專利名稱：一種低聚原花青素的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種提取方法，具體的涉及一種低聚原花青素的提取方法。
背景技術：
原花青素(Proantho Cyanidins, PC)廣泛存在于植物中，其為一類由不同數量的黃烷-3-醇單體縮合而成的聚多酚類物質，主要由兒茶素和表兒茶素等組成，其因在酸性 介質下加熱生成相應的花色素而得名。最簡單的原花青素是兒茶素與表兒茶單體。此外， 還有二聚體、三聚體、四聚體等，直至十聚體。按聚合度大小，通常將2 4聚體稱為低聚 體(oligomeric procyanidin, 0PC)，>|奪五聚體以上禾爾為高聚體(polymeric procyanidin, PPC)。低聚原花青素(oligomeric procyanidins, OPCs)由于結構特殊，水溶性好，有效性 高，生物利用度在90%以上，易被人體吸收，成為研究的熱點。低聚原花青素具有較強的抗 氧化性、清除自由基能力和對人體微循環改善的能力，是目前發現的最強、最有效的氧自由 基清除劑和脂質過氧化抑制劑之一。低聚原花青素在體內的抗氧化效果遠高于維生素E和 維生素C，其在體內抗氧化能力約為維生素E的50倍，維生素C的20倍。目前，低聚原花青 素在化妝品領域以及保健食品領域得到廣泛應用。國外生產的低聚原花青素制劑已成為人 們經常服用的具有延緩衰老和美容等功能的保健食品。國內外已報道了多種分離制備低聚原花青素的方法。這些方法主要是從松樹皮、 葡萄籽等植物提取物中分離得到。目前，低聚原花青素的提取純化工藝主要包括溶劑提取 法和柱層析法。溶劑提取法雖然設備簡單，操作費用低，但僅采用溶劑提取法，產品純度較 低，只能達到50%左右。柱層析法可有效提高產品純度。現有的采用柱層析法分離提純低 聚原花青素的報道中，主要采用聚酰胺或C18鍵合相硅膠作為填料。其中，聚酰胺填料雖然 價格較低，但是在進料前需要對原料進行復雜的預處理，并且由于聚合度較高的低聚原花 青素在聚酰胺上有強烈吸附，使得低聚原花青素的收率較低，且很容易使柱效降低，需要用 堿液頻繁再生，不適合工業化生產。采用C18鍵合相硅膠作填料，雖然可以得到純度較高的 低聚原花青素產品，但其價格昂貴，難以應用于大規模工業生產。因此，亟待尋求一種工藝 簡便，成本低，易于產業化的新方法。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是為了克服現有的低聚原花青素的方法產品純度和 收率不夠理想，或操作繁瑣，或成本較高等缺陷，而提供了一種與現有技術相比，產品純度 和收率均有顯著提高，且工藝簡便，成本低，易于產業化的提取低聚原花青素的新方法。本發明的方法包括如下步驟將含低聚原花青素的植物原料用溶劑提取所得的粗 提物上大孔吸附樹脂柱，用水洗脫除去蛋白質和多糖類雜質，之后再用下述有機溶劑中的 一種或多種與水作為洗脫劑進行梯度洗脫乙醇、甲醇和丙酮，收集以體積比為4 1 5 的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板(TLC) 上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分，即得低聚原花青素提取物。
下面，對本發明的方法進行詳細的介紹(1)含低聚原花青素的植物原料用溶劑提取所得的粗提物本發明中，所述的含低聚原花青素的植物原料用溶劑提取所得的粗提物可為現有技術中，植物原料經溶劑提取含有低聚原花青素的粗提物，本發明特別優選由下述原料及 方法所制得的粗提物，以更佳的配合之后的提純步驟本發明中，所述的含低聚原花青素的植物原料可為現有文獻中報道的各種含有低 聚原花青素的植物原料，如松樹皮、葡萄籽和沙棘籽等。本發明優選低聚原花青素含量較高 的沙棘籽，更佳的為沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，選擇該原料可實現廢物利用，且較 松樹皮和葡萄籽等來源更廣，且成本更低。較佳的，溶劑提取前，將上述植物原料進行干燥粉碎處理。干燥的溫度較佳的為 40 85°C。粉碎的顆粒的粒徑較佳的為80目。本發明中，溶劑提取的方式可采用現有的各種溶劑提取方式，如常規溶劑提取、微 波輔助溶劑提取、超聲溶劑提取和超臨界流體萃取等。本發明中，所述的常規溶劑提取是指 不采用如微波和超聲等特殊輔助手段的溶劑提取法。上述各溶劑提取方式的具體各條件可 參考本領域現有技術，本發明經優化篩選，特別優選如下條件提取溶劑較佳的為下述有機 溶劑中的一種或多種與水的混合溶劑乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮和乙酸乙酯。混合溶劑 的濃度可任意選擇，較佳的為體積百分比10 95%有機溶劑的水溶液。每次提取中混合溶 劑的用量較佳的為2 20ml/lg植物原料，更佳的為3 6ml/lg植物原料。溶劑提取的溫 度較佳的為10 100°C，更佳的為10 85°C。溶劑提取的次數較佳的為2 5次，更佳的 為3次。每次溶劑提取的時間較佳的為20分鐘 5小時，更佳的為30 100分鐘。采用微 波輔助溶劑提取時，可采用恒功率或恒溫的微波輻照方式。采用超臨界流體萃取時，超臨界 流體較佳的為CO2，夾帶劑較佳的選自甲醇、乙醇和丙酮中的一種或多種，或不使用夾帶劑。本發明一較佳實例的溶劑提取的步驟中，以沙棘籽為原料，10 85°C的條件下提 取3次，每次20 100分鐘，每次提取溶劑用量為3 6ml/lg沙棘籽。溶劑提取后，按常規方法，將提取液濃縮至濃縮液，或干燥得固體，即得所述的粗 提物。由上述優選溶劑提取方法制得的粗提物中，低聚原花青素含量占該粗提物固含量的 質量比> 20 %，基本都在35%以上。上述優選的溶劑提取方法，低聚原花青素含量的收率 約85%以上。(2)大孔吸附樹脂柱層析本發明中，所述的大孔吸附樹脂可為極性或非極性大孔吸附樹脂。經大量試驗 摸索，本發明特別優選下述類型的大孔吸附樹脂HP-20、HP-2MG、SP207、SP850、XAD16、 XAD1600, XAD7HP、D-101、AB_8、MCI或HPD。采用上述優選的大孔吸附樹脂，產品的純度和 收率可得到尤為顯著的提高。層析柱的徑長比較佳的為1 5 1 45。優選的層析柱 規格為Φ12Χ500πιπι或Φ50Χ500πιπι。大孔吸附樹脂的用量較佳的為上樣質量的30 120 倍。步驟(1)結束后，將所得的粗提物上大孔吸附樹脂柱。上樣方法可為常規的濕法 上樣或干法上樣，優選濕法上樣。采用濕法上樣時，優選以0. 1 5倍柱體積/小時的流速 上樣進柱。上樣溫度優選10 60°C。上樣后，用水作洗脫劑進行洗脫，除去蛋白質和多糖等雜質。水的用量較佳的為1 8倍柱體積。用水洗脫的流速較佳的為1 5倍柱體積/小時。用水洗脫的溫度較佳 的為10 60°C。之后，用下述有機溶劑中的一種或多種與水作為洗脫劑進行梯度洗脫乙醇、甲醇和丙酮。根據所選用的大孔吸附樹脂的極性，在體積比0%有機溶劑(即水)和體積比 100%有機溶劑的濃度范圍內選擇洗脫梯度。每個梯度的洗脫液的用量較佳的為5 20柱 體積。洗脫的流速較佳的為1 5倍柱體積/小時。選擇不同的洗脫劑和洗脫梯度時，收 集的洗脫梯度范圍有所不同，以收集用體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液 靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板(TLC)上Rf值為0.2 0.5的洗脫部分 為準。梯度洗脫的溫度較佳的為10 60°C。本發明一較佳實例中，選擇DlOl大孔吸附樹脂，洗脫梯度依次為5%乙醇水溶 液，40%乙醇水溶液，純乙醇，收集40%乙醇水溶液的洗脫部分。本發明另一較佳實例中，選擇AB-8型大孔吸附樹脂，洗脫梯度依次為40%丙酮 水溶液，純丙酮，收集40%丙酮水溶液的洗脫部分。本發明另一較佳實例中，選擇HP-20大孔吸附樹脂，洗脫梯度依次為20%乙醇水 溶液，40%乙醇水溶液，純乙醇，收集20 %乙醇水溶液的洗脫部分，以及部分40 %甲醇水溶 液的洗脫部分。本發明另一較佳實例中，選擇SP207大孔吸附樹脂，洗脫梯度依次為10%乙醇水 溶液、50%乙醇水溶液，純乙醇，收集10%甲醇水溶液的洗脫部分和部分50%甲醇的洗脫 部分。上述較佳實例中，百分比為體積百分比。梯度洗脫后，將所收集的洗脫部分干燥濃縮為濃縮液，或干燥至固體，即得低聚源 花青素提取物。低聚原花青素含量占該提取物固含量的質量比>50%，基本都在80%以 上。大孔吸附樹脂柱層析步驟，低聚原花青素含量的收率約80%以上。(1)中優選方法制 取粗提物和(2)的總收率約60%以上。經(2)大孔吸附樹脂柱層析后，較佳的還進行(3)過凝膠柱分離提純，以進一步提
高產品純度。本發明中，所述的凝膠柱較佳的為葡聚糖凝膠S印hadex G系列(如G_10、G_15、 G-25、G-50、G-75、G-100、G-150 或 G-200)、葡聚糖凝膠 LH 系列(如 Sephadex LH-20，)、葡 聚糖凝膠DEAE系列(具體規格如A25，A50或FF等子系列)、葡聚糖凝膠T系列(具體規 格如T3，T4，T5，T6，T7或T9等子系列)或瓊脂凝膠CL系列(如瓊脂凝膠CL-4B，或瓊脂 凝膠CL-6B系列。各種規格的上述類型的凝膠柱都適用本發明，優選上述列舉的具體規格。 凝膠柱的徑長比較佳的為1 50 1 150。洗脫劑可選擇水、乙醇、甲醇、丙酮和氯仿中的一種或多種，濃度配比可任意，較佳 的為體積比10% 40%的有機溶劑的水溶液。洗脫劑用量較佳的為80 120倍柱體積。 收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開 齊U，硅膠薄層層析板(TLC)上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分為準。凝膠柱分離提純后，將所收集的洗脫部分干燥濃縮為濃縮液，或干燥至固體，即得 低聚源花青素提取物。低聚原花青素含量占該提取物固含量的質量比不> 80%，基本都在 90%以上。過凝膠柱分離提純步驟，低聚原花青素含量的收率約90%以上。(1)中優選方法制取粗提物、⑵和⑶的總收率60%以上。本發明的提取方法中，上述各步驟的優選條件可任意組合，即得到本發明的各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在于與現有技術相比，本發明的提取方法制得的低聚源 花青素提取物產品的純度和收率均有顯著提高，經大孔吸附樹脂柱層析，低聚原花青素收 率可達80%以上，產品純度> 50%，基本都在80%以上。即使在大孔吸附樹脂柱層析步 驟加上之前的溶劑提取和之后的凝膠柱提純步驟，三步總收率仍可達60%以上，產品純度 ^80%,基本都在90%以上。并且，本發明的方法工藝簡便，成本低，易于產業化。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下述實施例中，溶液的濃度百分比均為體積百分比。下述實施例中，各提取物中低聚原花青素含量的檢測方法為運用低聚原花色素 與鹽酸-正丁醇的特征顏色反應測定其含量。配制含有體積比30%鹽酸的正丁醇液50ml， 備用。分別取低聚原花青素體標準液(購于天津尖峰公司)lmg/ml 25ul、50ul、75ul、 IOOul，4mg/ml 50ul，加入1. 4ml鹽酸-正丁醇溶液，加水使總體積到1. 5ml搖勻，于沸水中 煮30min，冷卻，在波長為525nm比色，繪制標準曲線。用HPLC-MS對所得的提取物進行成分 分析，選取分子量低于1000的成分，配成lmg/ml，取0. Iml按同法測定525nm吸收度，對照 標準曲線計算低聚原花青素含量。植物原料中的低聚原花青素含量的測定方法為將植物原料溶解后，用HPLC-MS 分離分子量低于1000的成分，按上述比色法測其中低聚花青素含量。下述實施例中，總收率為產品中低聚原花青素含量/植物原料中低聚原花青素含 量 X100%o實施例11)稱取250g沙棘籽(產地青海)，加入60%的乙醇水溶液600ml，攪拌提取，提取 溫度控制在40°C。第一次提取時間為60min，第二次和第三次提取時間分別為20min，共提 取三次。每次提取完成后過濾，合并濾液，濃縮得到低聚原花青素濃縮液。低聚原花青素含 量占該濃縮液固含量為57. 6wt%。該步驟，低聚原花青素收率為92. 7%。2)層析柱尺寸為Φ 12 X 500mm,內部裝填DlOl大孔吸附樹脂(上樣質量50倍)。 下述操作中，溫度控制在30°C。將低聚原花青素濃縮液以0. 5倍床層體積/小時的流速通 入層析柱中。進料完成后先用4倍柱體積的去離子水洗脫層析柱，流速為2倍床層體積/小 時，然后分別用5%、40%的乙醇水溶液和純乙醇依次進行梯度洗脫，每個梯度用量為5倍 柱體積，流速為2倍床層體積/小時。收集40%乙醇水溶液的洗脫部分，濃縮干燥得到低聚 原花青素含量為91. 7襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為86. 0%。3)柱層析產品用甲醇溶解，通過S印hadex G-IO柱(Φ 1 X 150cm)，用100倍柱體 積20%甲醇的水溶液洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水 的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗 脫部分，干燥，得到低聚原花青素含量為97. Iwt %的產品。該步驟，低聚原花青素收率為98. 6%。經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為78. 5%。實施例21)稱取250g沙棘籽(產地青海)，加入70%的甲醇水溶液800ml，回流提取，提取溫度控制在85°C。第一次提取時間為30min，第二次和第三次提取時間分別為15min，共提 取三次。每次提取完成后過濾，合并濾液，濃縮得到低聚原花青素濃縮液。低聚原花青素含 量占該濃縮液固含量為38. Swt%。該步驟，低聚原花青素的收率為89. 1%。2)層析柱尺寸為Φ 12 X 500mm,內部裝填AB-8型大孔吸附樹脂(上樣質量80倍)。 下述操作中，溫度控制在30°C。低聚原花青素濃縮液以0. 3倍床層體積/小時的流速通入 層析柱中。進料完成后，先用6倍柱體積去離子水洗脫層析柱，流速為5倍床層體積/小時， 然后分別用40%的乙醇水溶液和純乙醇各依次進行梯度洗脫，每個梯度的用量為7倍柱體 積，流速為5倍床層體積/小時。收集40%乙醇水溶液的洗脫部分，濃縮、干燥得到低聚原 花青素含量為83. 6襯％的產品。該步驟，低聚原花青素的收率為83. 7%。3)柱層析產品用乙醇溶解，通過S印hadex G-25柱(Φ 1 X 150cm)，用80倍柱體 積的30%乙醇水溶液洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的 混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫 部分，干燥，得到低聚原花青素含量為92. 7襯％的產品。該步驟，低聚原花青素的收率為 94. 2%。經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為70. 3%。實施例31)稱取250g沙棘籽(產地青海)，加入70%的丙酮-水溶液1000ml，超聲提取， 提取溫度控制在30°C。第一次提取時間為90min，第二次和第三次提取時間分別為60min， 共提取三次。每次提取完成后過濾，合并濾液，濃縮得到低聚原花青素濃縮液。低聚原花青 素含量占該濃縮液固含量為47. 5wt%。該步驟，低聚原花青素的收率為91. 1%。2)層析柱尺寸為Φ50Χ500πιπι，內部裝填ΗΡ-20大孔吸附樹脂(上樣質量100倍)。 下述操作中，溫度控制在25°C。低聚原花青素濃縮液以0. 5倍床層體積/小時的流速通入 層析柱中。進料完成后先用8倍柱體積去離子水洗脫層析柱，流速為1倍床層體積/小時， 然后用20%乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液和純乙醇依次進行梯度洗脫，每個梯度用量為 10倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集20%甲醇洗脫的全部和40%甲醇洗脫的一 部分(以收集用體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置分層后的上層溶 液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分為準)，濃縮、干燥得到低聚 原花青素含量為87. 7襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為81. 8%。3)柱層析產品用甲醇溶解，通過S印hadex DEAE-A25柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍 柱體積的20%甲醇水溶液洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和 水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的 洗脫部分，干燥，得到低聚原花青素含量為90. 6襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為 91. 1%。經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為67. 9%。實施例4
1)稱取250g沙棘籽(產地青海)，加入到IOOOmL的超臨界流休萃取罐中，用C02 作超臨界流體，流量1. 5L/min。當溫度升到50°C，壓力達到15MPa時開始計時。保持該條件 運行6小時，然后停止，從分離罐中分離出超臨界流體萃取物。提取液經去除溶劑后得到溶 劑粗提物，提取物中低聚原花青素含量為45. 2wt%。該步驟，低聚原花青素收率為87. 3%。2)層析柱尺寸為Φ50Χ500πιπι，內部裝填SP207大孔吸附樹脂(上樣質量120倍)。 下述操作中，溫度控制在45°C。用甲醇溶解粗提物，以0. 5倍床層體積/小時的流速通入 層析柱中。進料完成后先用5倍柱體積去離子水洗脫層析柱，流速為1倍床層體積/小時， 然后用10%乙醇水溶液、50%的乙醇水溶液和純乙醇，依次進行梯度洗脫，每個梯度用量為 8倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集10%甲醇洗脫的全部和50%甲醇洗脫的一 部分(以收集用體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置分層后的上層溶 液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分為準)，濃縮、干燥得到低聚 原花青素含量為84. 1襯％的產品。該步驟，低聚原花青素 收率為85. 5%。3)柱層析產品用甲醇溶解，通過S印hadex CL-4B柱(Φ 1 X 150cm)，用110倍柱 體積的20%甲醇水溶液洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水 的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗 脫部分，干燥，得到低聚原花青素含量為92. 2襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為 90. 6%。經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為67. 6%。實施例51)稱取250g葡萄籽，加入95%的丙醇-水溶液2500ml，攪拌提取，提取溫度控制 在10°C。第一次提取時間為5小時，第二次和第三次提取時間分別為3小時，第四次和第五 次提取時間分別為2小時，共提取5次。每次提取完成后過濾，合并濾液，濃縮得到低聚原 花青素濃縮液。低聚原花青素含量占該濃縮液固含量為51. 3wt%。該步驟，低聚原花青素 的收率為89.5%。2)層析柱尺寸為Φ55Χ300πιπι，內部裝填HP-2MG大孔吸附樹脂(上樣質量60倍)。 下述操作中，溫度控制在25°C。低聚原花青素濃縮液以5倍床層體積/小時的流速通入層 析柱中。進料完成后先用8倍柱體積去離子水洗脫層析柱，流速為1倍床層體積/小時，然 后用15%乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液和純乙醇依次進行梯度洗脫，每個梯度用量為10 倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集20%甲醇洗脫的全部和40%甲醇洗脫的一部 分(以收集用體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置分層后的上層溶液 為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分為準)，濃縮、干燥得到低聚原 花青素含量為85. 3襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為82. 1%。3)柱層析產品用甲醇溶解，通過S印hadex G-200柱(Φ 1 X 50cm)，用100倍柱體 積的水洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置 分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分，干燥，得到 低聚原花青素含量為92. 5襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為93. 1%。經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為68. 4%。實施例61)稱取250g松樹皮，加入10%的丁醇-水溶液5000ml，恒溫微波提取，提取溫度控制在100°C。第一次提取時間為20min，第二次提取時間為20min，共提取2次。每次提取 完成后過濾，合并濾液，濃縮得到低聚原花青素濃縮液。低聚原花青素含量占該濃縮液固含 量為52. Iwt%。該步驟，低聚原花青素的收率為92. 5%。2)層析柱尺寸為Φ 16 X 700mm，內部裝填SP850大孔吸附樹脂(上樣質量50倍)。下述操作中，溫度控制在25°C。低聚原花青素濃縮液以0. 1倍床層體積/小時的流速通入 層析柱中。進料完成后先用7倍柱體積去離子水洗脫層析柱，流速為2倍床層體積/小時， 然后用10%乙醇水溶液、30%的乙醇水溶液和50%乙醇依次進行梯度洗脫，每個梯度用量 為5倍柱體積，流速為2倍床層體積/小時。收集用體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和 水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗 脫部分，濃縮、干燥得到低聚原花青素含量為82. 1襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率 為 90. 3%。3)柱層析產品用甲醇溶解，通過瓊脂凝膠CL-6B柱(Φ 1 X 100cm)，用120倍柱體 積的甲醇洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜 置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分，干燥，得 到低聚原花青素含量為93. 5襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為89. 5%。經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為74. 8%。實施例71)稱取250g沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，加入50%的乙酸乙酯-水溶液 1000ml，恒溫微波提取，控制在50°C。第一次提取時間為40min，第二次和第三次提取時間 分別為30min，共提取3次。每次提取完成后過濾，合并濾液，濃縮得到低聚原花青素濃縮 液。低聚原花青素含量占該濃縮液固含量為53. 5wt%。該步驟，低聚原花青素的收率為 90. 5%。2)層析柱尺寸為Φ 50 X 500mm，內部裝填XAD16大孔吸附樹脂(上樣質量80倍)。 下述操作中，溫度控制在60°C。低聚原花青素濃縮液以2倍床層體積/小時的流速通入層 析柱中。進料完成后先用8倍柱體積去離子水洗脫層析柱，流速為4倍床層體積/小時，然 后用15%乙醇水溶液、35%的乙醇水溶液和55%乙醇依次進行梯度洗脫，每個梯度用量為 20倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集用體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水 的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫 部分，濃縮、干燥得到低聚原花青素含量為85. 5襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為 79. 5%。3)柱層析產品用甲醇溶解，通過葡聚糖T6柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍柱體積的乙 醇洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置分層 后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分，干燥，得到低聚 原花青素含量為95. 5襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為89. 5%。經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為64. 4%。實施例81)稱取250g沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，加入50%的乙酸乙酯-水溶液 1000ml，恒溫微波提取，控制在50°C。第一次提取時間為40min，第二次和第三次提取時間 分別為30min，共提取3次。每次提取完成后過濾，合并濾液，濃縮得到低聚原花青素濃縮液。低聚原花青素含量占該濃縮液固含量為45. 5wt%。該步驟，低聚原花青素的收率為 92. 1%。2)層析柱尺寸為Φ 16X 300mm，內部裝填XAD1600大孔吸附樹脂(上樣質量30 倍)。下述操作中，溫度控制在25°C。低聚原花青素濃縮液以4倍床層體積/小時的流速 通入層析柱中。進料完成后先用4倍柱體積去離子水洗脫層析柱，流速為3倍床層體積/ 小時，然后用10%乙醇水溶液、60%的乙醇水溶液和純乙醇依次進行梯度洗脫，每個梯度用 量為10倍柱體積，流速為5倍床層體積/小時。收集用體積比為4 1 5的正丁醇、醋 酸和水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5 的洗脫部分，濃縮、干燥得到低聚原花青素含量為83. 2襯％的產品。該步驟，低聚原花青素 收率為84. 5% ο3)柱層析產品用甲醇溶解，通過瓊脂凝膠CL-4B柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍柱體 積的丙酮洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜 置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分，干燥，得 到低聚原花青素含量為90. 5襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為88. 5%。
經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為68. 8%。實施例91)稱取250g沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，加入50%的乙酸乙酯-水溶液 1000ml，恒溫微波提取，控制在50°C。第一次提取時間為40min，第二次和第三次提取時間 分別為30min，共提取3次。每次提取完成后過濾，合并濾液，濃縮得到低聚原花青素濃縮 液。低聚原花青素含量占該濃縮液固含量為48. 4wt%。該步驟，低聚原花青素的收率為 89. 5%。2)層析柱尺寸為Φ50Χ500πιπι，內部裝填XAD7HP大孔吸附樹脂(上樣質量100 倍)。下述操作中，溫度控制在25°C。低聚原花青素濃縮液以0.5倍床層體積/小時的流速 通入層析柱中。進料完成后先用3倍柱體積去離子水洗脫層析柱，流速為4倍床層體積/小 時，然后用10%乙醇水溶液、30%的乙醇水溶液、50%的乙醇水溶液純乙醇依次進行梯度洗 脫，每個梯度用量為10倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集用體積比為4 1 5 的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值 為0. 2 0. 5的洗脫部分，濃縮、干燥得到低聚原花青素含量為88. 1襯％的產品。該步驟， 低聚原花青素收率為82.5%。3)柱層析產品用甲醇溶解，通過S印hadex LH-20柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍柱體 積的氯仿洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜 置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分，干燥，得 到低聚原花青素含量為94. 5襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為88. 5%。經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為65. 3%。實施例101)稱取250g沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，加入50%的乙酸乙酯-水溶液 1000ml，恒溫微波提取，控制在50°C。第一次提取時間為40min，第二次和第三次提取時間 分別為30min，共提取3次。每次提取完成后過濾，合并濾液，濃縮得到低聚原花青素濃縮 液。低聚原花青素含量占該濃縮液固含量為51. 7wt%。該步驟，低聚原花青素的收率為87. 5%。2)層析柱尺寸為Φ50Χ500πιπι，內部裝填MCI大孔吸附樹脂(上樣質量90倍)。 下述操作中，溫度控制在25°C。低聚原花青素濃縮液以0. 5倍床層體積/小時的流速通入 層析柱中。進料完成后先用5倍柱體積去離子水洗脫層析柱，流速為2倍床層體積/小時， 然后用30%乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液和50%乙醇依次進行梯度洗脫，每個梯度用量 為10倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集用體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸 和水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的 洗脫部分，濃縮、干燥得到低聚原花青素含量為83. 5襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收 率為86. 5%。3)柱層析產品用甲醇溶解，通過S印hadex DEAE-A50柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍 柱體積的40%甲醇水溶液洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和 水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的 洗脫部分，干燥，得到低聚原花青素含量為91. 5襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為 92. 9%。經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為70. 3%。實施例111)稱取250g沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，加入50%的乙酸乙酯-水溶液 1000ml，恒溫微波提取，控制在50°C。第一次提取時間為40min，第二次和第三次提取時間 分別為30min，共提取3次。每次提取完成后過濾，合并濾液，濃縮得到低聚原花青素濃縮 液。低聚原花青素含量占該濃縮液固含量為50. 3wt%。該步驟，低聚原花青素的收率為 92. 4%。2)層析柱尺寸為Φ50Χ500πιπι，內部裝填HPD大孔吸附樹脂(上樣質量90倍)。 下述操作中，溫度控制在10°c。低聚原花青素濃縮液以0. 5倍床層體積/小時的流速通入 層析柱中。進料完成后先用1倍柱體積去離子水洗脫層析柱，流速為1倍床層體積/小時， 然后用10%乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液和70%乙醇依次進行梯度洗脫，每個梯度用量 為10倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集用體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸 和水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的 洗脫部分，濃縮、干燥得到低聚原花青素含量為84. 3襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收 率為80. 5%。3)柱層析產品用甲醇溶解，通過S印hadex DEAE-A25柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍 柱體積的10%甲醇水溶液洗脫，對照標準品，收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和 水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板 上Rf值為0. 2 0. 5的 洗脫部分，干燥，得到低聚原花青素含量為92. 1襯％的產品。該步驟，低聚原花青素收率為 87. 5%。經過溶劑提取、柱層析和凝膠三步，低聚原花青素總收率為65. 0%。
權利要求
一種提取低聚原花青素的方法，其特征在于其包括如下步驟將含低聚原花青素的植物原料用溶劑提取所得的粗提物上大孔吸附樹脂柱，用水洗脫除去蛋白質和多糖類雜質，之后再用下述有機溶劑中的一種或多種與水作為洗脫劑進行梯度洗脫乙醇、甲醇和丙酮，收集以體積比為4∶1∶5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分，即得低聚原花青素提取物。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的含低聚原花青素的植物原料為松樹 皮、葡萄籽或沙棘籽。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的沙棘籽為沙棘提取完沙棘油后的沙 棘籽渣滓。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的溶劑提取的方式為常規溶劑提取、微 波輔助溶劑提取、超聲溶劑提取或超臨界流體萃取。
5.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于所述的溶劑提取中，提取溶劑為下述有機溶劑中的一種或多種與水的混合溶劑乙醇、 甲醇、丙醇、丁醇、丙酮和乙酸乙酯；混合溶劑的濃度為體積百分比10 95%有機溶劑的 水溶液；每次提取中，混合溶劑的用量為2 20ml/lg植物原料；溶劑提取的溫度為10 IOO0C ；溶劑提取的次數為2 5次；每次溶劑提取的時間為20分鐘 5小時；采用微波輔助溶劑提取時，采用恒功率或恒溫的微波輻照方式；采用超臨界流體萃取時，超臨界流體為CO2,夾帶劑選自甲醇、乙醇和丙酮中的一種或 多種，或不使用夾帶劑。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔吸附樹脂為下述類型的大孔吸 附樹脂HP-20、HP-2MG、SP207、SP850、XAD16、XAD1600, XAD7HP、D-101、AB-8、MCI 或 HPD。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔吸附樹脂的徑長比為1 5 1 45;大孔吸附樹脂的用量為上樣質量的30 120倍。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于將粗提物上大孔吸附樹脂柱的上樣方法為 濕法上樣，以0. 1 5倍柱體積/小時的流速上樣進柱，上樣溫度為10 60°C。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的用水洗脫除去蛋白質和多糖類雜質 的步驟中，水的用量為1 8倍柱體積，用水洗脫的流速為1 5倍柱體積/小時，用水洗 脫的溫度為10 60°C。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的梯度洗脫的洗脫梯度在體積比0% 有機溶劑和體積比100%有機溶劑的濃度范圍內選擇，每個梯度的洗脫液的用量為5 20 柱體積，洗脫的流速為1 5倍柱體積/小時，梯度洗脫的溫度為10 60°C。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔吸附樹脂柱為DlOl大孔吸附樹脂，所述的梯度洗脫中，洗脫梯度依次為 5 %乙醇水溶液，40 %乙醇水溶液，純乙醇，收集40 %乙醇水溶液的洗脫部分；或者，所述的大孔吸附樹脂柱為AB-8型大孔吸附樹脂，所述的梯度洗脫中，洗脫梯度 依次為40%丙酮水溶液，純丙酮，收集40%丙酮水溶液的洗脫部分；或者，所述的大孔吸附樹脂柱為HP-20大孔吸附樹脂，所述的梯度洗脫中，洗脫梯度依 次為20%甲醇水溶液，40%甲醇水溶液，純甲醇，收集20%甲醇水溶液的洗脫部分，以及部 分40%甲醇水溶液的洗脫部分；或者，所述的大孔吸附樹脂柱為SP207大孔吸附樹脂，所述的梯度洗脫中，洗脫梯度依 次為10%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液，純乙醇，收集10%甲醇水溶液的洗脫部分和部分 50%甲醇的洗脫部分； 百分比為體積百分比。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于將權利要求1的方法所制得的低聚原花青 素提取物再進行凝膠柱分離提純，以水、乙醇、甲醇、丙酮和氯仿中的一種或多種為洗脫劑， 收集以體積比為4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開 劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0. 2 0. 5的洗脫部分，即得進一步提純后的低聚原花青素 提取物。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于所述的凝膠柱為葡聚糖凝膠G系列、葡聚 糖凝膠LH系列、葡聚糖凝膠DEAE系列、葡聚糖凝膠T系列或瓊脂凝膠CL系列。
14.如權利要求12所述的方法，其特征在于所述的凝膠柱的徑長比為1 50 1 150。
15.如權利要求12所述的方法，其特征在于所述的洗脫劑為濃度配比為體積比 10% 40%的有機溶劑的水溶液，洗脫劑用量為80 120倍柱體積。
全文摘要
本發明公開了一種提取低聚原花青素的方法，其包括如下步驟將含低聚原花青素的植物原料用溶劑提取所得的粗提物上大孔吸附樹脂柱，用水洗脫除去蛋白質和多糖類雜質，之后再用下述有機溶劑中的一種或多種與水作為洗脫劑進行梯度洗脫乙醇、甲醇和丙酮，收集以體積比為4∶1∶5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液靜置分層后的上層溶液為展開劑，硅膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分，即得低聚原花青素提取物。較現有技術，本發明的方法純度和收率均有顯著提高，低聚原花青素收率可達80％以上，產品純度≥50％，基本都在80％以上，且該方法工藝簡便，成本低，易于產業化。
文檔編號B01J20/26GK101845035SQ20091004806
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月24日 優先權日2009年3月24日
發明者夏玉葉, 王曙光, 蓋春艷, 閔旸, 陳述增, 韓竹箴, 高雯 申請人:上海醫藥工業研究院