專利名稱：：氟喹諾酮類抗生素的固相萃取與hplc-熒光檢測方法
技術領域：
：本發明涉及氟喹諾酮類抗生素的檢測方法，具體涉及一種氟喹諾酮類抗生素的固相萃取與HPLC-熒光檢測方法，屬于環境監測
技術領域：
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背景技術：
：氟喹諾酮類抗生素藥物是近年來發展十分迅速的一類抗菌藥，因其抗菌譜廣、抗菌活性強、半衰期長、高效低毒、使用方便、劑型較多等優點，被廣泛用于人類、牲畜和魚類疾病的治療和預防，也常被用作牲畜和魚類的生長促進劑。由于氟喹諾酮類抗生素服用后很大一部分以原形排出人類及動物體外，進入下水道，其中部分藥物(約7080%)被污水處理廠去除，還有一部分藥物則隨排出水一起進入地表水中，或者通過以污水處理廠排出水灌溉土地、以動物糞便及污水處理廠污泥作為肥料施于土地等方式使藥物進入環境。再者，漁業養殖所投加的氟喹諾酮類抗生素藥物也會進入水體中或在底泥中淤積。為了對氟喹諾酮類抗生素藥物的環境風險進行評估，迫切需要這些藥物在環境中的濃度、歸宿等數據。目前各國的研究者已經在污水處理廠的污泥、污泥灌溉的土壤、醫院廢水、城市污水處理廠的排出水、地表水甚至地下水中檢測到痕量氟喹諾酮類抗生素。鑒于環境樣品的復雜性以及該類藥物進入環境后均經過大量的稀釋，檢測較為困難。現有的應用于環境樣品中氟喹諾酮類抗生素藥物的檢測方法主要有固相萃取-GC-ESI-MS/MS法和固相萃取-HPLC-ESI-MS/MS法，其中固相萃取的操作步驟一般為先把水樣用H2S04調pH到3左右，通過預先用甲醇-水-Na2EDTA緩沖溶液淋洗活化的萃取柱，待水樣過柱后，用Na2EDTA的緩沖溶液沖洗萃取柱，最后用甲醇洗脫。洗脫液進行GC-ESI-MS/MS檢測或HPLC-ESI-MS/MS，HPLC的色譜分離條件一般為0DS-P(4.6mmX250mm)色譜柱，以乙腈_甲酸溶液作為流動相采用梯度洗脫進行檢測。例如，申請號為200810022357.4的中國專利申請中公開了一種同時檢測19種喹諾酮類藥物的HPLC-ESI-MS/MS測定方法，包括樣品處理、液相分離、質譜檢測三個步驟，對組織液中19種喹諾酮類抗生素進行正離子MRM掃描，以諾氟沙星-D5為內標，采用C18色譜柱分離，以含甲酸的水_甲醇為流動相作梯度洗脫，對洗脫液進行質譜檢測；其特點為根據樣品的實際情況和對檢測靈敏度的不同要求，采用有機溶劑提取方法進行樣品的預處理，以諾氟沙星-D5為內標，采用C18色譜柱，以含甲酸的水-甲醇為流動相作梯度洗脫。本方法前處理過程快速簡便，檢測結果可靠靈敏，適用于動物性食品中喹諾酮類藥物殘留的分析檢測。上述現有方法雖然能夠滿足環境樣品檢測的要求，但所需儀器如ESI-MS/MS分析儀非常昂貴，造成測試成本增加，不利于檢測方法的普及。
發明內容本發明提供了一種氟喹諾酮類抗生素的固相萃取與HPLC-熒光檢測方法，其采用常規分析儀器對廢水或地表水中氧氟沙星(0FL)、諾氟沙星(NOR)、環丙沙星(CPX)和恩諾沙星(ENRX)四種典型氟喹諾酮類抗生素進行檢測，達到了采用昂貴分析儀器的檢測效果，降低了測試費用，能夠滿足環境樣品檢測的要求。—種氟喹諾酮類抗生素的固相萃取與HPLC-熒光檢測方法，包括以下步驟(1)水樣預處理取502000mL含氟喹諾酮抗生素的水樣過濾，濾液中添加濃度為0.10.4g/L的Na2EDTA水溶液，用酸調節pH至3.05.0，得到預處理后的水樣；(2)固相萃取用0.52mL甲醇活化3次后，再用37mL濃度為0.10.4g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱；將預處理后的水樣以15mL/min的速度通過活化的固相萃取柱，再用37mL濃度為0.10.4g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空2040min，取濃氨水溶液與甲醇的體積比為23:3857的濃氨甲醇溶液洗脫三次，每次0.52mL，所得洗脫液在空氣流中吹干至0.10.4mL，加水定容至1.OmL，得到測試樣品；其中，所述的濃氨水溶液的體積百分濃度為25%;(3)HPLC-熒光檢測采用C18色譜柱，以pH=2.34.0、體積百分濃度為1030%的甲醇水溶液作為流動相，流速為0.52mL/min，柱溫1050°C，設定熒光檢測的激發波長為270290nm，發射波長為450470nm，分析測試樣品，得到測試樣品的色譜圖，將色譜圖上的峰高在工作曲線上回歸，計算測試樣品中氟喹諾酮抗生素的含量。作為優選，所述的檢測方法，具體包括以下步驟(1)水樣預處理取502000mL含氟喹諾酮抗生素的水樣過濾，濾液中添加濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液，用酸調節pH至4.0，得到預處理后的水樣；(2)固相萃取用lmL甲醇活化3次后，再用5mL濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱；將預處理后的水樣以3mL/min的速度通過活化的固相萃取柱，再用5mL濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空30min，取濃氨水溶液與甲醇的體積比為23:3847的濃氨甲醇溶液洗脫三次，每次lmL，所得洗脫液在空氣流中吹干至0.2mL，加水定容至1.OmL，得到測試樣品；其中，所述的濃氨水溶液的體積百分濃度為25%;(3)HPLC-熒光檢測采用C18色譜柱，以pH二4.0、體積百分濃度為20X的甲醇水溶液作為流動相，流速為1.OmL/min，柱溫30°C，設定熒光檢測的激發波長為281nm，發射波長為460nm，分析測試樣品，得到測試樣品的色譜圖，將色譜圖上的峰高在工作曲線上回歸，計算測試樣品中氟喹諾酮抗生素的含量。所述的氟喹諾酮抗生素為氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星或恩諾沙星。步驟(1)中，水樣過濾時采用常規的過濾方法即可，例如采用中速定性濾紙和0.45iim水膜過濾，除去水樣中的固體雜質。然后添加Na2EDTA水溶液，通過Na2EDTA與水樣中的金屬離子絡合。由于本發明添加N^EDTA是為了絡合一部分金屬離子，其添加量的多少對后續的檢測并沒有太大的影響，因此，本發明對NEDTA的用量不做限定。所述的酸優選醋酸或磷酸。步驟(2)中，所述的固相萃取柱可選用本領域常用的固相萃取柱，如填料為C18鍵合硅膠，即在硅膠上接十八烷基，并對鍵端進行處理的固相萃取柱，優選SupelcoEnvi-18柱。所述的濃氨水溶液與甲醇的體積比為23:3857的濃氨甲醇溶液作為洗脫液，具有很好的洗脫效果，優選濃氨水溶液與甲醇的體積比為23:3847的濃氨甲醇溶液，最優選濃氨水溶液與甲醇的體積比為3:47的濃氨甲醇溶液。熒光檢測波長的選擇采用LS-55熒光分光光度計測得0FL的最佳激發波長為290nm，發射波長為480nm，而NOR、CPX和ENRX的最佳激發波長為275nm，發射波長為440nm。為了兼顧OFL、NOR、CPX和ENRX四種藥物的檢測靈敏性，本發明設定熒光檢測的激發波長為270290nm，發射波長為450470nm，優選熒光激發波長為281nm，發射波長為460nm。HPLC色譜分離條件的選擇流動相中甲醇含量太低則檢測信號弱且洗脫時間長，而甲醇含量過高則藥物的特征峰會發生重疊，因此選用體積百分濃度為1030%的甲醇水溶液，優選體積百分濃度為20%的甲醇水溶液；另外，流動相的pH值大于4.0或者小于2.3都會導致峰重疊或者不能有效地將樣品洗脫，而pH=2.34.0時，對檢測結果的影響不大，優選pH值為4.0。對流速的影響進行測試，發現流速越大，出峰越快，峰面積越大，但是同時色譜峰會發生重疊且柱壓增加，為了得到較好的色譜峰，選擇流速為0.52mL/min，優選為1.OmlVmin。在10°C5(TC范圍內測試了溫度對出峰時間、峰形的影響，在該范圍內溫度影響很小，總的來說溫度越高出峰越快，峰形越尖銳，優選柱溫為30°C。線性范圍的確定按照本領域常用的工作曲線繪制方法，取氧氟沙星標準品、諾氟沙星標準品、環丙沙星標準品和恩諾沙星標準品，分別用水溶解配制成濃度均為1.0X10—3mol/L的儲備液，逐級稀釋成一系列由低濃度到高濃度的標準溶液。標樣的逐級稀釋可按10倍的梯度往低濃度稀釋，比如取10mL的貯備液，稀釋到100mL，得到濃度為1.OX10—W/L的標樣；再取10mL1.OX10—W/L的標樣稀釋到100mL，得到濃度為1.OX10—5mol/L的標樣，依次逐級稀釋到1.OX10—7mol/L的標樣為止。用HPLC-熒光檢測各標樣，得到各標樣的色譜圖，根據色譜圖的峰高與標樣濃度的關系繪制工作曲線，確定線性范圍。檢測限的確定配制4種抗生素濃度均為1.OX10—^Ql/L的混合液標樣，連續進樣測定11次，按照相對檢測限的計算公式(3s/x)Xc進行計算，計算得到檢測限。s表示由標樣11次測得的色譜峰高計算得到的標準偏差，x表示11次測得的色譜峰高的平均值，c表示選定的標樣的濃度，即為1.OX10—7mol/L。本發明所用的試劑均選用分析純，所用的水均選用純水或蒸餾水。本發明具有以下有益效果1.選擇了合適的固相萃取柱，并試驗得到了合適的固相萃取的活化、凈化與洗脫條件，使水樣的濃縮倍數達到1000以上，在本發明適宜的條件下，固相萃取不但濃縮了待測物，同時凈化了樣品中的基體干擾，有利于水環境樣品的測定。2.采用具有高靈敏的熒光檢測器，可以大大降低檢測限，同時結合適宜的預處理條件、固相萃取的凈化與濃縮實現了水環境樣品中超痕量氟喹諾酮類抗生素的靈敏測定。圖1為實施例1中標樣的HPLC-熒光檢測色譜示意圖2為實施例1中杭州市四堡污水處理廠水樣的HPLC-熒光檢測色譜示意圖；圖3為實施例2中杭州市錢塘江水樣的HPLC-熒光檢測色譜示意圖；圖1圖3中，1，2，3，4分別代表0FL，N0R，CPX，ENRX。具體實施方式實施例1水樣預處理取lOOmL杭州市四堡污水處理廠排放口水樣用中速定性濾紙和0.45iim水膜進行過濾，在濾液中添加5mL濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液，用醋酸調節pH至4.0，得到預處理后的水樣。固相萃取依次用lmL甲醇、lmL甲醇、lmL甲醇和5mL濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱。將預處理后的水樣以3mL/min的速度通過活化的固相萃取柱，再用5mL濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空30min，取濃氨水溶液(體積百分濃度為25%)與甲醇的體積比為3:47的濃氨甲醇溶液洗脫三次，每次lmL，所得洗脫液在空氣流中吹干至0.2mL，加水定容至1.OmL，得到測試樣品。氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星標樣的配制取由杭州藥檢所提供的氧氟沙星標準品、諾氟沙星標準品、環丙沙星標準品和恩諾沙星標準品，用超純水溶解，配制成氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星濃度均為1.OX10—3mol/L的貯備液，避光保存。使用時逐級稀釋至所需濃度，得到一系列從低濃度到高濃度的標樣。標樣的逐級稀釋是按10倍的梯度往低濃度稀釋的，取10mL的貯備液，稀釋到100mL，得到濃度為1.OX10—W/L的標樣，再取10mL1.0X10—4mol/L的標樣稀釋到100mL，得到濃度為1.OX10—5mol/L的標樣，依次逐級稀釋到1.0X10—7mol/L的標樣為止。HPLC-熒光檢測采用C18色譜柱，以pH=4.0、體積百分濃度為20%的甲醇水溶液作為流動相，流速為1.OmL/min，柱溫30°C，進樣量為20yL，設定熒光檢測的激發波長為281nm，發射波長為460nm，分析標樣和測試樣品，分別得到各標樣的色譜圖以及測試樣品的色譜圖，根據各標樣色譜圖的峰高與相應的標樣濃度的關系繪制工作曲線，將從測試樣品色譜圖上得到的峰高在工作曲線上回歸，計算測試樣品中氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星的含量。不同時間三次采集杭州市四堡污水處理廠的水樣，檢測結果見表l，每個樣品平行測定3次，結果取平均值。表1四堡污水處理廠水樣測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2水樣預處理取lOOOmL杭州市錢塘江水樣用中速定性濾紙和0.45ym水膜進行過濾，在濾液中添加2mL濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液，用磷酸調節pH至4.0，得到預處理后的水樣。固相萃取依次用lmL甲醇、lmL甲醇、lmL甲醇和5mL濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱。將預處理后的水樣以3mL/min的速度通過活化的固相萃取柱，再用5mL濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空30min，取濃氨水溶液(體積百分濃度為25%)與甲醇的體積比為2:38的濃氨甲醇溶液洗脫三次，每次lmL，所得洗脫液在空氣流中吹干至0.2mL，加水定容至1.OmL，得到測試樣品。氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星標樣的配制操作同實施例1。HPLC-熒光檢測采用C18色譜柱，以pH=2.3、體積百分濃度為20%的甲醇水溶液作為流動相，流速為1.OmL/min，柱溫50°C，進樣量為20yL，設定熒光檢測的激發波長為281nm，發射波長為460nm，分析各標樣和測試樣品，分別得到各標樣的色譜圖以及測試樣品的色譜圖，根據各標樣色譜圖的峰高與相應的標樣濃度的關系繪制工作曲線，將從測試樣品色譜圖上得到的峰高在工作曲線上回歸，計算測試樣品中氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星的含量。不同時間三次采集的杭州市錢塘江二橋和三橋處的水樣，檢測結果見表2，表中結果為每個水樣平行測定3次的平均值。表2錢塘江水樣測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例3回收試驗取5份純水和5份河水，每份1L且加入一定量OFL標準品、NOR標準品、CPX標準品、ENRX標準品進行回收率實驗，按實施例1中的固相萃取處理步驟對水樣進行富集和提取，并進行HPLC-熒光測定，根據色譜圖的峰高與標準品濃度的關系繪制工作曲線，利用峰高計算回收率，結果見表3。表3回收率試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表3看出回收率都在83.695.2X之間，RSD也都在4.3%以內，表明本發明方法抗干擾能力強，在河水復雜的基體中也能較準確地測定目標化合物。權利要求一種氟喹諾酮類抗生素的固相萃取與HPLC-熒光檢測方法，包括以下步驟(1)水樣預處理取50～2000mL含氟喹諾酮抗生素的水樣過濾，濾液中添加濃度為0.1～0.4g/L的Na2EDTA水溶液，用酸調節pH至3.0～5.0，得到預處理后的水樣；(2)固相萃取用0.5～2mL甲醇活化3次后，再用3～7mL濃度為0.1～0.4g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱；將預處理后的水樣以1～5mL/min的速度通過活化的固相萃取柱，再用3～7mL濃度為0.1～0.4g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空20～40min，取濃氨水溶液與甲醇的體積比為2～3∶38～57的濃氨甲醇溶液洗脫三次，每次0.5～2mL，所得洗脫液在空氣流中吹干至0.1～0.4mL，加水定容至1.0mL，得到測試樣品；其中，所述的濃氨水溶液的體積百分濃度為25％；(3)HPLC-熒光檢測采用C18色譜柱，以pH＝2.3～4.0、體積百分濃度為10～30％的甲醇水溶液作為流動相，流速為0.5～2mL/min，柱溫10～50℃，設定熒光檢測的激發波長為270～290nm，發射波長為450～470nm，分析測試樣品，得到測試樣品的色譜圖，將色譜圖上的峰高在工作曲線上回歸，計算測試樣品中氟喹諾酮抗生素的含量。2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(1)水樣預處理取502000mL含氟喹諾酮抗生素的水樣過濾，濾液中添加濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液，用酸調節pH至4.0，得到預處理后的水樣；(2)固相萃取用lmL甲醇活化3次后，再用5mL濃度為0.2g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱；將預處理后的水樣以3mL/min的速度通過活化的固相萃取柱，再用5mL濃度為0.2g/L的N^EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空30min，取濃氨水溶液與甲醇的體積比為23:3847的濃氨甲醇溶液洗脫三次，每次lmL，所得洗脫液在空氣流中吹干至0.2mL，加水定容至1.OmL，得到測試樣品；(3)HPLC-熒光檢測采用C18色譜柱，以pH=4.0、體積百分濃度為20%的甲醇水溶液作為流動相，流速為1.OmL/min，柱溫30°C，設定熒光檢測的激發波長為281nm，發射波長為460nm，分析測試樣品，得到測試樣品的色譜圖，將色譜圖上的峰高在工作曲線上回歸，計算測試樣品中氟喹諾酮抗生素的含量。3.如權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的濃氨甲醇溶液中濃氨水溶液與甲醇的體積比為3:47。4.如權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，所述的氟喹諾酮抗生素為氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星或恩諾沙星。5.如權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的酸為醋酸或磷酸。6.如權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的固相萃取柱為填料是C18鍵合硅膠的固相萃取柱。7.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的固相萃取柱為SupelcoEnvi-18柱。全文摘要本發明公開了一種氟喹諾酮類抗生素的固相萃取與HPLC-熒光檢測方法，包括將預處理后的水樣通過活化的固相萃取柱，再用Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空，最后用濃氨體積百分比濃度為6％的濃氨甲醇溶液洗脫三次，每次0.5～2mL，所得洗脫液在空氣流中吹干至0.1～0.4mL，加水定容至1.0mL，得到測試樣品，進行HPLC-熒光檢測。本發明采用固相萃取-HPLC-熒光檢測技術，利用常規的分析儀器可同時測定水環境樣品中氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星4種典型氟喹諾酮類抗生素的含量。該方法操作簡單，成本低，可應用于廢水、地表水中超痕量的4種典型氟喹諾酮類抗生素含量的測定。文檔編號B01D15/08GK101696964SQ20091015324公開日2010年4月21日申請日期2009年10月29日優先權日2009年10月29日發明者卓霞軍,童裳倫申請人:浙江大學;