專利名稱：多糖珠的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及多糖粒子例如瓊脂糖珠的制備，該珠子用于生物分離，例如蛋白質和/
或細胞的凈化中，用作藥物載體或者通常用于生物工程領域中。
背景技術：
瓊脂糖是一種從藻類中提取的天然多糖，并且它的水溶液在低溫時形成水凝膠。從二十世紀六十年代起，瓊脂糖已經被用作色譜介質，并且已經具有了許多有利的特性，例如高親水性、高孔隙率以及可用于官能化的羥基基團。瓊脂糖經常被用作例如親合色譜法、疏水交互色譜法(HIC)、反相色譜法(RPC)和離子交換色譜法中的基質。
例如，Shahab Lahooti等人(Shahab Lahooti禾口 Michael V. Sefton， Effectof an immobilization matrix and c即sule permeability on thevariability ofencapsulated HEK cells, Biomaterials. 21 (2000)987-995)描述了被甲基丙烯酸羥乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物殼所包圍的作為核物質的瓊脂糖，其被植入到HEK細胞中。一方面，瓊脂糖的大孔網狀結構甚至能夠分散細胞，并且促進營養物質和代謝產物的擴散，另一方面，它還降低了珠隔膜濃度，提高了隔膜的滲透性，并且促進足夠的用于細胞生長的營養物質進入珠中。研究顯示瓊脂糖有利于保持植入的細胞活性和細胞分裂以及增殖。該試驗結果顯示在14天之后，在瓊脂糖存在下所增殖的細胞比沒有瓊脂糖存在下所增殖的細
胞多出了兩倍，這主要是因為瓊脂糖均勻的分散了細胞，并且為細胞提供了支持性基底。
Hiroyuki Hayashi等人(Hiroyuki Hayashi， Kazutomo Inoue， TunAung等人，Application of a novel B cell line MIN6 to amesh—reinforced polyvinyl alcoholhydrogel tube and three layeragarose microcapsules :An in vitro study, CellTransplantation5(1996)S65-S69)描述了瓊脂糖在制備三層凝膠膠囊中的用途，所述的膠囊被用來植入到B細胞線MIN6中。該研究結果顯示植入的B細胞線MIN6具有比未被植入的MIN6高出兩倍的胰島素分泌速度。 Stellan Hjerten (Stellan Hjerten， The preparation of agarosespheresfor chromatography of molecules and particles, BiochimiaEt Biophysica Acta,79(1964)393-398)描述了瓊脂糖在反懸浮液凝膠化方法中的乳化，其使用攪拌器乳化。
已經提出將使用噴嘴的噴涂方法(A. M. Egorev， A. Kh. Vakhabov和V. Ya.Chernyak， Isolation of agarose and grMulation of agar Mdagarose gel，Journal of chromatography. 46 (1970) 143-148 ; 以及S. Bengtsson禾口 LPhilipsson，Chromatography of animal viruses onpearl_condensed agar, Biochimia EtBiophysicaActa. 79 (1964) 399-406)用于制備作為分離介質或者活細胞載體的瓊脂糖珠。
但是，這樣的乳液方法已知的缺陷是液滴的粒度不可控制，所制備的乳液具有不均勻的粒度，固化的瓊脂糖凝膠珠具有不均勻的粒度。在分離過程中，小的凝膠珠將聚結在凝膠珠之間的間隙中來提高柱背壓，甚至由于不均勻的粒度而導致不發生分離。當凝膠珠被用來植入細胞時，由于它們不均勻的粒度，每個珠植入了不同數目的細胞中，并且在細胞生長過程中出現不同的增殖速率。另外，具有均勻粒度的瓊脂糖凝膠珠對于研究凝膠性能是非常重要的。不均勻的粒度將導致珠子復雜的特性。另外，在這些傳統的制備方法中，控制所制備的珠子的粒度以及制備小尺寸的例如低于大約lOym的珠子是非常困難的。
CN200410000087. 9描述了使用傳統多微孔隔膜乳化來制備具有可控的均勻粒度的瓊脂糖凝膠珠(下文所示的使用傳統的隔膜乳化法來制備瓊脂糖凝膠珠)。該傳統的隔膜乳化能夠產生均勻尺寸的粒子。在這種方法中，選擇不同孔徑的隔膜來制備粒度范圍為3-60 m的珠子。具有更小的粒度例如小于10 m粒度的瓊脂糖凝膠珠是用具有相應的小孔徑的隔膜來制備的。乳化速率在高氮氣壓力時是非常緩慢的。增高的壓力能夠將乳化速率提高到某種程度，但是太高的壓力表現出降低了珠子的粒度均勻性。當珠子具有高的瓊脂糖含量時，高壓力導致了珠子粒度分布顯著變寬。這被認為是這種傳統方法在某些應用中的基本缺陷，在所述的應用中高瓊脂糖含量和小粒度都是重要的。 在色譜分離和生物分子凈化過程中，分離介質能夠經受住高流速是一個優勢。因此，與廣泛用于生物分離領域中的瓊脂糖介質相關的某些問題是已知的。作為公知的，瓊脂糖凝膠結構是通過氫鍵的相互作用而形成的。在凝膠態，多糖鏈將通過鏈間交錯的氫鍵而形成多孔的網狀結構。這種通過非共價結構而形成的凝膠具有低的機械強度，并因此不能經受住非常高的流速。使用兩種方法提高瓊脂糖凝膠珠的強度。 US4665164( Per-Ake Pernemalm， Mats Lindgren禾口 G。ran Lindgren。 1984。Polysaccharide crosslinked separation material and itspr印aration)涉及將化學交聯，即共價鍵，引入到多糖鏈的羥基基團之間來提高該凝膠的機械強度。以一種恒定的交聯密度，一種可選擇的方法是通過提高水相中的瓊脂糖溶液濃度，來提高凝膠珠中的瓊脂糖含量。但是，隨著瓊脂糖水溶液濃度的升高，它的粘度也升高了。在使用傳統的隔膜乳化方法來制備瓊脂糖凝膠珠的情況中，水性粘度的升高導致了乳液制備加工困難。由于水性的高粘度，所形成的液滴非常難以從隔膜表面分離。在這里形成小尺寸液滴的情況中，在長時間的乳化加工之后，這些液滴將堵塞隔膜孔。該試驗結果顯示當使用傳統的多微孔隔膜乳化方法來制備小粒度和高瓊脂糖含量的凝膠珠時，水相的高粘度導致了甚至在高壓時緩慢的W/0乳液制備加工。
發明內容
在第一方面，本發明涉及一種制備瓊脂糖凝膠珠的方法，該方法避免了一種或多種上面所討論的缺陷。該方法在一個或多個附加的權利要求中進行定義。
本發明的一個特定方面是一種上述的方法，其產生了小粒度的瓊脂糖凝膠珠，例如平均粒度小于10ym。在另一方面，本發明涉及一種制備瓊脂糖珠的方法，其中瓊脂糖含量高達20wt^ (基于總珠重量)。 在另外一方面，本發明涉及一種小粒度的瓊脂糖凝膠珠。在一種特定的實施方案中，這樣的粒子的一個群體將具有低于10ym的平均粒度，和/或均勻粒度。在一方面，本發明提供一個瓊脂糖凝膠珠的群體，其具有小于lOym的平均粒度。在一種特定的實施方案中，所述珠的瓊脂糖含量高達20wt% (基于總珠重量)。
本發明另外的方面和優勢將在下面的詳細說明中呈現。
圖1是一種制備小粒度的瓊脂糖凝膠珠的原理示意圖；
圖2是一種均勻乳液制備裝置的示意圖； 圖3是實施例1所制備的瓊脂糖凝膠珠的光學顯微鏡照片；
圖4是對比例1所制備的瓊脂糖凝膠珠的光學顯微鏡照片；
圖5是對比例2所制備的瓊脂糖凝膠珠的光學顯微鏡照片；
圖6是對比例3所制備的瓊脂糖凝膠珠的光學顯微鏡照片； 圖7是對比例1、2和3以及實施例1所制備的瓊脂糖凝膠珠所測量的粒度分布；
圖8是用不同孔徑的隔膜所制備的瓊脂糖凝膠珠的平均粒度與隔膜孔徑之間的 關系； 圖9是具有不同的瓊脂糖含量的珠子的平均粒度與瓊脂糖溶液濃度之間的關系； 和 圖10是具有不同的瓊脂糖含量的珠子的變異系數與瓊脂糖溶液濃度之間的關 系。
具體實施例方式
簡而言之，本發明使用了一種改進的隔膜乳化方法來制備瓊脂糖珠，該珠子可以 具有相當小的粒度。除非另有規定，否則在本發明的說明書和權利要求中，本發明中的粒度 以ym給出，濃度以wt^給出，溫度以t:給出。本發明現在將進行更詳細的描述。
本發明的第一方面是一種制備瓊脂糖凝膠珠的方法，該方法包含下面的步驟
(a)提供包含瓊脂糖的瓊脂糖水相W ; (b)提供水不混溶的油相0，在其中溶解有至少一種乳化劑；
(c)混合該水相W和油相0來獲得W/0乳液； (d)施加壓力來使該乳液通過疏水的多微孔隔膜，來獲得W/0乳液；禾口
(e)降低該W/0乳液滴的溫度，來形成瓊脂糖凝膠珠。 更明確的，在步驟(a)中，提供了一種瓊脂糖水溶液，其具有一個預設的濃度。該步驟 (a)所提供的溶液將構成本發明方法中的含水相，或者水相，并因此表示為W(用于表示水)。因 此，該瓊脂糖溶液將在水不混溶相中形成含水的小滴。在一種實施方案中，瓊脂糖在這種溶液 中的濃度是0. lwt% -20. 0wt^，更特別的是4. 0-15. Owt% ;例如》6. 0或者> 12. Owt%。
在步驟(b)中提供了油相。該相包含油性物質，在其中溶解/分散了至少一種油 溶性和/或油分散性乳化劑。這種相與水是不混溶的，并因此表示為0(用于表示油)。
在步驟(c)中，提供了水相W和油相O之間的混合來獲得一種乳液。在一種實施
方案中，水相與油相的體積比是i : i到i : iooo，并更特別的是i : 2到i : io。 在步驟(d)中，通過施加壓力來使得所述的乳液，即步驟(c)所提供的乳液，通過 疏水的多微孔隔膜。在一種實施方案中，步驟(d)中的壓力是0.5-3.0kgf/cm2。在一種實 施方案中，使該乳液以相對高的流速通過所述隔膜。在另外一種實施方案中，隔膜是玻璃隔 膜。在一種特定的實施方案中，隔膜是玻璃隔膜，其已經根據公知的方法進行化學處理來賦 予了疏水性。這樣的疏水玻璃隔膜是市售的產品。在另外一種實施方案中，隔膜是由本身 疏水性材料制成的。在上下文中，術語"疏水的"被理解為表示隔膜具有足夠允許制備此處所公開的凝膠珠的疏水性。該隔膜可以具有任何類型的基本孔結構，例如諸如具有彎孔或 者垂直于隔膜表面的直圓柱孔的網狀孔結構。隔膜的形狀可以是例如管狀的、中空纖維的、 平板的或者折疊片的。在一種實施方案中，用于驅使乳液通過隔膜的壓力被設定在一個預 先選擇的值。根據本發明，通過使用預定壓力值的壓力來使得瓊脂糖滴的乳液通過隔膜，可 以獲得具有均勻粒度的W/0乳液。在一種實施方案中，本發明方法中所用的多微孔隔膜的 孔徑是2-50 ii m，例如2-40或者2_30或者甚至2_20 y m。在另外一種實施方案中，所施加 的壓力是0. 5-3. 0kgf/cm2。如同本領域技術人員將認識到的那樣，有利的壓力值將取決于 隔膜孔徑、水相中的瓊脂糖含量和溫度。例如，當使用孔徑為10. 2 ii m的隔膜在低于65t:來 制備瓊脂糖含量為10wt^的珠子時，合適的壓力是1. 0kgf/cm2 ;當使用孔徑為5. 7 ii m的隔 膜在低于65t:來制備瓊脂糖含量為10wt^的珠子時，合適的壓力是2. 5kgf/cm2。在一種實 施方案中，乳液將以0.5-1.5mV2h—工通過多微孔隔膜。因此有利的速率將取決于隔膜孔徑、 水相中瓊脂糖含量、溫度和壓力。當使用孔徑為10. 2 ii m的隔膜在1. 0kgf/cm2來制備瓊脂 糖含量為10wt^的珠子時，乳液生產速率將是大約0. 8m3m—2h—、這意味著該乳化過程是即刻 完成的。 有利的，步驟(c)和(d)是在高于環境溫度的溫度進行的。在一種特定的實施方 案，步驟(c)的操作溫度取決于水相中的瓊脂糖含量以及用于瓊脂糖的原材料。當該原材 料與瓊脂糖類型相同時，所述的溫度取決于水相中的瓊脂糖含量，即，含量越高，溫度越高。 作為一個例子，采用的是高熔點的瓊脂糖。當水相中的瓊脂糖含量是4wt^時，所述溫度 是6(TC ;當水相中的瓊脂糖含量是8wt^時，所述溫度是65t:;當水相中的瓊脂糖含量是 12wt %時，所述溫度是70°C 。在水相中的瓊脂糖含量相同的情況中，所述的溫度取決于瓊脂 糖的類型。作為一個例子，采取的是水相中含量為4wt^的瓊脂糖。在使用低熔點的瓊脂糖 的情況中，所述的溫度是40°C ，而在高熔點瓊脂糖的情況中，所述的溫度是60°C 。
在步驟(e)中，使W/0乳液滴凝固，即擬膠成為瓊脂糖珠。在一種實施方案中，步 驟(e)中的操作溫度是大約15°C。 如同將要在下面更詳細討論的那樣，本發明方法可以用來制備小粒度的瓊脂糖 珠。這樣的珠子例如作為色譜填料，例如在凝膠過濾方法中是有用的。 在本發明方法的一種特定的實施方案中，增加了一種另外的步驟，其包含在步驟
(e)之后，將官能度加入到凝固的瓊脂糖珠中。本領域技術人員充分的知曉加入這樣的官能
度的方法，該官能度可以是例如帶電的基團，用于離子交換色譜法中所用的珠子。 作為一個通用的例子，一種疏水玻璃的化學修飾表面可以用作本發明方法的多微
孔隔膜。將油相和水相進行均化和乳化，或者高溫混合來獲得W/0乳液；使該乳液在高壓下
快速的通過多微孔隔膜來降低乳液中液滴的尺寸。將它重復乳化來獲得具有均勻粒度的乳
液。將乳液冷卻和凝固來獲得具有均勻粒度的瓊脂糖珠。本發明新穎的隔膜乳化方法可以
用來制備具有均勻尺寸并且粒度小于lOym的瓊脂糖珠。當瓊脂糖濃度高到20wt^時，所
獲得的珠子有利的仍然將具有高的粒度均勻性。本發明可以用來制備平均粒度小于10 ym
的、均勻粒度和高瓊脂糖含量的珠子的群體，以及還用來通過選擇不同的隔膜孔徑來控制
所獲得的珠子的平均粒度。 在本發明的一種特定的實施方案中，制備方法包括下面的步驟
(a)將瓊脂糖加熱和溶解在蒸餾水中，來獲得用作水相的溶液。
(b)將至少一種乳化劑溶解在水不混溶的油相中，并優選進行預熱。
(c)將水和油相快速混合、均化和乳化，然后機械攪拌來獲得W/0乳液。
(d)將該乳液在高溫和高壓下快速通過疏水的多微孔隔膜來獲得具有基本均勻的
液滴尺寸的W/0乳液。為了獲得甚至更均勻的液滴尺寸，可以將每次所獲得的乳液用作乳
液來重復的通過隔膜孔； (e)將該乳液轉移到冷卻裝置中，在慢速攪拌和低于15t:的溫度下進行冷卻，以 使得乳液滴凝固成具有基本均勻尺寸的凝膠的瓊脂糖珠。在有利的條件下，將該瓊脂糖凝 膠珠的粒度分布系數控制在15%以下，并且通過隔膜孔徑來將粒度控制在l-lOym(不包 括10 ii m)。 根據本發明，乳化方法可以在高于環境溫度進行，因為不同濃度的瓊脂糖溶液具 有不同的凝固溫度和不同的隔膜乳化溫度。濃度越高，該溫度越高。雖然瓊脂糖溶液具有 相同的濃度和不同的凝固溫度，但是當它用作水相來快速通過隔膜進行乳化時，它仍然需 要不同的溫度。在相同濃度的水相的情況中，低熔點的瓊脂糖需要低的溫度，高凝固溫度的 瓊脂糖需要高的溫度。 在一種有利的實施方案中，本發明方法中的壓力是相對高的。合適的壓力將取決 于隔膜孔徑、水相中的瓊脂糖含量和溫度。例如，當使用孔徑為10. 2 i！ m的隔膜在低于65°C 來制備瓊脂糖含量為10wt%的珠子時，該壓力是1. 0kgf/cm2 ;當使用孔徑為5. 7 m的隔膜 在低于65t:來制備瓊脂糖含量為10wt^的珠時，該壓力是2. 5kgf/cm2。
本發明的方法可以用來制備瓊脂糖凝膠珠，該凝膠珠用于分離和凈化化學活性物 質或者用作包封細胞和藥物的載體。該珠的尺寸可以小于10ym，和/或瓊脂糖含量高到 20wt%。因此，本發明方法的一個優點是均勻的粒度是受控的。因此，本發明解決了這樣的 問題，即，傳統的隔膜乳化方法不能獲得均勻和可控的粒度以及不能制備小粒度和高瓊脂 糖含量的珠子的問題，并且本發明的方法能夠用來快速制備相當小的珠子，例如粒度小于 10 ii m的珠子，和/或瓊脂糖濃度高到20wt%的珠子。 本發明的第二方面是如上所述來制備的至少一種瓊脂糖珠。在一種特定的實施方 案中，本發明的這個方面是一種小粒度的瓊脂糖凝膠珠。在上下文中，術語"小"粒度表示 在這樣的珠群體中，平均粒度低于lOym。在另外一種實施方案中，本發明的珠群體將具有 基本上均勻的粒度。在一種特定的實施方案中，所述珠子的瓊脂糖含量高到20wt^ (基于 總珠重量)。更明確的，根據下式所計算的變異系數不大于15% :
C.V. = {[E (di-d)7N]"7d) X100% 其中C. V.是變異系數，&是珠直徑，d是數均粒度，N是用于粒度計算的珠子數， 并且N > 200。 本發明中所采用的多微孔隔膜的孔徑可以是如上所述的例如2-20 ii m，并且所制 備的珠子的平均粒度與所采用的隔膜孔徑是線性相關的。因此具有所需粒度的瓊脂糖珠可 以通過改變隔膜孔徑來制備。 本發明的一些優點如下。本發明的制備方法可以用來制備用作生物分離介質的瓊 脂糖凝膠珠，還可以用來制備用作活細胞或者基因的載體的瓊脂糖凝膠珠，所述的載體用 來提供有助于細胞增殖的小環境和紅細胞漿質處理效應以及有效的避免紅細胞漿質淋巴 球的識別和免疫排斥。
此外，由于所具有的均勻粒度，本發明的凝膠珠被用作分離介質來有效的提高分 離效應和分離不能用通常的介質進行分離的化學活性物質。 另外，本發明可以提供了具有不同瓊脂糖含量的凝膠珠。該凝膠珠可以用來有效 的研究具有不同孔徑和不同尺寸的大分子物質，例如蛋白質，核酸等與它們的分離效應之 間的關系，并且尋找最適孔徑的凝膠珠來分離不同的物質。本發明的制備方法可以用來容 易的制備難以用傳統乳化方法制備的高瓊脂糖含量的凝膠珠，以獲得具有高機械強度的和 在高壓快速分離化學活性物質的凝膠珠。 本發明的制備方法使用溫和的條件。作為活性物質例如活細胞等的載體，所述的 珠被期望保持它的化學活性和化學穩定性。作為細胞和藥物載體，所述的珠確保了植入物 質的均勻分布以及快速和正確的隨后分離。本發明需要簡單的試驗裝置，并且不使用泵或 者攪拌器來產生連續相的流動，并且具有這樣的特征如容易的按比例使用的方法，和簡單 的制備方法，容易的操作控制和快的乳液形成。 在第三方面，本發明涉及一種色譜柱，其填充有此處所述的瓊脂糖珠。該色譜柱可 以用于下列物質的分離、離析或者凈化方法中有機和/或生物物質和成分，例如蛋白質， 例如抗體或者其碎片或者融合蛋白質，縮氨酸，核酸，例如質體，病毒，細胞，脂質等等。該 色譜柱可以用于例如凝膠過濾中，或者離子交換方法，這取決于本發明所制備的瓊脂糖珠 的實際性能。在一個可選擇的方面，官能化來制備用于下面的色譜介質疏水交互色譜法 (HIC);混合的或者多模式色譜法；或者親合色譜法。
附圖詳細說明 圖1是一種制備根據本發明的具有小粒度的瓊脂糖凝膠珠的原理示意圖。更明確 的，將瓊脂糖的熱水溶液與熱的油相進行混合，使用攪拌機制備了初始的w/o乳液。然后驅 使該乳液通過隔膜來獲得具有均勻尺寸滴的乳液。 圖2表示了一種均勻乳化制備裝置的示意圖。在圖2中，附圖標記表示如下l-氮 氣入口 ；2-壓力表；3-排氣閥；4-絕熱層；5-乳液存儲槽；6-排氣閥；7-隔膜；8-均勻乳液
收集器。 圖3表示了一種實施例1所制備的瓊脂糖凝膠珠的光學顯微鏡照片。獲得了一種 5. 1微米平均直徑的均勻尺寸的珠子。在圖3中，lcm對應于50微米。
圖4表示了一種對比例1所制備的瓊脂糖凝膠珠的光學顯微鏡照片。通過攪拌器 乳化來制備大的多分散性珠子。在圖4中，lcm對應于50微米。 圖5表示了一種對比例2所制備的瓊脂糖凝膠珠的光學顯微鏡照片。通過攪拌器 乳化來制備大的多分散性珠子。在圖5中，lcm對應于50微米。 圖6表示了一種對比例3所制備的瓊脂糖凝膠珠的光學顯微鏡照片。獲得了通過 傳統的隔膜乳化制備的平均直徑為3.7微米，C.V.為18%的珠子。在圖6中，lcm對應于 50微米。 圖7表示了所測量的對比例1、2和3和實施例1所制備的瓊脂糖凝膠珠的粒度分 布。X軸表示瓊脂糖珠的尺寸/(微米)，Y軸表示體積(％)。在圖7，曲線l-對比例3，曲 線2-實施例1，曲線3-對比例2，曲線4-對比例1。 圖8表示了用不同孔徑的隔膜所制備的瓊脂糖凝膠珠的平均粒度(瓊脂糖珠的平 均直徑/(微米)表示在Y軸上)與隔膜孔徑(隔膜孔尺寸/(微米)表示在X軸上)之間的關系。如該圖所示，獲得了斜率為0. 46的一種線性關聯:y = 0. 46x+0. 5569，R2 = 0. 9878。
圖9表示了不同的瓊脂糖含量所制備的珠子的平均粒度與該瓊脂糖溶液濃度之 間的關系。X軸表示了水相中的瓊脂糖濃度，而Y軸表示了瓊脂糖珠的數均直徑/ (微米)。 如該圖所示，粒度不明顯的取決于瓊脂糖濃度。 圖10表示了不同的瓊脂糖含量所制備的珠子的粒度變異系數與該瓊脂糖溶液濃 度之間的關系。X軸表示了水相中的瓊脂糖濃度，而Y軸表示C.VWOO。如該圖所示，依照 本發明，可以獲得C.V.為10%，并且具有至少高到20%的瓊脂糖濃度的珠子。
試驗部分 本發明所提供的瓊脂糖珠制備方法將使用實施例來描述。下面的實施例僅僅是作 為說明性目的而提供的，并且其不應當被解釋為對由附加的權利要求所定義的本發明的限 制。 瓊脂糖凝膠珠是按照圖1所示步驟如下來制備的。
1)W/0乳液制備 將瓊脂糖、NaCl和其他添加劑加入到水中，并在加熱下充分溶解來形成用作水相 的混合物，將一種油溶性乳化劑溶解在油性流體中，并且加熱到一定的溫度來形成用作油 相的混合物。將水和油相快速混合和均化以及乳化或者攪拌來獲得W/0乳液，將該乳液在 高溫和高壓下通過疏水多微孔隔膜來獲得具有均勻粒度的W/0乳液。所述的方法在圖2所 示的裝置中完成。將該乳液轉移到冷卻裝置中，并在緩慢攪拌下冷卻到低于15°C ，以使得乳 液滴凝固成均勻尺寸的瓊脂糖凝膠珠。 瓊脂糖溶液可以制備成所需的濃度。不同濃度的瓊脂糖溶液需要不同的隔膜乳化 溫度，因此可以選擇所需的濃度。在細胞或者藥物載體的制備過程中，將瓊脂糖在高溫溶 解，并冷卻到這樣的溫度，該溫度對于細胞或者藥物來說是可以忍受的，但是該溫度不低到 足以產生瓊脂糖溶液凝固的溫度。將該溶液與細胞或者藥物充分混合，并用作水相。水相 添加劑可以包括對人體無害的水溶性物質，例如清蛋白、卵磷脂、葡萄糖、甘露醇等等。油相 在環境溫度時是液體，并且是水不溶性油性物質，因此液體石蠟和石油醚、橄欖油、棉花籽 油、豆油、向日葵籽油或者其他烷烴，或者它們的混合物可以用作油相。優選的油相通常具 有高的沸點和低的揮發性。油性乳化劑必須溶解在該油相中，因此可以使用脫水山梨糖醇 倍半油酸酯(Arlacel83)，甘油醚聚合物(例如Sakamoto YakuhinKogyo Co Ltd. P0_500， P0-310)，聚乙二醇氫化蓖麻油，脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)，脫水山梨糖醇單油酸酯 (Span 80)，脫水山梨糖醇三硬脂酸酯(Span 65)或者親脂_親水嵌段聚合物的油性乳化
劑。油相中的乳化劑的濃度是o.5-i.Owt^，并且水相與油相的體積比是i : i-i : iooo。 2)瓊脂糖凝膠珠的制備 將步驟1)中所獲得的乳液轉移到冷卻裝置中，并且在緩慢攪拌下冷卻到低于 15°C，以使得該乳液滴凝固。將所獲得的凝膠珠存儲在蒸餾水中。 在凝膠的凝固過程中，溫度以低于2°C /min的速度緩慢降低，并且緩慢進行攪拌， 攪拌速度是50-200rpm。 在乳液滴凝固之后，將所獲得的凝膠珠依次用石油醚、乙醇、蒸餾水清洗(在用作 細胞載體的情況中，不能使用丙酮或者乙醇來清洗它)，并將所獲得的凝膠存儲在環境溫度 或者低溫的蒸餾水或者細胞培養流體中。
實施例1 將孔徑為10. 2 m的疏水隔膜浸泡到親脂性物質中來完全潤濕多孔隔膜，并在該 隔膜上徹底鋪展疏水鏈。將瓊脂糖和NaCl正確的稱量到水中來確保瓊脂糖濃度為10wt%， NaCl濃度為0. 9wt%。將它們加熱和完全溶解在水中來形成溶液，將該溶液保持在低于 65t:。將油溶性乳化劑P0-500加入到16ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為7 : 5) 中來確保濃度為4wt^，攪拌直到它們徹底溶解來形成用作油相的混合物，并加熱到65°C。 在加熱下，將大約4g的水相和油相在6000rpm進行混合和均化以及乳化30秒，然后將所 獲得的乳液快速轉移到預熱到65t:的隔膜乳化裝置中，并以1. 0kgf/cm2快速通過具有均 勻孔徑的疏水多微孔隔膜來獲得具有均勻粒度的W/0乳液。使所獲得的乳液作為乳液以 1. 0kgf/cm2通過疏水隔膜，以使它能夠被乳化三次。乳化后，將該乳液轉移到冷卻裝置，并 且在空氣中在50rpm的攪拌速度攪拌下緩慢冷卻到室溫，然后加入少量的冰到水浴中來持 續的將乳液冷卻到低于15°C，以使瓊脂糖乳液滴凝固。過濾所獲得的凝膠珠，用石油醚、乙 醇和蒸餾水依次清洗，并存儲在蒸餾水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E 中測量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直徑為5. llym，C.V.是9.8%，圖 3所示的光學顯微鏡照片中的珠子具有均勻的粒度。
對比例1 (機械攪拌方法) 類似于實施例1的程序，將瓊脂糖和NaCl正確的稱量到水中來確保瓊脂糖濃度為 10wt%， NaCl濃度為0. 9wt%。將它們加熱和完全溶解在水中來形成溶液，將該溶液保持 在低于65°C。將油溶性乳化劑P0-500加入到20ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積 比為7 : 5)中來確保濃度為4wt^，攪拌直到它們徹底溶解來形成用作油相的混合物，并 加熱到65°C 。在加熱下，將大約6g的水相轉移到油相，并在1000rpm攪拌30分鐘來獲得 W/0乳液，將其快速轉移到冷卻裝置，并且在空氣中在50rpm的攪拌速度攪拌下緩慢冷卻到 室溫，然后加入少量的冰到水浴中來持續的將乳液冷卻到低于15°C，以使瓊脂糖乳液滴凝 固。過濾所獲得的凝膠珠，用石油醚、乙醇和蒸餾水依次清洗，并存儲在蒸餾水中。在Laser ParticleSizer Mastersizer 2000E中測量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平 均直徑為15.34iim，C.V.是115.97%，圖4所示的光學顯微鏡照片中的珠子具有不均勻的 粒度。 對比例2(均乳化方法) 類似于實施例1的程序，將瓊脂糖和NaCl正確的稱量到水中來確保瓊脂糖濃度 為10wt%， NaCl濃度為0. 9wt%。將它們加熱和完全溶解在水中來形成溶液，將該溶液保 持在低于65°C。將油溶性乳化劑P0-500加入到16ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體 積比為7 : 5)中來確保濃度為4wt^，攪拌直到它們徹底溶解來形成用作油相的混合物， 并加熱到65°C 。在加熱下，將大約6g的水相轉移到油相，并在6000rpm攪拌60秒來獲得 W/0乳液，將其快速轉移到冷卻裝置，并且在空氣中在50rpm的旋轉速度攪拌下緩慢冷卻到 室溫，然后加入少量的冰到水浴中來持續的將乳液冷卻到低于15°C，以使瓊脂糖乳液滴凝 固。過濾所獲得的凝膠珠，用石油醚、乙醇和蒸餾水依次清洗，并存儲在蒸餾水中。在Laser ParticleSizer Mastersizer 2000E中測量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平 均直徑為15.48iim， C.V.是84.34%，圖5所示的光學顯微鏡照片中的珠子具有不均勻的 粒度。
對比例3 (傳統隔膜乳化方法) 將孔徑為1. 4 m的疏水隔膜浸泡到親脂性物質中來完全潤濕多孔隔膜，并在該 隔膜上徹底鋪展疏水鏈。將瓊脂糖和NaCl正確的稱量到水中來確保瓊脂糖濃度為10wt%， NaCl濃度為0. 9wt%。將它們加熱和完全溶解在水中來形成溶液，將該溶液保持在低于 65t:。將油溶性乳化劑P0-500加入到60ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為7 : 5) 中來確保濃度為4wt % ，攪拌直到它們徹底溶解來形成用作油相的混合物，并加熱到65°C 。 在加熱下，將大約6g的水相轉移到預熱到65t:的隔膜乳化裝置中的油相中，并以0. 75kgf/ cm2緩慢通過具有均勻孔徑的疏水多微孔隔膜，并進入油相來獲得具有均勻粒度的W/0乳 液。使所獲得的乳液轉移到冷卻裝置，并且在空氣中在50rpm的攪拌速度攪拌下緩慢冷卻 到室溫，然后加入少量的冰到水浴中來持續的將乳液冷卻到低于15°C，以使瓊脂糖乳液滴 凝固。過濾所獲得的凝膠珠，用石油醚、乙醇和蒸餾水依次清洗，并存儲在蒸餾水中。在 Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E中測量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠 子的平均直徑為3. 69 i！ m，C. V.是17. 97%，圖6所示的光學顯微鏡照片中的珠子具有不均 勻的粒度。 對實施例1和對比例1、2和3所制備的瓊脂糖凝膠珠的粒度分布進行對比，如圖 7所示，使用快速隔膜乳化方法所獲得的珠子具有最均勻的粒度。
實施例2 將孔徑為5. 7 ii m的疏水隔膜浸泡到親脂性物質中來完全潤濕多孔隔膜，并在該 隔膜上徹底鋪展疏水鏈。將瓊脂糖和NaCl正確的稱量到水中來確保瓊脂糖濃度為10wt%， NaCl濃度為0. 9wt%。將它們加熱和完全溶解在水中來形成溶液，將該溶液保持在低于 65t:。將油溶性乳化劑P0-500加入到16ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為7 : 5) 中來確保濃度為4wt^，攪拌直到它們徹底溶解來形成用作油相的混合物，并加熱到65°C。 在加熱下，將大約4g的水相和油相在6000rpm進行混合和均化以及乳化30秒，然后將所 獲得的乳液快速轉移到預熱到65t:的隔膜乳化裝置中，并以2. 5kgf/cm2快速通過具有均 勻孔徑的疏水多微孔隔膜來獲得具有均勻粒度的W/0乳液。使所獲得的乳液作為乳液以 2.5kgf/cn^通過疏水隔膜，以使它能夠被乳化三次。乳化后，將該乳液轉移到冷卻裝置，并 且在空氣中在50rpm的攪拌速度攪拌下緩慢冷卻到室溫，然后加入少量的冰到水浴中來持 續的將乳液冷卻到低于15t:，以使瓊脂糖乳液滴凝固。過濾所獲得的凝膠珠，用石油醚、乙 醇和蒸餾水依次清洗，并存儲在蒸餾水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E 中測量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直徑為3.06iim，C.V.是19. 18%。
實施例3 將孔徑為15 ii m的疏水隔膜浸泡到親脂性物質中來完全潤濕多孔隔膜，并在該隔 膜上徹底鋪展疏水鏈。將瓊脂糖和NaCl正確的稱量到水中來確保瓊脂糖濃度為10wt%， NaCl濃度為0. 9wt%。將它們加熱和完全溶解在水中來形成溶液，將該溶液保持在低于 65°C 。將油溶性乳化劑PO-500加入到16ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為7 : 5) 中來確保濃度為4wt^，攪拌直到它們徹底溶解來形成用作油相的混合物，并加熱到65°C。 在加熱下，將大約4g的水相和油相在6000rpm進行混合和均化以及乳化30秒，然后將所 獲得的乳液快速轉移到預熱到65t:的隔膜乳化裝置中，并以0. 8kgf/cm2快速通過具有均 勻孔徑的疏水多微孔隔膜來獲得具有均勻粒度的W/0乳液。使所獲得的乳液作為乳液以
110.8kgf/cn^通過疏水隔膜，以使它能夠被乳化三次。乳化后，將該乳液轉移到冷卻裝置，并 且在空氣中在50rpm的旋轉速度攪拌下緩慢冷卻到室溫，然后加入少量的冰到水浴中來持 續的將乳液冷卻到低于15t:，以使瓊脂糖乳液滴凝固。過濾所獲得的凝膠珠，用石油醚、乙 醇和蒸餾水依次清洗，并存儲在蒸餾水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E 中測量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直徑為7. 66 ii m， C. V.是6. 72% 。
實施例4 將孔徑為19 ii m的疏水隔膜浸泡到親脂性物質中來完全潤濕多孔隔膜，并在該隔 膜上徹底鋪展疏水鏈。將瓊脂糖和NaCl正確的稱量到水中來確保瓊脂糖濃度為10wt%， NaCl濃度為0. 9wt%。將它們加熱和完全溶解在水中來形成溶液，將該溶液保持在低于 65t:。將油溶性乳化劑P0-500加入到16ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為7 : 5) 中來確保濃度為4wt^，攪拌直到它們徹底溶解來形成用作油相的混合物，并加熱到65°C。 在加熱下，將大約4g的水相和油相在6000rpm進行混合和均化以及乳化30秒，然后將所 獲得的乳液快速轉移到預熱到65t:的隔膜乳化裝置中，并以0. 6kgf/cm2快速通過具有均 勻孔徑的疏水多微孔隔膜來獲得具有均勻粒度的W/0乳液。使所獲得的乳液作為乳液以 0.6kgf/cn^通過疏水隔膜，以使它能夠被乳化三次。乳化后，將該乳液轉移到冷卻裝置，并 且在空氣中在50rpm的旋轉速度攪拌下緩慢冷卻到室溫，然后加入少量的冰到水浴中來持 續的將乳液冷卻到低于15t:，以使瓊脂糖乳液滴凝固。過濾所獲得的凝膠珠，用石油醚、乙 醇和蒸餾水依次清洗，并存儲在蒸餾水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E 中測量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直徑為9.02iim，C.V.是14.66%。 圖8表示了實施例1、2、3和4所制備的珠子的平均粒度與隔膜孔徑之間的關系。從圖8中 可以看到平均粒度與隔膜孔徑具有線性關系，并且平均珠尺寸大約是隔膜孔徑的0. 46倍。
實施例5 將孔徑為10. 2 i！ m的疏水隔膜浸泡到親脂性物質中來完全潤濕多孔隔膜，并在該 隔膜上徹底鋪展疏水鏈。將瓊脂糖和NaCl正確的稱量到水中來確保瓊脂糖濃度為4wt%， NaCl濃度為0. 9wt%。將它們加熱和完全溶解在水中來形成溶液，將該溶液保持在低于 65t:。將油溶性乳化劑P0-500加入到16ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為7 : 5) 中來確保濃度為4wt^，攪拌直到它們徹底溶解來形成用作油相的混合物，并加熱到65°C。 在加熱下，將大約4g的水相和油相在6000rpm進行混合和均化以及乳化30秒，然后將所 獲得的乳液快速轉移到預熱到65t:的隔膜乳化裝置中，并以1. 0kgf/cm2快速通過具有均 勻孔徑的疏水多微孔隔膜來獲得具有均勻粒度的W/0乳液。使所獲得的乳液作為乳液以 1.0kgf/cn^通過疏水隔膜，以使它能夠被乳化三次。乳化后，將該乳液轉移到冷卻裝置，并 且在空氣中在50rpm的攪拌速度攪拌下緩慢冷卻到室溫，然后加入少量的冰到水浴中來持 續的將乳液冷卻到低于15t:，以使瓊脂糖乳液滴凝固。過濾所獲得的凝膠珠，用石油醚、乙 醇和蒸餾水依次清洗，并存儲在蒸餾水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E 中測量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直徑為5.66iim，C.V.是11.66%。
實施例6 將孔徑為10. 2 i！ m的疏水隔膜浸泡到親脂性物質中來完全潤濕多孔隔膜，并在該 隔膜上徹底鋪展疏水鏈。將瓊脂糖和NaCl正確的稱量到水中來確保瓊脂糖濃度為8wt%， NaCl濃度為0. 9wt%。將它們加熱和完全溶解在水中來形成溶液，將該溶液保持在低于65t:。將油溶性乳化劑P0-500加入到16ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為7 : 5) 中來確保濃度為4wt^，攪拌直到它們徹底溶解來形成用作油相的混合物，并加熱到65°C。 在加熱下，將大約4g的水相和油相在6000rpm進行混合和均化以及乳化30秒，然后將所 獲得的乳液快速轉移到預熱到65t:的隔膜乳化裝置中，并以1. 0kgf/cm2快速通過具有均 勻孔徑的疏水多微孔隔膜來獲得具有均勻粒度的W/0乳液。使所獲得的乳液作為乳液以 1.0kgf/cn^通過疏水隔膜，以使它能夠被乳化三次。乳化后，將該乳液轉移到冷卻裝置，并 且在空氣中在50rpm的攪拌速度攪拌下緩慢冷卻到室溫，然后加入少量的冰到水浴中來持 續的將乳液冷卻到低于15t:，以使瓊脂糖乳液滴凝固。過濾所獲得的凝膠珠，用石油醚、乙 醇和蒸餾水依次清洗，并存儲在蒸餾水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E 中測量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直徑為5.09iim，C.V.是12.06%。
實施例7 將孔徑為10. 2 ii m的疏水隔膜浸泡到親脂性物質中來完全潤濕多孔隔膜，并在該 隔膜上徹底鋪展疏水鏈。將瓊脂糖和NaCl正確的稱量到水中來確保瓊脂糖濃度為20wt%， NaCl濃度為0. 9wt%。將它們加熱和完全溶解在水中來形成溶液，將該溶液保持在低于 65t:。將油溶性乳化劑P0-500加入到16ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為7 : 5) 中來確保濃度為4wt^，攪拌直到它們徹底溶解來形成用作油相的混合物，并加熱到65°C。 在加熱下，將大約4g的水相和油相在6000rpm進行混合和均化以及乳化30秒，然后將所 獲得的乳液快速轉移到預熱到8(TC的隔膜乳化裝置中，并以1. 4kgf/cm2快速通過具有均 勻孔徑的疏水多微孔隔膜來獲得具有均勻粒度的W/0乳液。使所獲得的乳液作為乳液以 1.4kgf/cn^通過疏水隔膜，以使它能夠被乳化三次。乳化后，將該乳液轉移到冷卻裝置，并 且在空氣中在50rpm的攪拌速度攪拌下緩慢冷卻到室溫，然后加入少量的冰到水浴中來持 續的將乳液冷卻到低于15t:，以使瓊脂糖乳液滴凝固。過濾所獲得的凝膠珠，用石油醚、乙 醇和蒸餾水依次清洗，并存儲在蒸餾水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E 中測量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直徑為5. 70iim，C. V.是10. 22%。 圖9和10表示了不同濃度的瓊脂糖凝膠珠的平均粒度和粒度分布系數與濃度之間的關系。 當瓊脂糖濃度高到20wt^時，瓊脂糖能夠用來獲得具有均勻粒度的瓊脂糖凝膠珠。
權利要求
一種制備瓊脂糖凝膠珠的方法，該方法包含下面的步驟(a)提供包含瓊脂糖的瓊脂糖水相W；(b)提供水不混溶的油相O，在其中溶解有至少一種乳化劑；(c)混合該水相W和油相O來獲得W/O乳液；(d)施加壓力來使該乳液通過疏水的多微孔隔膜，來獲得W/O乳液；和(e)降低該W/O乳液滴的溫度，直到形成瓊脂糖凝膠珠。
2. 根據權利要求l的方法，其中步驟(d)中的壓力是0.5-3.0kgf/cm2。
3. 根據權利要求1或者2的方法，其中在步驟(d)中，乳液通過多微孔隔膜的流速是 0. 5-1. 5m3m—2h—、
4. 根據任何一個前述權利要求的方法，其中多微孔隔膜的孔徑是2-20ym。
5. 根據任何一個前述權利要求的方法，其中在步驟(a)中，瓊脂糖的濃度是 0. lwt% -20. Owt%。
6. 根據任何一個前述權利要求的方法，其中步驟(a)、 (c)和(d)是在加熱下進行的。
7. 根據任何一個前述權利要求的方法，其中步驟(d)產生了粒度基本上均勻的瓊脂糖 凝膠珠。
8. 根據權利要求1-7中任何一個的方法，其包括步驟將官能度例如帶電基團加入到 獲自步驟(e)的瓊脂糖凝膠珠中。
9. 根據權利要求1-7中任何一個所制備的瓊脂糖凝膠珠，其中其的平均粒度小于 10 li m。
10. 根據權利要求9的瓊脂糖凝膠珠，其中粒度分布的變異系數小于15%，該變異系數下式計算C.V. = {[E (di-d)7N]"2M X100% 其中c.v.是變異系數， di是珠直徑， d是數均粒度，N是用于粒度計算的珠子數，并且N > 200。
11. 一種色譜柱，其包含根據權利要求9-10中任意一個的瓊脂糖凝膠珠。
12. 權利要求ll的色譜柱在凝膠過濾中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種制備瓊脂糖珠的方法，該方法產生了具有相對均勻粒度的珠子的群體。在一種有利的實施方案中，所述珠子的粒度小于10μm，并且所述群體的變異系數C.V.小于15％。本發明的珠子能夠有利的用于生物分離方法中，例如用于色譜填料的制造中；用于藥物載體中；或者用于任何的生物工程方法中。
文檔編號B01J13/08GK101715364SQ200880013745
公開日2010年5月26日 申請日期2008年4月21日 優先權日2007年4月25日
發明者周青竹, 蘇志國, 馬光輝 申請人:通用電氣健康護理生物科學股份公司;中國科學院工藝研究所