞的附著或粘附，細(xì)胞的生長和細(xì)胞的擴(kuò)增或儲存，而不需要預(yù)處理或用EMC預(yù)涂覆該膜。使用不帶有任何類似EMC的膜用于細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)在于，例如，因節(jié)省時間和工藝步驟帶來的成本降低，顯著降低的伴隨EMC帶來污染或涂覆膜所需的更多的方法步驟帶來的風(fēng)險(GMP符合性)以及值得關(guān)注的用于細(xì)胞生產(chǎn)的更好的限定材料和記錄。當(dāng)然也可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的一種或更多的EMC來額外預(yù)處理或預(yù)涂覆本發(fā)明的膜。尤其對于不打算將擴(kuò)增或生長的細(xì)胞或組織再植回宿主體內(nèi)的用途時，這些預(yù)處理可能會進(jìn)一步改善膜在粘附或增殖方面的性能。但是，總是優(yōu)選使用本發(fā)明的不帶有任何EMC涂層的膜。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，可以通過制備本發(fā)明的中空纖維膜并在連續(xù)的培養(yǎng)方法中使用所述中空纖維膜或其膜束作為盤式培養(yǎng)技術(shù)的替代來顯著地改善細(xì)胞培養(yǎng)的性能。除了連續(xù)的方法外，該中空纖維膜可以用于靜態(tài)或半連續(xù)方法中。本發(fā)明的膜能夠以將特定的粘附性能賦予到膜的整體的方式制備，即，在用于連續(xù)應(yīng)用的中空纖維膜時，賦予到該中空纖維膜的外部和內(nèi)部。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，該膜還提供了一個用于兩種或多種不同細(xì)胞類型的細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面在于，該膜極好地促進(jìn)了在分化和完整性方面的最優(yōu)細(xì)胞單層的形成，而無需使用任何EMC預(yù)涂覆該膜的表面。本發(fā)明的膜提供了典型細(xì)胞形態(tài)的保留，易于形成單層，并且能夠產(chǎn)生緊密的連接。在本發(fā)明中，單層是指在一個細(xì)胞層中，沒有細(xì)胞在另一個細(xì)胞頂部生長，而是全部的細(xì)胞并肩生長并且在很多時候在同一個生長表面上互相接觸，即便這并非該膜的全部潛在用途所必需的。由此本發(fā)明的膜可以有利地用于，例如，(a)組織培養(yǎng)技術(shù)，即，用于生物人工植入體的建立，例如生物人工腎臟或肝臟 (也參見 Atala Q006))；(b)用于培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，例如，通常的MSC，平滑肌細(xì)胞，皮膚細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞，或懸浮細(xì)胞，例如造血干細(xì)胞，臍帶血細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞等，通過細(xì)胞注射用于醫(yī)學(xué)治療，這需要在再植入回宿主體內(nèi)之前進(jìn)行體外增殖；(c)用于擴(kuò)增和提供細(xì)胞用作生物產(chǎn)品例如生長因子，蛋白重組體，細(xì)胞因子或例如單克隆抗體的抗體的生產(chǎn)者；(d)用于準(zhǔn)備貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，優(yōu)選是細(xì)胞單層的培養(yǎng)，用于研究特定的細(xì)胞類型或用于研究任何藥物對細(xì)胞的影響(篩選程序)，例如抗癌劑，抗真菌，抗生素，抗病毒(包括抗體-HIV)和抗寄生蟲藥物；(e)或其它任何基于或需要在活體外系統(tǒng)中擴(kuò)增培養(yǎng)或存儲貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的應(yīng)用。本發(fā)明的膜能夠根據(jù)任何潛在的用途需要而具有適用的幾何形狀，S卩，其可以是平板，中空纖維或中空纖維束，或是制成能夠形成腔室的形狀或所需的其它形狀。用于細(xì)胞擴(kuò)增的核心單元優(yōu)選地是一個中空纖維基的膜系統(tǒng)，其允許充分的A和ω2的交換，營養(yǎng)物的供應(yīng)和廢物的去除。膜的表面設(shè)計成通過特定的表面特性能夠使得具有所需性質(zhì)的細(xì)胞的粘附和增殖。在中空纖維內(nèi)部進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是基于優(yōu)越的表面積與體積比，其與傳統(tǒng)的燒瓶或多層細(xì)胞培養(yǎng)器培養(yǎng)方法相比，能夠得到在培養(yǎng)過程中介質(zhì)消耗的最小化， 需要空間的最小化和勞力的最小化。中空纖維結(jié)構(gòu)的另一個優(yōu)點(diǎn)是統(tǒng)一控制的流路。本發(fā)明的膜可以用于各種不同的細(xì)胞擴(kuò)增或細(xì)胞培養(yǎng)裝置或系統(tǒng)，例如在 US2003/0203478A1, US6, 150，164 或 US6, 942879 中所描述的那樣。通常而言，本發(fā)明的膜可以有利地用于培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。在本發(fā)明中，貼壁細(xì)胞被定義為附著到基質(zhì)上進(jìn)行維持、擴(kuò)增、分化和儲存等的細(xì)胞。本發(fā)明的膜將被用于培養(yǎng)例如干細(xì)胞，包括胚胎和成人干細(xì)胞，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞，肝細(xì)胞， 內(nèi)皮細(xì)胞，肌細(xì)胞，軟骨細(xì)胞等。在本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明的膜由包括疏水和親水聚合物的聚合物的混合物制成，用于制備該膜的聚合物溶液中的疏水聚合物的份額為從5-20%重量百分比，并且親水聚合物的份額為從2-13%重量百分比。所述至少一種疏水聚合物優(yōu)選地選自聚酰胺 (PA)，聚芳酰胺(PAA)，聚(芳基)醚砜(PAEQ，聚醚砜(PEQ，聚砜(PSU)，聚芳砜(PASU)，聚碳酸酯(PC)，聚醚，聚氨酯(PUR)，聚醚聚氨酯及所述聚合物的共聚物，優(yōu)選聚醚硯或聚(芳基)醚砜與聚酰胺組成的混合物。所述至少一種親水聚合物優(yōu)選地選自聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)，聚乙烯醇(PEG)，聚乙二醇單酯，水溶性纖維素衍生物，聚山梨醇酯和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，優(yōu)選聚乙烯吡咯烷酮。在本發(fā)明中優(yōu)選使用的膜包括，在制備該膜的聚合物溶液中，從11到19wt. %的第一聚合物，其選自聚砜(PS)，聚醚砜(PEQ和聚(芳基)醚砜(PAES)，從0.5到13wt. % 的第二聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，從Owt. %到5wt. %的，優(yōu)選從O.OOlwt. %到 5wt. %的一種聚酰胺(PA)，從Owt. %到7襯.％的水和補(bǔ)足100% wt.余量的一種溶劑， 其選自N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，這是作為優(yōu)選地，N-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)，N-辛基-2-吡咯烷酮(NOP)，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亞砜(DMSO)和伽馬-丁內(nèi)酯(GBL)。優(yōu)選地，該聚合物溶液中的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是由至少兩種聚乙烯吡咯烷酮的均聚物混合而成，其中一種聚乙烯吡咯烷酮均聚物(=低分子量PVP)具有的平均相對分子量從約 10，000g/mol 到 100，000g/mol,優(yōu)選約 30，000g/mol 到 70，000g/mol,而另一種聚乙烯吡咯烷酮均聚物(=高分子量PVP)具有的平均相對分子量從約500，000g/mol 到 2，000, 000g/mol，優(yōu)選約 800，000g/mol 到 2，000, 000g/molo 類似這樣的 PVP 均聚物的例子是PVP K85，一種分子量為約825，OOODa的高分子量PVP，和PVP K30, 一種分子量為約 66，SOODa的低分子量PVP。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，用于制備膜的聚合物溶液包括從0. 5到5wt. %的高分子量PVP和從1到8wt. %的低分子量PVP。用于制備這樣的膜的方法詳細(xì)地記載在例如，US-A 4，935，141，US-A 5，891，338 和EP 1 578 521 Al中，其全文在此引作參考。能夠按照本發(fā)明的方法有效處理的類似的膜的例子是目前已被用于商業(yè)產(chǎn)品的Gambro Polyflux膜(聚芳基醚砜/PVP/聚酰胺)，例如Polyflux L和H系列；Arylane膜(聚(芳基)醚砜/PVP)；或DIAPES或PUREMA膜(聚 (芳基)醚砜/PVP)或其它的基于親水和疏水聚合物的共混物，例如包括PVP與PES或聚砜的商業(yè)滲析膜。在本發(fā)明的第二個方面，用于制備本發(fā)明的膜的聚合物溶液包括從12到15wt. % 的作為疏水聚合物的聚醚砜或聚砜和從5到IOwt. %的PVP，其中所述的PVP由低分子量和高分子量的PVP組分組成。在紡絲溶液中含有的PVP總量由從22到%的，優(yōu)選從25 到30wt. %的高分子量(> IOOkDa)組分和從66到78wt. %的，優(yōu)選從70到75wt. %的低分子量IOOkDa)組分組成。高分子量和低分子量的PVP的例子分別是PVP K85/K90和 PVP K30。用于本發(fā)明的方法中的聚合物溶液優(yōu)選地還進(jìn)一步包括從66到86wt. %的溶劑和從1到5wt. %的適當(dāng)?shù)奶砑觿?。適當(dāng)?shù)奶砑觿├缢?，甘油，?或其它的醇類。尤其優(yōu)選水，而且在使用時，紡絲溶液中的含水量為從1到8wt. %，優(yōu)選從2到5wt. %。在本發(fā)明的方法中使用的溶劑優(yōu)選選自N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，二甲基乙酰胺(DMAC)，二甲亞砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)，丁內(nèi)酯和所述溶劑的混合物。NMP是尤其優(yōu)選的。用于制備膜的中心流體或鉆孔流體(bore liquid)包括至少一種上面提到的溶劑和一種選自水， 甘油和其它醇類的沉淀介質(zhì)。最優(yōu)選地，該中心流體由從45到70wt. %的沉淀介質(zhì)和從30 到55wt. %的溶劑組成。優(yōu)選地，該中心流體由從51到57wt. %的水和從43到49wt. %的 NMP組成。制備這樣的膜的方法已經(jīng)在歐洲專利申請?zhí)朜O. 08008229中被詳細(xì)地公開，在此全文引作參考。能夠按照本發(fā)明的方法有效處理的此類膜的例子是例如Gambro Revaclear 膜及其衍生物。還可能用于本發(fā)明的膜通常是已被用于商業(yè)產(chǎn)品的，例如Fresenius FX-類的膜(Helixone膜)或Optiflux類型的膜或其它的基于親水和疏水聚合物的共混物，例如包括PVP與PES或聚砜的商業(yè)滲析膜。在本發(fā)明的第三個方面，用于制備本發(fā)明的膜的聚合物溶液包括從11到19wt. % 的第一聚合物，其選自聚砜(PS)，聚醚砜(PES)和聚(芳基)醚砜(PAES)，從0.5到13wt. % 的第二聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，從0.00Iwt. %到20wt. %的聚氨酯(PU)，從 Owt. %到7wt. %的水，和一種選自N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，N-乙基-2-吡咯烷酮 (NEP)，N-辛基-2-吡咯烷酮(NOP)，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亞砜(DMSO) 和伽馬-丁內(nèi)酯(GBL)的溶劑補(bǔ)足100% wt.。所述的第一聚合物在聚合物溶液中的含量優(yōu)選從13到14% wt.，尤其優(yōu)選從13. 6到14% wt.。聚醚砜(PES)和聚(芳基)醚砜(PAES) 優(yōu)選用于制備本發(fā)明的膜。優(yōu)選地，在聚合物溶液中的PVP由至少兩種聚乙烯吡咯烷酮均聚物的共混物組成，其中一種聚乙烯吡咯烷酮均聚物(=低分子量PVP)具有的平均分子量從約 10，000g/mol 到 100，000g/mol，優(yōu)選約 30，000g/mol 到 70，000g/mol，而另一種聚乙烯吡咯烷酮均聚物(=高分子量PVP)具有的平均分子量從約500，000g/mol到2，000, OOOg/mol，優(yōu)選約800，000g/mol到2，000, 000g/molo類似這樣的PVP均聚物的例子是PVP K85, 一種分子量為約825，OOODa的高分子量PVP，和PVP K30，一種分子量為約66，800Da的低分子量PVP。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，用于制備膜的聚合物溶液包括從0. 5到 5wt. %的高分子量PVP和從1到8wt. %的低分子量PVP。紡絲溶液中的含水量優(yōu)選從1到 5wt. %，更優(yōu)選約3wt. %。各種的溶劑可以用于制備本發(fā)明的膜，例如N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，N-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)，N-辛基-2-吡咯烷酮(NOP)，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亞砜(DMSO)或伽馬-丁內(nèi)酯(GBL)及其混合物。溶劑的量是用來補(bǔ)足聚合物溶液到IOOwt. %。聚合物溶液中的溶劑的含量優(yōu)選從60到80wt. %，更優(yōu)選從67 到 76. 4wt. %。本發(fā)明的膜可以制備成，例如平板或中空纖維的形狀。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的膜具有非對稱結(jié)構(gòu)。當(dāng)呈現(xiàn)中空纖維的情況下， 纖維的內(nèi)側(cè)是一個薄的分離層。本發(fā)明的膜的結(jié)構(gòu)或形態(tài)也可以變化而不會對其在細(xì)胞粘附和增殖方面產(chǎn)生顯著影響。該膜可以具有，例如3層結(jié)構(gòu)或類似海綿結(jié)構(gòu)或類似泡沫結(jié)構(gòu)。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的膜的進(jìn)一步的特征在于細(xì)胞粘附側(cè)的光滑性或低粗糙度。在一種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的膜的液體透過性可以從約0. 1 IO-4Cm3到200 10_4cm3/(cm2 bar sec)變化，例如從 0· 1 l(T4cm3 到 10 l(T4cm7(cm2 bar sec)，或者甚至從0.1 10_4cm3到5 IO-4Cm3/(cm2 bar sec)。為了得到這樣的液體透過性而不會使膜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生缺陷，聚合物溶液在用于中空纖維制造時的粘度范圍通常從2，500厘泊(cP)到 200，OOOcP，或者甚至從10，900cP到25，600cP。對于平板膜生產(chǎn)，粘度范圍通常從2，500cP 到 500，OOOcP,或者甚至從 4，500cP 到 415，000cPo為了制備本發(fā)明的膜，在恒溫恒壓下將聚合物溶解在溶劑中。在真空(約 IOOmbar)干燥箱中將該聚合物溶液脫氣。聚合物溶液的溫度可以在一個相對較寬的范圍內(nèi)變化。較有利地是從室溫到60°C的范圍內(nèi)選擇該溫度。為了制備平板膜，通過使用特定的刮刀，將最后的聚合物溶液以均勻的膜的形式澆鑄在一個光滑表面上，例如玻璃載片(作為支撐區(qū)域)上；聚合物膜的澆鑄速度可以在一個相對較寬的范圍內(nèi)變化。速度在10和20mm/s之間是適宜的。在一個示范性的試驗室規(guī)模方法中，該聚合物溶液首先通過一個注射器穩(wěn)定地施加到玻璃載片上。重要的是該過程沒有氣泡產(chǎn)生。具有限定間隙高度的刮刀以恒速驅(qū)動，制出均勻的聚合物膜。為實(shí)現(xiàn)良好的厚度分布，建議刮刀具有均勻的間隙。在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式
中，沉淀浴中包括的含量從30到IOOwt. %，優(yōu)選從 56到66wt. %的水，和一種溶劑，例如NMP，其含量從0到70wt. %，優(yōu)選從34到Mwt. %。 沉淀浴的溫度可以在一個相對較寬的范圍內(nèi)變化。較有利地是使用在0°C和80°C之間，或是30 0C和50 0C之間的溫度。沉淀時間也可以變化。例如，沉淀時間可以是5分鐘。該沉淀浴優(yōu)選由水和一種溶劑組成。該浴優(yōu)選包括含量從30到IOOwt. %的水和含量從70到 Owt. %的選自N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，N-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)，N-辛基-2-吡咯烷酮(Ν0Ρ)，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亞砜(DMSO)或伽馬-丁內(nèi)酯(GBL)及其混合物的一種溶劑。在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式
中，沉淀浴包括含量從56到66wt. % 的水和含量從；34到Mwt. %的溶劑。NMP是本發(fā)明的一種尤其適用的溶劑。
沉淀后的膜然后在無溶劑的條件下存儲直到切割。在切割后，該膜被洗滌，干燥和消毒。本發(fā)明的平板膜的厚度可以在15 μ m和200 μ m之間變化。35 μ m和50 μ m之間的
厚度可能會特別有利于大部分用途。本發(fā)明的膜還可以制備成中空纖維的形態(tài)。在制備這樣的中空纖維膜時，溶液被泵送通過一個紡絲模具并形成液體的中空纖維。中心的溶劑濃縮導(dǎo)致了膜內(nèi)側(cè)的開放式結(jié)構(gòu)。最小的孔直接位于膜的內(nèi)側(cè)。在使用時，內(nèi)側(cè)的選擇層直接接觸細(xì)胞介質(zhì)。在一種具體實(shí)施方式
中，沉淀浴由水組成。沉淀浴的溫度可以在較寬的范圍內(nèi)變化，但是在該方法中有利地使用了高達(dá)約40°C的環(huán)境溫度。模具和沉淀浴之間的距離范圍從0到100cm，例如從50到100cm。該模具(紡絲頭)的溫度也可以變化?？梢允褂?0和 80°C之間的溫度。有利地是使用在40和55°C之間的溫度。紡絲速度可以選自從5到80m/ min，例如從11到40m/min的范圍。本發(fā)明的中空纖維膜的尺寸變化取決于膜的潛在應(yīng)用。內(nèi)徑通常在從50到 2，000 μ m的范圍。在許多應(yīng)用中，內(nèi)徑從100到950 μ m是有利的。壁厚通常從25到55 μ m 的范圍內(nèi)。本發(fā)明的膜得到的Lp在從0. 1 IO-4Cm3到200 10_4cm7(cm2 bar s)的范圍內(nèi)，例如從 0.1 l(r4cm3 到 10 10"4cm3/(cm2 bar s)，或者甚至從 0. 1 1 (T4cm3 到 5 l(T4cm7(cm2 bar s)。在本發(fā)明的另一種具體實(shí)施方式
中，膜的Lp在從2 10_4cm3到18 10_4cm7(cm2 bar s) 的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一種具體實(shí)施方式
中，膜的Lp在從5 IO-4Cm3到15 l(T4Cm7(Cm2 bar s)的范圍內(nèi)，也就是說，用于細(xì)胞培養(yǎng)的膜也可以是所謂的低流通膜?？梢酝ㄟ^兩種方式來制備本發(fā)明的膜，被稱為“濕”和“干”的膜。當(dāng)制備“濕”膜時，膜在制備后必須在管或爐中分別干燥。為此，纖維束(例如30-15，000根纖維)被放置在塑料或金屬容器中。熱空氣通過該容器并干燥該膜。第二種方法是所謂的“在線干燥”， 其是一種在紡絲機(jī)上直接制備干燥的中空纖維的有效方法。這兩種程序都可以獲得能夠按照本發(fā)明加以處理和使用的膜。按照本發(fā)明，通過用空氣或水或含有適宜的添加劑的水溶液覆蓋前述的膜來對其加以處理，這樣的添加劑例如丙烯酸，烯丙胺或丙烯酰胺，其濃度從0. 00001到5wt. %，例如從0. 0001到0. Olwt. %，并且在氧的存在下經(jīng)受伽馬，貝塔或電子束的輻照。為使膜達(dá)到能夠用作細(xì)胞培養(yǎng)的目的，可以將膜放置在輻照室內(nèi)經(jīng)受伽馬，貝塔或電子束的輻照，尤其是伽馬-射線的輻照，使用的輻照劑量從12. 5到175kGy，優(yōu)選劑量從 70到175kGy。在本發(fā)明的另一個方面，使用的劑量從25到125kGy。在本發(fā)明的另一個方面，使用的劑量從50到175kGy。在本發(fā)明的另一個方面，使用的劑量從50到125kGy。在本發(fā)明的另一個方面，使用的劑量從70到lOOkGy。伽馬-射線輻照可以使用例如一個Co-60源進(jìn)行。電子束輻照可以使用一個電子束加速器進(jìn)行。貝塔-射線輻照可以使用一個貝塔輻照源，例如Sr-90或Ru-106進(jìn)行。在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式
中，膜在干的條件下經(jīng)受輻照，即膜被空氣覆蓋或包圍。本發(fā)明中的“干”的表達(dá)形式并不排除膜多孔結(jié)構(gòu)中的水的存在，即其意欲包括的范圍從完全沒有水到膜壁的整個多孔結(jié)構(gòu)中充滿了水的情況。與已知的用伽馬-射線輻照膜以使膜消毒或使膜中的特定的組分例如PVP產(chǎn)生交聯(lián)相對照，輻照過程中氧的存在對于獲得適用于細(xì)胞培養(yǎng)目的的膜來說是很關(guān)鍵的。在本發(fā)明的一個方面，輻照過程中環(huán)繞的空氣可以是未修飾的空氣，大致含有(按摩爾含量/體積)78. 08 %的氮?dú)猓?0. 95 %的氧氣，0. 93 %的氬，0. 038 %的二氧化碳，痕量的其它氣體，和可變量的水蒸氣。在本發(fā)明的另一個方面，環(huán)繞的空氣中的含氧量可以增加，例如通過將附加的氧氣導(dǎo)入系統(tǒng)。氧濃度可以增加達(dá)到約100%的限值，例如高達(dá)30%。在本發(fā)明的另一個方面，氧濃度可以降低到約4%的限值。從4%到100%的氧濃度，例如從4%到30% (按摩爾含量/體積)，可通常用于獲得所需的結(jié)果。使用從5%到25%，或者甚至從15% 到22%的氧濃度是有利的。在本發(fā)明的另一種具體實(shí)施方式
中，膜在濕的狀態(tài)下，或者，換句話說，在含水條件下經(jīng)受輻照。本發(fā)明中的“濕”和“含水條件”的表達(dá)形式是指在輻照過程中水的存在， 即膜可以被水覆蓋或浸沒在水中。在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式
中，使用的是RO水。在本發(fā)明的另一種具體實(shí)施方式
中，添加劑可以與少量的水混合。這樣的添加劑通過將官能團(tuán)導(dǎo)入膜的表面來用于改善普通或特定類型細(xì)胞培養(yǎng)的輻照膜的性能。這樣的添加劑的例子是含有具有氨基酸，羧基或羧胺官能團(tuán)的單體的乙烯基基團(tuán)，例如丙烯酸，烯丙胺或丙烯酰胺。在一種特定的具體實(shí)施方式
中，使用丙烯酸。在另一種特定的具體實(shí)施方式
中，使用烯丙胺。添加劑在水溶液中的濃度可以從0. 00001到5wt. %。使用從0. 0001 到Iwt. %，或從0. 0001到0. Iwt. %的濃度是有利的。低濃度的添加劑，例如從0. 0001到 0. Olwt. %被證明是尤其有效的。在濕的狀態(tài)下使用更高的輻照劑量對于膜的輻照來說是有利的，例如從70到 175kGy的劑量。到達(dá)選定劑量所需的時間可以在相對較寬的范圍內(nèi)變化。例如，使用Co-60源時， 對于25kGy的劑量需要約6到7小時，對于75kGy的劑量需要約17到20小時，即輻照時間為3倍。需要的時間取決于源及其在輻照時的強(qiáng)度和根據(jù)需求調(diào)整。溫度也可以在更寬的范圍內(nèi)變化并且也取決于膜的殼體的材料，S卩，該殼體是否由金屬或合成材料制成。一般來說，該溫度在從0°c到41°C的范圍內(nèi)。在多數(shù)情況下，使用室溫是較方便的。在本發(fā)明的另一種具體實(shí)施方式
中，在被輻照之前，膜要經(jīng)過干燥，優(yōu)選在線干燥，隨后蒸汽消毒，以保持所需的低流量特性。如果在制備過程中需要或是有必要，會增加一個進(jìn)一步的肚0(環(huán)氧乙烷)消毒而不會對本發(fā)明的膜在細(xì)胞培養(yǎng)方面應(yīng)用的效力產(chǎn)生任何負(fù)面的影響。蒸汽消毒或肚0消毒膜的方法是本領(lǐng)域所熟知的。被輻照后的膜直接用于各種不同類型細(xì)胞，尤其是貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。本發(fā)明的膜表現(xiàn)出的生長特性基本相似于或優(yōu)于組織培養(yǎng)聚苯乙烯(TCPQ板，后者代表了當(dāng)今使用培養(yǎng)瓶或多層細(xì)胞培養(yǎng)器進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的膜細(xì)胞顯示了擴(kuò)增率，細(xì)胞在膜上的再貼附效率，和包括形態(tài)控制在內(nèi)的擴(kuò)增后細(xì)胞的特性方面類似于或更優(yōu)于組織培養(yǎng)聚苯乙烯(TCPS)，正如使用間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞進(jìn)行的測試所表現(xiàn)出的那樣。本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面是包括本發(fā)明的膜的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。可以通過改進(jìn)用來包含本發(fā)明的膜的細(xì)胞擴(kuò)增或細(xì)胞培養(yǎng)的裝置或系統(tǒng)的例子已被US2003/0203478 Al， US-A 6，150，164，或US-A 6，942，879公開，在此全文引作參考。該裝置可以包括本發(fā)明的平板膜的疊層或本發(fā)明的中空纖維膜的膜束。在該裝置的一種具體實(shí)施方式
中，膜在裝置的兩個流體室之間形成一個界面。該裝置在結(jié)構(gòu)上類似于商業(yè)上可以得到的用于例如血液透析或血濾的過濾裝置。示范性的裝置包括被安裝在封套中的一個半透膜分隔開的兩個室，第一內(nèi)室設(shè)置有兩個接口，而第二外室包括一個或兩個接口，這兩個室都還被一個封裝(potting)部件分隔，該封裝部件是基于適當(dāng)?shù)恼辰Y(jié)化合物，意欲形成，(i) 一個圓柱形分隔將包括如上文中定義的中空纖維膜束類型的半透膜的所述裝置分成兩個室或是(ii)在包括如上文中定義的平板膜束類型的半透膜的所述裝置中的一個緊密的密封。另一個示范性的裝置，具有包含在一個外殼中的多個中空纖維膜，并且配置成將中空纖維膜外部空間(即，外毛細(xì)管室)的流體與穿透到中空纖維膜中的流體及其對應(yīng)的開孔分離開來。此外，該裝置包括在外殼內(nèi)位于裝置相對的端部的兩個集管端室。中空纖維兩端開口的每一個都連接到不同的端室。端室和毛細(xì)管外室被中空纖維的半透膜分隔開來。外毛細(xì)管室內(nèi)的組成在一定程度上是可以通過中空纖維膜的分子量截止，或孔徑加以控制的。在該裝置的一種操作方式中，細(xì)胞在外毛細(xì)管室內(nèi)生長而營養(yǎng)介質(zhì)穿透中空纖維膜。介質(zhì)可以穿透外毛細(xì)管或內(nèi)毛細(xì)管室。在該裝置的另一種操作方式中，細(xì)胞在中空纖維的內(nèi)毛細(xì)管空間(即，管腔)內(nèi)生長，而營養(yǎng)介質(zhì)穿透外毛細(xì)管和/或內(nèi)毛細(xì)管室。中空纖維的半透過特性使得營養(yǎng)，氣體和細(xì)胞廢物穿透中空纖維壁而阻止細(xì)胞透過。管-殼型生物反應(yīng)器提供了數(shù)個優(yōu)點(diǎn)。對于貼壁細(xì)胞而言，數(shù)個中空纖維的使用在一個相對較小的體積內(nèi)提供了細(xì)胞能夠生長的大量表面。該大量表面區(qū)域也為營養(yǎng)介質(zhì)局部分配到生長的細(xì)胞上提供了便利并且易于收集細(xì)胞廢物。管-殼型生物反應(yīng)器使得細(xì)胞的生長與其它細(xì)胞培養(yǎng)裝置相比能夠具有盡可能更高的密度。其可以支撐的細(xì)胞密度大于每毫升IO8個細(xì)胞，而其它細(xì)胞培養(yǎng)裝置通常限制在每毫升約IO6個細(xì)胞的密度。本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面提供了一種用于體液的體外處理的裝置，其包括細(xì)胞和本發(fā)明的膜。在一種具體實(shí)施方式
中，該細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，其在膜表面，例如在本發(fā)明的中空纖維膜的管腔表面或在本發(fā)明的中空纖維膜的外表面上形成一個融合的層。在其余的部分，該裝置的設(shè)計與上文中所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的設(shè)計相類似。待處理的體液被導(dǎo)入該裝置的流體空間，在此穿過細(xì)胞層，使得細(xì)胞提取體液中的組分，代謝體液中的組分，或分離組分進(jìn)入體液。
實(shí)施例一般來說，本發(fā)明的膜的適用性和效率的評估是基于以下原則特征細(xì)胞擴(kuò)增率，細(xì)胞在膜上的再貼附效率，和包括形態(tài)控制的擴(kuò)增后細(xì)胞的特性。使用間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)，成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞進(jìn)行測試以證明本發(fā)明的膜適用于培養(yǎng)不同類型的貼壁細(xì)胞。選擇MSC用來對本發(fā)明的膜用作細(xì)胞培養(yǎng)的性能的深入分析。方法手束(hand bundle)，小型模塊，過濾器和平板插件的制備(A)手束紡絲工藝后膜束的制備對于以充分的方式為后續(xù)的性能測試制備纖維束來說是必要的。第一個方法步驟是將纖維束切割成規(guī)定的23cm的長度。接下來的方法步驟包括熔化纖維的末端。一個光學(xué)控制確保全部的纖維都被很好地熔化。然后，纖維束的末端被裝入一個封裝帽中。該封裝帽被機(jī)械地固定并且一個封裝管被套在封裝帽上。之后，使用聚氨酯進(jìn)行封裝。在封裝后必須確保聚氨酯硬化至少一天。在接下來的方法步驟中，封裝的膜束被切割到指定的長度，并且打開了纖維的端部。最后的方法步驟包括纖維管束的光學(xué)控制。在這一步驟過程中，需控制以下點(diǎn)(i)切割質(zhì)量(切口是否光滑或是否有任何刀傷)，( )封裝質(zhì)量(是否在紡絲工藝中開口的纖維數(shù)目通過被封裝的纖維減少或是否有可見的因缺乏聚氨酯導(dǎo)致的空隙)。在該光學(xué)控制后，膜束在用于不同的性能測試之前被干燥儲存。(B)小型模塊的制備小型模塊(=殼體中的纖維束)是通過相關(guān)的方法步驟制備的。需要小型模塊以確保纖維的保護(hù)和非常清潔的生產(chǎn)。小型模塊的生產(chǎn)存在以下幾點(diǎn)不同(i)纖維束切割成20cm的規(guī)定長度；(ii)纖維束在融化方法之前被傳送到殼體中；(iii)小型模塊在封裝方法之前被放入真空干燥箱中過夜。(C)過濾器的制備該過濾器包括約8，000到15，000根纖維，有效表面積為0. 9到1. 7m2。過濾器的特征在于圓筒狀殼體上帶有用于供應(yīng)培養(yǎng)介質(zhì)流體的兩個接頭和位于兩側(cè)的封帽，每個封帽都帶有一個中心接頭。制造方法(卷繞后)可以劃分成以下主要步驟(i)通過專用的束卡將切割(約30cm的長度)后的膜束轉(zhuǎn)移到殼體中；(ii)膜束的兩端通過封閉步驟被封閉；(iii)使用聚氨酯(PUR)將纖維封裝到殼體中；(iv)將端部切下以打開纖維，其中要求光滑的表面；(ν)端部通過目視檢查封閉的纖維或PUR封堵的缺陷；(vi)將帽蓋膠合到接頭上；(vii)最終處理清洗，整體測試，最終干燥；(viii)包裝到專用的袋中用于進(jìn)一步的步驟(例如，輻照)。(D)平板插件的制備將平板膜在玻璃板上固定。對插件起到膠水功能的聚氨酯被均勻地分布在板上。 將該插件輕柔地浸入到聚氨酯中并立即粘結(jié)到各自的膜上。用玻璃和鋼板承重該插件并干燥16到18小時。平板膜插件被切割出來并焊到消毒袋內(nèi)。最后，插件在壓力釜中在121°C消毒。手束和小型模塊的液體透過性(Lp)膜束的液體透過性的測量是通過在壓力下擠壓具有確定的體積的水通過一端封閉的膜束，并測量所需的時間來進(jìn)行的。液體透過性可以通過確定的時間，膜的有效表面積，施加的壓力和擠壓通過膜的水的體積來計算。根據(jù)纖維數(shù)量，纖維長度以及纖維的內(nèi)徑，能夠計算有效的膜的表面積。膜束在進(jìn)行Lp測試前必須潤濕30分鐘。為此，將膜束放入含有500ml超純水的箱內(nèi)。30分鐘后，將膜束轉(zhuǎn)移至測試系統(tǒng)中。該測試系統(tǒng)包括37°C 的水浴和一個膜束能夠被機(jī)械實(shí)施的裝置。水浴的填充高度必須確保膜束在指定設(shè)備中位于水面以下。為避免膜泄漏導(dǎo)致錯誤的測試結(jié)果，事先要進(jìn)行膜束和即將運(yùn)行的測試系統(tǒng)的整體性測試。整體性測試的進(jìn)行是通過擠壓空氣通過一端封閉的膜束?？諝馀荼砻髂な驕y試系統(tǒng)的泄漏。應(yīng)當(dāng)檢查泄漏是否與膜束在測試系統(tǒng)中的錯誤實(shí)施有關(guān)或者是否有真正的膜泄漏存在。如果檢測到膜存在泄漏，則棄用該膜束。整體性測試所施加的壓力應(yīng)當(dāng)至少與液體透過性測試期間施加的壓力相同的數(shù)值，以確保由于施加的壓力過高，在液體透過性測試期間沒有泄漏發(fā)生。手束的擴(kuò)散透過性使用等滲壓氯化物溶液和在滲析液中稀釋的磷酸鹽(100mg/l) —起進(jìn)行擴(kuò)散試驗來測定膜的擴(kuò)散性質(zhì)。將手束放入測量室內(nèi)。測量室允許通過在中空纖維內(nèi)側(cè)的特定的溶液。此外，測量室完全地被水充滿，并且使用高的橫流蒸餾水來運(yùn)走特定的離子穿過膜的橫截面，從中空纖維的內(nèi)側(cè)到達(dá)外側(cè)。通過正確地調(diào)節(jié)壓力比，來達(dá)到零過濾，由此使得測量到的僅僅是膜的擴(kuò)散性質(zhì)(通過在中空纖維的內(nèi)側(cè)和中空纖維的周圍之間形成特定離子的最大的濃度梯度)而非擴(kuò)散和對流的結(jié)合。在開始時從庫中取得樣品并且在過10分鐘和20分鐘后取得滲余物的樣品。然后將該氯化物樣品用硝酸銀溶液滴定來測定氯化物濃度。磷酸鹽樣品通過光計量進(jìn)行分析。根據(jù)測得的濃度，有效的膜表面積A和流量條件， 氯化物或磷酸鹽各自的透過性P能夠按照下式( 來計算Px[10-4cm/s] = [QB/60/A] [ (Ca-Cd) /Ce] *104(2)其中P =擴(kuò)散透過性[cm/s]c =濃度[mmol]A=有效的膜面積[cm2]下標(biāo)χ =物質(zhì)(在此分別是氯化物或磷酸鹽)A=起始濃度(進(jìn)料)D=滲析液R=滲余物Qb =血流量[ml/min]水溶液中肌紅蛋白的篩析系數(shù)(手束)在肌紅蛋白和白蛋白的水溶液中進(jìn)行的篩析系數(shù)試驗是使用兩種帶有分開的溶液的不同的試驗設(shè)定進(jìn)行的。在第一測試中測定肌紅蛋白的篩析系數(shù)。溶解在PBS緩沖溶液中的肌紅蛋白的濃度是100mg/l。該水溶液的失效日期在4 到8周之間。該溶液必須儲存在冰箱中。在進(jìn)行篩析系數(shù)試驗之前，使用前面介紹過的方法進(jìn)行Lp測試。肌紅蛋白的篩析系數(shù)試驗進(jìn)行一次，其測試條件設(shè)定如下本征流率(Jv, cm/s)和壁剪切率(γ □ in s-1)保持固定，其中對血流(Qb)和過濾比(UF)進(jìn)行計算(參見式(4) + (5))Qb [ml/min] = γ *η* π *di3*60/32(4)UF [ml/min] = Jv*A*60(5)其中n=纖維數(shù)量di =纖維內(nèi)徑[cm]y =剪切率[siA=有效的膜面積[cm2]其中A是按照式(1)計算的
當(dāng)測試手束或小型模塊時，剪切率設(shè)定在δΟΟ Γ1，并且本征流率設(shè)定在 0. 381(T4cm/s。在15分鐘后取出第一個樣品(庫，滲余物，濾液)，在60分鐘后取第二個樣品。最后，用PBS緩沖液沖洗測試束數(shù)分鐘然后停止測試。實(shí)施例1平板膜的制備聚合物溶液的制備是在60°C下將聚醚砜(UltraSOn 6020，BASF)，聚乙烯吡咯烷酮(K30 和 K85，BASF)，聚氨酯(Desmopan 9665DU，Bayer MaterialScience AG)和蒸溜水溶解在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中直到獲得澄清的高粘度溶液。在聚合物紡絲溶液中的不同組分的重量份數(shù)，PES/PVP(K85)/PVP(K30)/9665DU/ Η20/ΝΜΡ為14/3/5Λ/3/73。得到的聚合物溶液的粘度為21，OOOmPa S。將該溶液過濾并脫氣。聚合物溶液的脫氣是在升高溫度(< 100°C )和降低壓力 (約IOOmbar)的干燥箱中進(jìn)行的。最后的聚合物溶液隨后使用專門的涂層刮刀在光滑表面 (玻璃載片)上澆鑄(自動地)成均勻的膜，所述光滑表面用作支撐面。首先，該聚合物溶液在烘箱中被加熱到60°C，然后使用注射器直接穩(wěn)定地施加到玻璃載片上。該具有設(shè)定間隙(ΙΟΟμπι)高度的涂層刮刀以12. 5mm/s的恒速驅(qū)動，由此制備均勻的聚合物膜。該帶有薄層聚合物膜的玻璃載片迅速浸入到凝固浴中。50°C的水/NMP的混合物被用作凝固浴，其中含有56wt. %的水和Mwt. %的NMP。膜的沉淀需要約5分鐘。隨后，將沉淀的膜取出，在無溶劑的條件下儲存直到一個系列的全部膜都已制備完，然后切割成規(guī)定的尺寸。在切割后，將膜用70°C的蒸餾水洗滌30分鐘。接下來的步驟是置于烘箱中在60°C下干燥過夜并最終包裝該膜于專用的袋中用于消毒。膜的厚度為35μπι。實(shí)施例2平板膜的制備聚合物溶液的制備是在60°C下將聚醚砜(UltraSOn 6020，BASF)，聚乙烯吡咯烷酮(K30和K90，BASF)和蒸餾水溶解在N-甲基_2_吡咯烷酮(NMP)中直到獲得澄清的高粘度溶液。在聚合物紡絲溶液中的不同組分的重量份數(shù)，PES/PVP (K90) /PVP (K30) /Η20/ΝΜΡ 為13. 6/2/5/3/76. 4。得到的聚合物溶液的粘度為5，900mPa s。膜的制備如實(shí)施例1中所述。膜的厚度為50 μ m。實(shí)施例3中空纖維膜的制備聚合物溶液的制備是將13. 5wt. %的聚醚砜，0. 5wt. %的聚酰胺，7. 5wt. %的PVP K30和78. 5%的NMP混合。59wt. %的水和41wt. %的NMP的混合物用作中心流體。聚合物溶液的粘度在22°C的溫度下測量為4，230mPa s。中心流體被加熱到55°C后泵送穿過一個雙組份中空纖維紡絲頭。聚合物溶液通過一個環(huán)形狹縫離開紡絲頭，該狹縫的外徑為0. 5mm且內(nèi)徑為0. 35mm。中心流體離開位于環(huán)形聚合物溶液管中心的紡絲頭以從內(nèi)側(cè)開始聚合物溶液的沉淀并且決定了該中空纖維的內(nèi)徑。兩種組份(聚合物溶液和中心流體)在同一時間進(jìn)入與室內(nèi)空氣分隔開的空間內(nèi)。該空間被稱為紡絲軸。蒸汽(100°C )和空氣(22°C )的混合物被注射入紡絲軸。通過蒸汽和空氣之比將紡絲軸內(nèi)的溫度調(diào)節(jié)到49°C且相對濕度為99. 5%，并且相對于水含量， 將溶劑含量調(diào)節(jié)到3. 9wt. % .。溶劑是NMP。紡絲軸的長度是890mm。借助于重力和電機(jī)驅(qū)動輥，中空纖維被由頂部抽到底部，由紡絲頭穿過紡絲軸沿垂直方向進(jìn)入水浴。紡絲速度為50m/min。該中空纖維隨后被引導(dǎo)穿過串聯(lián)多級水浴并且溫度由20增加到90°C的級聯(lián)。 離開沖洗水浴的濕的中空纖維膜在連續(xù)的在線干燥步驟中被干燥。在一個可選的形成紋理的步驟之后，中空纖維以絲束的形式被收集到一個紡絲輪上。按照本實(shí)施例制備的中空纖維的外表面每mm2具有62，500個孔，并且孔徑在0. 5到3 μ m的范圍內(nèi)。實(shí)施例4中空纖維膜的制備聚合物溶液的制備是將Hwt. %的聚醚砜，5wt. %的PVP K30，2wt. %的PVPK85/ K90, 3wt. %的水和76% wt.的NMP混合。55wt. %的水和45wt. %的NMP的混合物用作中心流體。聚合物溶液的粘度在22°C的溫度下測量為5，400mPa s。中心流體被加熱到55°C后泵送穿過一個雙組份中空纖維紡絲頭。聚合物溶液通過一個環(huán)形狹縫離開紡絲頭，該狹縫的外徑為0. 5mm且內(nèi)徑為0. 35mm。中心流體離開位于環(huán)形聚合物溶液管中心的紡絲頭以從內(nèi)側(cè)開始聚合物溶液的沉淀并且決定了該中空纖維的內(nèi)徑。兩種組份(聚合物溶液和中心流體)在同一時間進(jìn)入與室內(nèi)空氣分隔開的空間內(nèi)。 該空間被稱為紡絲軸。蒸汽(100°C )和空氣(22°C )的混合物被注射入紡絲軸。通過蒸汽和空氣之比將紡絲軸內(nèi)的溫度調(diào)節(jié)到45°C且相對濕度為99. 5%。紡絲軸的長度是890mm。 借助于重力和電機(jī)驅(qū)動輥，中空纖維被由頂部抽到底部，由紡絲頭穿過紡絲軸沿垂直方向進(jìn)入水浴。紡絲速度為50m/min。該中空纖維隨后被引導(dǎo)穿過串聯(lián)多級水浴并且溫度由15 增加到40°C的級聯(lián)。離開沖洗水浴的濕的中空纖維膜在連續(xù)的在線干燥步驟中被干燥。在一個可選的拉伸步驟之后，中空纖維以絲束的形式被收集到紡絲輪上?；蛘咭部梢孕纬墒质蠈?shí)施例5中空纖維膜的制備聚合物溶液的制備是在50°C下將聚醚砜(UltraSOn 6020，BASF)，聚乙烯吡咯烷酮(K30 和 K85，BASF)，聚氨酯(Desmopan PU 9665DU, Bayer MaterialScience AG)和蒸餾水溶解在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中直到獲得澄清的高粘度溶液。在聚合物紡絲溶液中的不同組分的重量份數(shù)，PES/PVP(K85)/PVP(K30)/9665DU/ Η20/ΝΜΡ為14/3/5Λ/3/73。得到的聚合物溶液的粘度為22，900mPa s。將該溫暖的溶液冷卻到20°C并脫氣。膜的形成是通過將溶液加熱至50°C后再將溶液通過一個紡絲模具。56wt. %的水和Mwt. %的NMP的水/NMP混合物用作鉆孔流體。 模具的溫度為50°C。在40m/min的紡絲速度下形成中空纖維膜。離開模具的液體細(xì)絲進(jìn)入具有環(huán)境溫度的水浴。模具與沉淀水浴之間的距離長度為100cm。形成的中空纖維膜被引導(dǎo)通過一系列的水浴。然后濕的中空纖維膜被干燥并且具有216 μ m的內(nèi)徑和318 μ m的外徑。該膜具有完全非對稱的膜結(jié)構(gòu)。膜的活性分離層處于內(nèi)側(cè)?；钚苑蛛x層被定義為具有最小孔的層。該結(jié)構(gòu)總體上表現(xiàn)出類似海綿的結(jié)構(gòu)。內(nèi)側(cè)表面呈現(xiàn)非常光滑的孔。該膜被卷繞輪卷繞并按照下述的方法制成具有200纖維的手束。接下來將測量該膜的液體透過性(Lp值)。該膜表現(xiàn)出3.7X10_4cm7(cm2 bar sec)的液體透過性。此外，還測量了肌紅蛋白(在水溶液中)的篩析系數(shù)。在15分鐘后得到的篩析系數(shù)為1.5%，而在60分鐘后得到的篩析系數(shù)為1.1%。隨后，再次測量膜的液體透過性(Lp值)，在37°C時為2.7X10_4cm7 (cm2 bar sec) 0而且，使用氯化物，菊粉和維生素B12對膜的擴(kuò)散透過性進(jìn)行試驗。在37°C 時對氯化物，菊粉和維生素B12的擴(kuò)散透過性分別為10. 5 X 10-4cm/sec, 3. 7X 10_4cm/sec和 4. 0Xl(T4cm/sec。實(shí)施例6輻照插件并準(zhǔn)備用于細(xì)胞培養(yǎng)在室溫下，將空氣覆蓋的膜(氧氣濃度沒有加或減少)在傳統(tǒng)的消毒袋中分別經(jīng)受6. 3和18. 9小時的伽馬輻照(分別為25和75kGy)。水或丙烯酸溶液覆蓋的膜插件在含有約70ml溶液的塑料容器中經(jīng)受伽馬輻照。為了洗滌液體覆蓋的膜插件，準(zhǔn)備用于每種膜的盤，其中含有約300ml的常規(guī)的PBS介質(zhì)(8gNaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4,0. 24g KH2PO4溶于800ml的蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至7. 4，加水到1升并在高壓釜中消毒)。插件被以無菌的方式從容器中移出，在PBS盤中洗滌，并轉(zhuǎn)移至一個6孔板上以便進(jìn)一步?jīng)_洗。全部的插件類型都被轉(zhuǎn)移到6孔板上后，在頂部和底部分別使用3ml和5ml的PBS沖洗5次。在每個沖洗步驟中，插件被溫育至少10分鐘以去除殘留的藥劑和在伽馬輻照過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。在完成沖洗工序后，插件被轉(zhuǎn)移到新的孔板上用于細(xì)胞培養(yǎng)。3ml的MSC 介質(zhì)和5ml的介質(zhì)被分別添加到孔中插件的頂部和底部。插件在MSC介質(zhì)中溫育并在孵化器中過夜。纖連蛋白涂覆的膜(基于按照實(shí)施例2的膜)，用作對比，代表了一種例外。插件的洗滌和沖洗都按照上文所述的進(jìn)行。將其中含有21yg纖連蛋白的Iml的PBS緩沖液添加到插件的頂部并在孵化器中孵化過夜。第二天，移除纖連蛋白溶液并使用PBS洗滌該插件一次，然后在細(xì)胞移植前使用細(xì)胞基質(zhì)孵化過夜。使用未處理的膜插件(實(shí)施例2)和 TCPS培養(yǎng)板分別作為陰性對照和陽性對照。實(shí)施例7中空纖維膜的輻照待接受伽馬-射線輻照的生物反應(yīng)器(殼體內(nèi)裝中空纖維)由本發(fā)明的中空纖維形狀的膜(參見實(shí)施例4到6)構(gòu)成。用于殼體，集管，和封裝件的材料是伽馬穩(wěn)定的并且 Fibasol blue ^ Makrolon DPl-1262 (Bayer Material Science AG) ( jtW / M 管)和伽馬穩(wěn)定的聚氨酯(封裝件)構(gòu)成。生物反應(yīng)器包含填充有環(huán)境空氣，水(R0水)， 0. 001%的丙烯酸水溶液(0. Olg的AA在IlRO水中)或0. 01 %的丙烯酸水溶液(0. Ig的AA 在IlRO水中)的PES/PVP/PA基的膜，并且經(jīng)受25或75kGy的伽馬輻照。使用水溶液或水填充反應(yīng)器是通過從內(nèi)毛細(xì)管(IC)側(cè)以lOOml/min進(jìn)行沖洗并去除空氣完成的。夾住IC 外線，外毛細(xì)管(EC)側(cè)被超濾液填充。重復(fù)該步驟直到?jīng)]有空氣殘留在該生物反應(yīng)器中。 使用一 Co-60源進(jìn)行施加25或75kGy的伽馬輻照，在室溫下進(jìn)行6. 3和18. 9小時。實(shí)施例8未處理的骨髓在平板膜上的培養(yǎng)MSC 介質(zhì)(900ml 的阿爾法-MEM 介質(zhì)(Lonza, Cat. No. BE12-169F)，IOOml 的 FBS, IOml的青霉素/鏈霉素，和IOml的超谷氨酰胺(ultraglutamine) I ；在用于細(xì)胞培養(yǎng)之前，將MSC介質(zhì)加溫至37°C)在插件膜上孵化過夜后被用插件頂部(aiil)和底部(細(xì)1)的新鮮 MSC介質(zhì)替代。那些介質(zhì)體積被用于全部的更進(jìn)一步的步驟。未處理的骨髓體積如表I所示分別添加到每一個插件。通過搖振該盤使得骨髓均勻地分布在膜上。將插件置于孵化器中3天以使得MSC粘附。到第3天，將介質(zhì)從培養(yǎng)插件的頂側(cè)和底側(cè)取出。用2ml的PBS 沖洗膜兩次，每次沖洗都在頂側(cè)。將新鮮的MSC介質(zhì)添加到頂側(cè)和底側(cè)。在第一生長階段 (即，從骨髓種植到第一次MSC分離的培養(yǎng)階段)，插件頂側(cè)和底側(cè)的介質(zhì)每2到3天進(jìn)行更換直到第12或14天。在第12或14天，從4個插件的3個中，通過在每個插件使用500 μ 1 的胰蛋白酶(10分鐘，37°C )將MSC分離。在每個插件使用1. 5ml的MSC介質(zhì)將胰蛋白酶滅活，MSC懸浮液被收集到無菌管中并收集樣本，通過CASY計數(shù)器進(jìn)行MSC計數(shù)。4個插件中的一個被固定并制備用于SEM。因此，使用添加了 Iml的2%戊二醛溶液的PBS洗滌插件的頂側(cè)并在4°C下存放過夜。隨后，插件被使用蒸餾水洗滌三次，風(fēng)干并接受SEM。在第二個試驗中，不執(zhí)行SEM。新鮮的介質(zhì)在被孵化器中的氣體預(yù)熱并調(diào)節(jié)后，添加到同一插件的頂側(cè)和底側(cè)直到MSC被再植入。允許10，500MSCs/cm2再附著到同一個插件上過夜。在第二生長階段，再附著的MSCs在膜上擴(kuò)增額外的7天。MSC介質(zhì)每2到3天進(jìn)行更換。在第 19或第21天，通過在10分鐘，370C的條件下使用胰蛋白酶將MSC從4個插件中的3個上收獲。將MSCs再種植到TCPS上用作MSC形態(tài)和增殖潛力對照試驗。因此，將收獲的MSCs按 5，000MSCs/cm2再種植到TCPS上用作形態(tài)對照試驗并按500MSCS/cm2培養(yǎng)4或5天用作增殖對照試驗。通過獲取微觀圖片來記錄形態(tài)和增殖潛力，第1天或第2天用于形態(tài)評價，第 4天或第5天用于增殖潛力評價。未處理的骨髓被種植到不同的基質(zhì)上(表I)。TCPS或VTK-FN(纖連蛋白涂覆) 和VTK(蒸汽消毒，未涂覆)分別被用作陰性和陽性對照試驗。在12到14天的第一生長階段之后，細(xì)胞被胰蛋白酶化并計數(shù)。相對于TCPS的各自的MSC數(shù)目在圖1和2中以淺色條帶表示。在第二生長階段，MSC被按500MSCs/cm2的密度再植入到同樣的插件上并在第二生長階段擴(kuò)增額外的10天。在7天的第二生長階段后，對再植入的用于形態(tài)的(圖幻和固定的用于SEM的MSC的數(shù)目(在圖1和2中以黑色條帶表示)進(jìn)行測定。相對于作為標(biāo)準(zhǔn)的TCPS，MSC(n = 3)的數(shù)目表示在圖1和2中，線條表示標(biāo)準(zhǔn)的TCPS水平。使用未處理的
骨髓的試驗進(jìn)行兩次。
權(quán)利要求
1.一種膜，包括聚砜、聚醚砜、或聚芳基醚砜，和聚乙烯吡咯烷酮，在濃度為4到100% 體積百分比的氧氣存在下使用從12. 5到175kGy劑量的伽馬-或貝塔-射線或電子束對其進(jìn)行輻照。
2.如權(quán)利要求1中的膜，進(jìn)一步包括聚氨酯。
3.如權(quán)利要求1或2中的膜，進(jìn)一步包括聚酰胺。
4.如權(quán)利要求1到3中任一項的膜，其中所述膜為中空纖維膜。
5.如權(quán)利要求1到3中任一項的膜，其中所述膜為平板膜。
6.制備如權(quán)利要求1到5中任一項的膜的方法，包括在濃度為4到100%體積百分比的氧氣存在下使用從12. 5到175kGy劑量的伽馬-或貝塔-射線或電子束對包括聚砜、聚醚砜、或聚芳基醚砜，和聚乙烯吡咯烷酮的預(yù)先成型的膜進(jìn)行輻照。
7.細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其包括如權(quán)利要求1到5任一項的膜，或是如權(quán)利要求6制備的膜。
8.用于體液的體外處理的裝置，其包括細(xì)胞和如權(quán)利要求1到5任一項的膜，或是如權(quán)利要求6制備的膜。
9.如權(quán)利要求1到5任一項的膜或是如權(quán)利要求6制備的膜在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞是貼壁細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求10中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞是肝細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求10中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞是腎細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求10中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞是上皮細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于培養(yǎng)貼壁或懸浮細(xì)胞，尤其是貼壁細(xì)胞的膜，其中由于在氧氣存在下使用從12.5到175kGy劑量的伽馬-或貝塔-射線或電子束輻照干的或濕的膜，使得所述膜允許細(xì)胞的粘附和增殖。得到的膜可以不需任何表面改性物質(zhì)的預(yù)處理而進(jìn)行使用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備所述輻照膜的方法，該膜能夠用于細(xì)胞，尤其是貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，并涉及將這樣的膜應(yīng)用于細(xì)胞，尤其是貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)的方法。
文檔編號B01D67/00GK102202771SQ200980137689
公開日2011年9月28日 申請日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者B·克勞斯, J·勒爾歇爾, M·諾伊鮑爾 申請人:甘布羅倫迪亞股份公司