專利名稱：：紅花桑寄生多糖的提取方法
技術領域：
：本發明涉及一種植物多糖的提取方法，具體地說，涉及一種紅花桑寄生(ScuirulaparasiticaL.)多糖的提取方法。
背景技術：
：紅花桑寄生5"cMmz/"parawWcaL.是桑寄生科桑寄生亞科梨果寄生屬半寄生性植物，為我國特有的植物，主要分布于我國廣東、廣西、云南及福建等南方地區。傳統上紅花桑寄生常作為桑寄生Ku/〃wc/z/we"w、(DC.)Danser的代用品入藥，具補肝腎、祛風濕、降血壓、安血養胎等功效，主治風濕、關節痛、高血壓、坐骨神經痛、腰痛、產后乳少等癥。桑寄生科植物一般含大量的黃酮類成分，我們在前期的研究中發現紅花桑寄生總黃酮提取物對急性髓系白血病有較好的抑瘤效果，并可增敏臨床重要抗腫瘤化療藥物多柔比星的療效，機制研究表明其可能是一種良好的NF-kB抑制劑。然而，尚未見對紅花桑寄生多糖及其功用的研究。植物多糖具有多方面的生物活性，能夠調節機體免疫機能，具有抗病毒、抗菌、抗寄生蟲、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老等功能，因而越來越受重視。近年來，大量的研究表明，中藥多糖具有抗腫瘤作用，且毒副作用小，因而越來越成為抗腫瘤研究的熱點。香菇多糖、當歸多糖、豬茶多糖、云芝多糖等一批質量穩定、療效確切、毒性和不良反應小的多糖類藥物已作為抗腫瘤藥物廣泛用于臨床。紅花桑寄生的同科植物槲寄生在國外是一種研究較多的具有抗腫瘤作用的植物，在歐洲，自1920年就對槲寄生的抗腫瘤作用開始研究，其提取物具有多種抗癌效果，對乳腺癌、胃癌與結腸癌等常見腫瘤有一定治療作用。英國和澳人利亞已分別開發出商品名為Iscador和Isord的槲寄生標準植物提取物用于癌癥的臨床治療。已有的研究表明槲寄生提取物中的有效抗腫瘤成分可能主要是多糖、凝集素、毒肽、生物堿以及多酚類物質。棺物多糖的提取過程大多采用傳統的先沉淀再去蛋白的方法。我們在研究中發現采用傳統的方法來提取紅花桑寄生多糖，需多次使用沉淀劑從溶液中沉淀多糖，耗費大暈的溶劑，且得率低，提取出的多醣類物質水溶性很差，不利于應用。本發明采用先去蛋白再沉淀多糖的提取方法，則只需使用一次沉淀劑來沉淀多糖，節省了大量溶劑；得率高，同時提高了多糖的水溶性，便于藥物研究和實際應用。
發明內容本發明的目的在于提供一種先去蛋白再沉淀多糖的紅花桑寄生多糖的提取方法。為實現本發明的目的采用的技術方案是將紅花桑寄生枝葉粉碎后，用乙醇回流提取，過濾取濾渣，濾渣用熱水浸提，經沉淀、干燥后得到紅花桑寄生多糖提取物，其特征是經熱水浸提法提取后的上清液，首先采用sevage法、TCA法或酶法，或者是他們之間的任意兩種方法，或者是三種方法聯用去除蛋白，再使用透析袋進行透析除去小分子成分。采用本發明所述的紅花桑寄生多糖提取方法，只需使用一次沉淀劑來沉淀多糖，節省了大量溶劑；提高了多糖的得率，同時提高了多糖的水溶性，便于藥物研究和實際應用。所得到紅花桑寄生多糖提取物，對小鼠肉瘤S180有較好的抑制效果，并與臨床重要抗腫瘤化療藥物有顯著的協同效果；該提取物也可顯著延長荷肝癌腹水瘤H22小鼠的壽命。研究表明該提取物的抑瘤效果并沒有劑量依賴性，而是有一最佳劑量，過高或過低的劑量均使得抑瘤效果下降。具體的提取方法包括以下步驟(1)采集紅花桑寄生嫩枝和葉，水洗、晾干、6(TC烘干，粉碎機成粉末；(2)取粉末，加入乙醇回流提取，以去除其中的脂溶性成分，過濾取濾渣，揮干溶劑；(3)取揮干溶劑后的濾渣，進行熱水浸泡提取，濾渣水二i:515，熱水溫度為8095'C浸泡提取，2小時后離心或抽濾去渣；取上清液，并于6(TC下減壓濃縮處理；(4)重復步驟(3)三遍；合并3次上清液。(5)采用sevage法、TCA法、酶法或者這幾種方法聯用，重復三次，將上清液中的蛋白去除；(6)去蛋白后的上清液裝入透析袋進行透析，流水透析2天，蒸餾水透析l天，去除小分子成分，得到多糖溶液；(7)在多糖溶液中加入沉淀劑，在低溫下沉淀多糖，使沉淀劑在溶液中的濃度為65%85%(v/v)，離心收集沉淀，該沉淀物經醇類、酮類和乙醚依次洗滌后冷凍干燥即得本發明所說的紅花桑寄生多糖。本發明所述的透析袋進行透析時，流水透析2天，蒸餾水透析l天；所說的透析袋的透析分子量為700014000D。本發明所述的沉淀劑，是指含有14個碳鏈的醇類溶劑，最優選的是乙醇。本發明所述的洗滌步驟中采用的洗滌劑依次為無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌。具體實施方式以下實施例用于對本發明作進一步闡述，但并不因此而限制本發明的范圍。實施例1:取粉碎好的藥材粉末180g，加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽濾取濾渣，揮干溶劑后加水按料液比1:10，95"C熱水中提取，每次2h,共提取3次，合并3次提取液，抽濾去渣，濾液于6(TC下減壓濃縮至約1000ml體積，加入1/3體積的sevage(氯仿正丁醇=4:1)，振蕩20min后，8000rpm離心15min，去除蛋白沉淀，取上清重復多次直到無蛋白為止。將去蛋白后的溶液裝入透析袋透析，流水透析2天，蒸餾水透析l天。減壓濃縮至1/2體積，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中靜置24h進行沉淀，離心收集沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，再經冷凍真空干燥得紅花桑寄生多糖提取物3.67g。實施例2:取粉碎好的藥材粉末180g，加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽濾取濾渣，揮干溶劑后加水按料液比1:10，95"C熱水中提取，每次2h，提取3次，合并3次提取液，抽濾去渣，濾液加入0.5%木瓜蛋白酶(w/v)，4(TC酶解5h后，加熱到10(TC10min滅酶活，于6(TC下減壓濃縮至約1000ml體積，加入1/3體積的sevage(氯仿正丁醇=4:1)，振蕩20min后，8000rpm離心15min，重復3次。將去蛋白后的溶液裝入透析袋透析，流水透析2天，蒸餾水透析1天。濃縮至1/2體積，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中靜置24h進行沉淀，離心收集沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，再經冷凍真空T燥得紅花桑寄生多糖提取物4.87g。實施例3:取粉碎好的藥材粉末180g,加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽濾取濾渣，揮干溶劑后加水按料液比1:10，95"C熱水中提取，每次2h，共提取3次，合并3次提取液，抽濾去渣，濾液于60'C下減壓濃縮至約1000ml體積，加入等體積30%三氯乙酸，振蕩20min后，4。C下靜置2h，8000rpm離心15min，去除蛋白沉淀。將去蛋白后的溶液裝入透析袋透析，流水透析2天，蒸餾水透析l天。濃縮至l/2體積，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中靜置24h進行沉淀，離心收集沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，再經冷凍真空干燥得紅花桑寄生多糖提取物3.42g。實施例4:取粉碎好的藥材粉末180g，加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽濾取濾渣，揮干溶劑后加水按料液比1:10，95。C熱水中提取，每次2h，提取3次，合并3次提取液，抽濾去渣，濾液加入0.2%木瓜蛋白酶(w/v)，6(TC酶解2h后，加熱到IO(TC10min火酶活，于60。C下減壓濃縮至約1000ml體積，加入等體積30%三氯乙酸，振蕩20min后，4'C下靜置2h，8000rpm離心15min，去除蛋白沉淀。將去蛋白后的溶液裝入透析袋透析，流水透析2天，蒸餾水透析l天。濃縮至l/2體積，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中靜置24h進行沉淀，離心收集沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，再經冷凍真空干燥得紅花桑寄生多糖提取物4.32g。實施例5:按實施例4所述方法提取的紅花桑寄生多糖提取物(以下簡稱SPS)腹腔注射對小鼠肉瘤S180的抑制作用。昆明種小鼠50只(雌雄各半，體重18士2g，由福建醫科大學實驗動物中心提供),S180腹水瘤株由福建醫科大學藥學院提供。取腹腔內傳代7d的S180肉瘤小鼠，脫臼處死，在無菌條件下抽取腹腔內瘤細胞，并以生理鹽水洗滌3次，2500rpm離心3min,用滅菌生理鹽水調整瘤細胞濃度為5X107ml，接種于小鼠右腋皮下，每只小鼠接種0.2ml。于接種24h后隨機分組，每組10只，分成生理鹽水組、環磷酰胺組(CTX，20mg/kgd)、SPS低劑量組(50mg/kg.d)、SPS中劑量組100mg/kg.d)、SPS高劑量組(150mg/kg.d)。以上各組均每天腹腔注射給藥0.01ml/g，連續給藥10天，末次給藥24h后，脫臼處死荷瘤小鼠，取腫瘤組織、脾臟、胸腺，去血污稱重，計算抑瘤率、脾指數(mg脾重/10g體重)和胸腺指數(mg胸腺重/10g體重)。結果見表l。抑瘤率=(對照組平均瘤重一實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重X10(F。表l紅花桑寄生多糖對S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用(x士s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可看出，三種劑量的紅花桑寄生多糖提取物對小鼠S180均有較好的抑瘤效果，與生理鹽水組比較，差異顯著，抑瘤效果以100mg/kg.d的劑量最好，過高劑量反而導致抑瘤效果下降，這與文獻中報道的植物多糖的免疫調節作用大多有最適劑量相符。三個劑量的SPS組與生理鹽水組相比均能增加小鼠脾重量，只有SPSIOOmg/kg.d組差異顯著(尸〈0.001)，紅花桑寄生多糖對胸腺重量的增加影響不大，而陽性對照藥CTX極顯著地降低了脾指數和胸腺指數。實施例6按實施例4所述方法提取的紅花桑寄生多糖提取物對環磷酰胺(CTX)的增效作用。材料及接種方法同實施例5，于接種24h隨機分組給藥，分成生理_鹽水組、CTX低劑量組(10mg/kg.d)、CTX中劑量組(20mg/kg.d)、CTX高劑量組(30mg/kg.d)、SPS(100mg/kg.d)+CTX低劑量組(10mg/kgd)、SPS(100mg/kg.d)+CTX中劑量組(20mg/kgd)、SPS(100mg/kg.d)+CTX高劑量組(30mg/kg.d)，以上各組均每天ip給藥0.01ml/g,連續給藥10d，末次給藥后24h脫臼處死荷瘤小鼠，取瘤稱質量，計算抑瘤率。比較單純用CTX治療組與加用多糖組間抑瘤率的差異，結果見表2。表2紅花桑寄生多糖對CTX的增效作用(義士s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與生理鹽水組比較*尸<0.001;與CTX比較at°<0.05;^尸<0.01由表2可看出，紅花桑寄生多糖提取物顯著地增強了環磷酰胺的抑瘤效果。實施例7按實施例2所述方法提取的紅花桑寄生多糖提取物顯著延長了荷H22肝癌腹水瘤小鼠的壽命。材料及來源同實施例5。無菌條件下抽取小鼠腹腔內傳代7d的H22腹水細胞，計數后用生理鹽水稀釋，每只小鼠腹腔接種5X106個細胞，次曰開始尾靜脈注射給藥，連續7天。停止給藥后計算小鼠生存天數。陰性對照藥為生理鹽水，陽性對照藥為環磷酰胺，SPS分為高、中、低三個劑量組，結果見表3。生命延長率的計算公式為生命延長率=(給藥組平均存活天數—對照組平均存活天數)/對照組平均存活天數X1000/0表3紅花桑寄生多糖對S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用(x土an=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與對照組比較*尸〈0.01從表3可看出，紅花桑寄生多糖提取物顯著地延長了荷瘤小鼠的生命，與對肉瘤S180的抑制結果相似，中劑量組100mg/kg.d這一劑量對荷H22肝癌腹水瘤的小鼠延壽效果最好，表明紅花桑寄生多糖提取物的抗腫瘤效果有一最佳劑量，而不呈線性的量效關系。這一點與香菇多糖的抗腫瘤效應相似，表明紅花桑寄生多糖提取物可能與香菇多糖有相似的抗腫瘤作用機制。權利要求1、紅花桑寄生多糖的提取方法，是紅花桑寄生枝葉經粉碎后，用乙醇回流萃取，過濾去處脂溶性成分，濾渣經熱水浸提法，經沉淀、干燥后得到紅花桑寄生多糖提取物，其特征是經熱水浸提法提取后的上清液，首先采用sevage法、TCA法、酶法或者這三種方法聯用去除蛋白，再利用透析袋進行透析。2、根據權利要求1所述的紅花桑寄生多糖的提取方法，其特征是所述的透析袋進行透析時，流水透析2天，蒸餾水透析1天；所說的透析袋的透析分子量為700014000D。3、根據權利要求1所述的紅花桑寄生多糖的提取方法，其特征是所述的沉淀劑，是指含有14個碳鏈的醇類溶劑，最優選的是乙醇。4、根據權利要求1所述的紅花桑寄生多糖的提取方法，其特征是所述的洗滌歩驟中采用的洗滌劑依次為無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌。全文摘要本發明涉及一種植物多糖的提取方法，具體地說，涉及一種紅花桑寄生多糖的提取方法。為實現本發明目的采用的技術方案是將紅花桑寄生枝葉粉碎后，用乙醇提取后過濾取濾渣，濾渣用熱水浸提，經去蛋白和小分子成分后得到紅花桑寄生多糖，其特征是經熱水浸提法提取后的上清液，首先采用sevage法、TCA法、酶法或者這三種方法聯用去除蛋白，再透析去除小分子成分。采用本發明所述的多糖提取方法，只需使用一次沉淀劑來沉淀多糖，節省了大量溶劑；同時提高了多糖的得率和水溶性。所得到紅花桑寄生多糖提取物，對小鼠肉瘤S180有較好的抑制效果，并可顯著延長荷肝癌腹水瘤H22小鼠的壽命，其抑瘤效果沒有劑量依賴性。文檔編號B01D61/00GK101250233SQ20081007081公開日2008年8月27日申請日期2008年3月27日優先權日2008年3月27日發明者肖義軍,范延麗,陳元仲申請人:福建師范大學