專利名稱：：同時制備淫羊藿苷、朝藿定a、b、c化學對照品的方法
技術領域：
：本發明涉及一種同時制備淫羊藿苷、朝藿定A、B、C化學對照品的分離制備新方法。主要包括柱分離濃縮富集以及快速的高效液相制備方法除雜及精制。四種對照品的結構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>RlR2R3朝藿定A:rha-(l-2)glugluCH3朝藿定B:rha-(l-2)xylgluCH3朝藿定C:rha-(l-2)rhagluCH3淫羊藿武rhagluCH
背景技術：
：淫羊藿(HerbaEpimedii)是我國使用最為悠久的中藥之一，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效。現代研究表明，淫羊藿具有抗骨質疏松、增強性功能、增加心腦血管血流量等多方面藥理作用。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，也是我國2005版國家藥典中淫羊藿藥材的含量測定成分；而朝藿定A、B、C是淫羊藿苷的糖基取代類似物且同屬于千分之一級的高含量成分(張華峰等，分析測試學報，2007，26(2):198-201;謝娟平等，中草藥，2007，38(4):613-614)，因此，對淫羊藿藥材同時進行朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的多指標測定具有重要意義。但是，作為質控指標成分，必須有大量的化學對照品提供，目前，除淫羊藿苷外，其它三種對照品市場上少有提供。對于對照品的制備方法研究，目前主要集中在淫羊藿苷和朝藿定C的分離純化上(胡云峰等，中國專利CN200510061251.1，2007年公開；郭寶林等，中國專利CN2007100002610.5，2007年公開；王曉春等，中國專利CN200610101222.5，2007年公開)，而朝藿定A和B的分離制備幾乎沒有報道。
發明內容本發明在前期研究淫羊藿苷和朝藿定C的規模化制備基礎上，通過原料藥優選、目標對照品富集方法研究及對照品精制高效液相方法開發等多方面研究，本發明提供了一種低成本、快速的高效液相制備色譜方法，可以同時制備純度大于98%的朝藿定A、B、C和淫羊藿苷，并且單一對照品制備規模可達lg/月，累計制備規模可達月產5g對照品。為實現上述目的，本發明采用的技術方案同時制備淫羊藿苷、朝藿定A、B、C化學對照品的方法，以質量含量為10%_50%的淫羊藿苷提取物為原料，經初步柱分離，以制備型高效液相色譜為主要分離手段，通過兩步高效液相制備，提取液直接減壓濃縮至干即可獲得純度大于98%的相應對照品，規模為每個對照品月產量1克，累計月產5g對照品；具體步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用水或體積濃度40-80%乙醇水溶液溶解，樹脂柱或聚酰胺柱分離，乙醇-水溶液梯度洗脫，其中乙醇的體積濃度從0%_100%變化，收集20%_80%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I;2)第一步高效液相制備黃色粉末I用體積濃度40-80%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為50150mg/ml的供試品溶液，經0.45iim微孔濾膜過濾；采用柱長10-50cm、直徑l-10cm的高效液相制備色譜柱進行分離，六通閥或泵進樣，進樣體積為l-50ml，以體積濃度為45-60%的甲醇-水或體積濃度為20-40%的乙腈-水溶液為洗脫體系，流速控制在10-400ml/min，在線紫外檢測，分別收集含有朝藿定A和B的洗脫液(流份l);含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脫液(流份2)，以上兩個流份分別干燥得黃色粉末II和黃色粉末III;3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度為20_40%的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集純度>98X的朝藿定A流份和純度〉98%的朝藿定B的流份。黃色粉末III以體積濃度為20_40%的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集純度大于98%的含有朝藿定C和淫羊藿苷的高純流份；4)目標化學對照品的獲得以上四種高純流份直接濃縮至干即可得到純度大于98%的相應對照品，其為亮黃色粉末。上述方法中，初步柱分離用樹脂以非極性大孔吸附樹脂較好。高效液相制備柱的填料為C6、C8或C18鍵合相填料，其粒徑為520iim，紫外檢測波長優選270nm、318nm或349nm，具體檢測波長根據樣品中目標對照品信號的超載情況而定。以本發明從淫羊藿提取物中分離朝藿定A、B、C及淫羊藿苷化學對照品具有如下優點和進步1.本發明以制備型高效液相為分離手段，分離效率高，可以保證對照品的純度。2.本發明通過柱分離對目標對照品進行初步富集，然后采用兩步高效液相制備方法分別進行除雜和精制，工藝較簡單。3、本發明發展的高效液相制備方法為快速制備方法，單針分離時間在10-30分鐘之間，非常適合大批量化學對照品的制備；同時加上制備溶劑的回收再利用，可實現批量制備的低成本。44.本發明采用紫外檢測器在線檢測，各個對照品的分離情況可以直接檢測，可直接選擇性收集高純度樣品，從而實現純度保證下的高回收率。總之，本發明工藝步驟簡單、純度高、色澤好，并且可大規模生產。圖1為朝藿定A的HPLC分析圖譜(270nm)，其積分報告如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>圖2為朝藿定B的HPLC分析圖譜(270nm)，其積分報告如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>圖3為朝藿定C的HPLC分析圖譜(270nm)，其積分報告如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>NameRetentionTimeArea%Area33.36092030.044朝藿定c8.3152035890098.91圖4為淫羊藿苷(朝藿定D)的HPLC分析圖譜(270nm)，其積分報告如下NameRetentionTimeArea%Area10.6152524480.9222.5542048080.753淫羊藿苷10.2642677804798.3具體實施例方式現結合實施例和附圖對本發明做進一步詳細說明，實施例僅限于說明本發明，而非對本發明的限定。實施例1本實施例中，以含量為20%的淫羊藿苷提取物為原料，初步柱分離采用HPD柱，高效液相制備以10ymC18鍵合相填料為吸附齊U，分別采用一定比例的甲醇-水及乙腈-水為洗脫溶劑，經兩步高效液相制備獲得各個對照品。具體工藝步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用40%乙醇水溶液溶解，HPD-100樹脂柱分離，乙醇-水溶液梯度洗脫，收集20%_80%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I。2)第一步高效液相制備黃色粉末I用40%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為150mg/ml的供試品溶液，經0.45m微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為ChromatorexC18鍵合相填料；粒徑為10iim，柱長22cm、直徑7.5cm;六通閥進樣，進樣體積為10ml，以55%甲醇-水溶液為洗脫體系，流速控制在160ml/min，在線紫外檢測，分別收集含有朝藿定A和B的洗脫液(流份1);含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脫液(流份2)，以上兩個流份分別減壓濃縮干燥得黃色粉末II和黃色粉末III。3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度為30%的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集含有朝藿定A、B的高純流份。黃色粉末III以體積濃度為30%的的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集含有朝藿定C和淫羊藿苷的高純流份。4)各個化學對照品的獲得上述各高純流份直接濃縮至干即可得到純度大于98X的各相應對照品朝藿定A、6B、C及淫羊藿苷(圖l-圖4)。實施例2本實施例中，以含量為20%的淫羊藿苷提取物為原料，初步柱分離采用HPD柱，高效液相制備以10ymC18鍵合相填料為吸附齊U，分別采用一定比例的甲醇-水及乙腈-水為洗脫溶劑，經兩步高效液相制備獲得各相應對照品。具體工藝步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用水溶液溶解，HPD-100樹脂柱分離，乙醇_水溶液梯度洗脫，收集20%_80%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I。2)第一步高效液相制備黃色粉末I用50%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為100mg/ml的供試品溶液，經0.45iim微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為ChromatorexC18鍵合相填料；粒徑為10iim，柱長19cm、直徑7.5cm;泵進樣，進樣體積為20ml，以60%甲醇-水溶液為洗脫體系，流速控制在140ml/min，在線紫外檢測，分別收集含有朝藿定A和B的洗脫液(流份1);含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脫液(流份2)，以上兩個流份分別減壓濃縮干燥得黃色粉末II和黃色粉末III。3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度為25%的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集含有朝藿定A、B的高純流份。黃色粉末III以體積濃度為25%的的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集含有朝藿定C和淫羊藿苷的高純流份。4)步驟同實施例1。實施例3本實施例中，以含量為15%的淫羊藿苷提取物為原料，初步柱分離采用聚酰胺柱，高效液相制備以5iimC18鍵合相填料為吸附劑，分別采用一定比例的甲醇_水及乙腈_水為洗脫溶劑，經兩步高效液相制備獲得各相應對照品。具體工藝步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用45%乙醇水溶液溶解，聚酰胺柱分離，乙醇_水溶液梯度洗脫，收集20%_80%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I。2)第一步高效液相制備黃色粉末I用45%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為120mg/ml的供試品溶液，經0.45iim微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為McirosorbC18鍵合相填料，粒徑為5iim;柱長17cm、直徑5cm;六通閥進樣，進樣體積為8ml，以50-60%甲醇-水溶液為洗脫體系，流速控制在180ml/min，在線紫外檢測，分別收集含有朝藿定A和B的洗脫液(流份1);含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脫液(流份2)，以上兩個流份分別減壓濃縮干燥得黃色粉末II和黃色粉末III。3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度為25%的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集含有朝藿定A、B的高純流份。黃色粉末III以體積濃度為25%的的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集含有朝藿定C和淫羊藿苷的高純流份。4)步驟同實施例1。實施例4本實施例中，以含量為25%的淫羊藿苷提取物為原料，初步柱分離采用聚酰胺柱，高效液相制備以5i！mC18鍵合相填料為吸附劑，分別采用一定比例的甲醇_水及乙腈_水為洗脫溶劑，經兩步高效液相制備獲得各相應對照品。具體工藝步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用40%乙醇水溶液溶解，聚酰胺柱分離，乙醇_水溶液梯度洗脫，收集20%_80%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I。2)第一步高效液相制備黃色粉末I用40-80%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為80mg/ml的供試品溶液，經0.45iim微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為McirosorbC18鍵合相填料，粒徑為5iim;柱長17cm、直徑5cm;泵進樣，進樣體積為20ml，以60%甲醇-水溶液為洗脫體系，流速控制在180ml/min，在線紫外檢測，分別收集含有朝藿定A和B的洗脫液(流份1);含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脫液(流份2)，以上兩個流份分別減壓濃縮干燥得黃色粉末II和黃色粉末III。3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度為28%的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集含有朝藿定A、B的高純流份。黃色粉末III以體積濃度為28%的的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集含有朝藿定C和淫羊藿苷的高純流份。4)步驟同實施例1。8權利要求同時制備淫羊藿苷、朝藿定A、B、C化學對照品的方法，其特征在于以質量含量為10％-50％的淫羊藿苷提取物為原料，經初步柱分離，以制備型高效液相色譜為主要分離手段，通過兩步高效液相制備，提取液直接減壓濃縮至干即可獲得純度大于98％的相應對照品；具體步驟如下1)初步柱分離淫羊藿苷提取物用水或體積濃度40-80％乙醇水溶液溶解，樹脂柱或聚酰胺柱分離，乙醇-水溶液梯度洗脫，其中乙醇的體積濃度從0％-100％變化，收集20％-80％乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末I；2)第一步高效液相制備黃色粉末I用體積濃度40-80％乙醇水溶液溶解，配置成濃度為50～150mg/ml的供試品溶液，經0.45μm微孔濾膜過濾；采用柱長10-50cm、直徑1-10cm的高效液相制備色譜柱進行分離，六通閥或泵進樣，進樣體積為1-50ml，以體積濃度為45-60％的甲醇-水或體積濃度為20-40％的乙腈-水溶液為洗脫體系，流速控制在10-400ml/min，在線紫外檢測，分別收集含有朝藿定A和B的洗脫液(流份1)；含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脫液(流份2)，以上兩個流份分別干燥得黃色粉末II和黃色粉末III；3)第二步高效液相制備黃色粉末II以體積濃度為20-40％的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集純度＞98％的朝藿定A流份和純度＞98％的朝藿定B的流份。黃色粉末III以體積濃度為20-40％的含乙腈水溶液為洗脫體系進行第二次高效液相制備，其余條件同步驟2)，分別收集純度大于98％的含有朝藿定C和淫羊藿苷的高純流份；4)目標化學對照品的獲得以上四種高純流份直接濃縮至干即可得到純度大于98％的相應對照品，其為亮黃色粉末。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于柱分離過程采用的樹脂柱為非極性樹脂柱。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于第一步或第二步高效液相制備過程采用的制備柱的填料為C6、C8、或C18鍵合相填料，粒徑為5-20ym。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于高效液相制備過程采用采用在線紫外檢測，其檢測波長優選270nm、318nm或349nm。全文摘要本發明涉及一種同時制備淫羊藿苷、朝藿定A、B、C化學對照品的分離制備方法。以含量為10％-50％的淫羊藿苷提取物為原料，經初步柱分離，以制備型高效液相色譜為主要分離手段，通過兩步高效液相制備，提取液直接減壓濃縮至干即可獲得純度大于98％的朝藿定A、B、C和淫羊藿苷化學對照品。本發明工藝步驟簡單、純度高、色澤好，并且可大規模生產。文檔編號B01D15/32GK101747393SQ200810229888公開日2010年6月23日申請日期2008年12月17日優先權日2008年12月17日發明者王莉,肖紅斌,雷宇佳申請人:中國科學院大連化學物理研究所