專利名稱：：內毒素吸附劑及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種內毒素吸附劑及制備方法，特別是一種用于血液灌流的內毒素吸附劑及其制備方法。
背景技術：
：內毒素是革蘭氏陰性菌生長時釋放或死亡時由細胞壁裂解產生的一類脂多糖類物*，極微量(納克級)內毒素進入人體就會引起高熱，血管擴張，甚至昏厥或死亡。內毒素血癥是臨床最常見的致死疾病之一，死亡率可達40%-90%。臨床上尚無有效治療內毒素血癥的方法，已有的方法之一是通過鍵合有多粘菌素(PMB)的吸附劑進行血液灌流。其中多粘菌素是一種環狀十肽，為環狀結構的7肽和3肽的N端，含有疏脂性和親脂性基團及一個多肽尾。多粘菌素為一種離子表面除垢劑，能破壞革蘭氏陰性菌外層或細胞質膜的通透性。血液灌流療法是依靠吸附劑直接吸附除去血液中的有毒成份或致病物質，達到凈化血液、緩解和治療疾病的目的。ZL03144231，5號中國發明專利公開一種內毒素吸附劑及其制備方法，通過以瓊脂為原料，采取向甲苯-四氯化碳混合液中加瓊脂水溶液的方法，得到球狀瓊脂，經^5成性條件下環氧氯丙烷活化后與二胺反應，產物經與戊二醛反應，產生部分交聯，得到強度較好的珠狀瓊脂作為吸附劑載體。載體與多粘菌素B等含胺基的配基反應后，經硼氬化鈉還原，即得到以瓊脂凝膠為載體，固定有效量多粘菌素的內毒素吸附劑。該種內毒素吸附劑的多粘菌素B固載量為10.6-22.5毫克/克吸附劑，內毒素吸附量為0.5-1納克/克吸附劑。CN200510046452.4號中國發明專利申請公開一種用于血液灌流的內毒素吸附劑的制備方法，通過生物相容性好的球形瓊脂糖凝膠為基質，采用環氧氯丙烷、己二胺、1,1，-羰基二咪唑活化后，鍵合多粘菌素B配基后，經硼氬化鈉還原，即得到內毒素吸附劑。通過該方法制備的吸附劑多粘菌素B固載量6.12毫克/克吸附劑，內毒素吸附量達22納克/克吸附劑。上述內毒素吸附劑的多粘菌素B固載量均較小，吸附效果不理想。此外，上述內毒素吸附劑在制備過程用環氧乙基活化基質與配體偶聯時需要44性條件，pH為9-13,溫度為20-4(TC。這樣的條件對作為基質的瓊脂糖凝膠強度破壞較大，使內毒素吸附劑在血液灌流過程容易產生微粒，給使用帶來風險。
發明內容本發明的目的之一是克服現有技術的缺陷，提供一種新的內毒素吸附劑。為實現上述目的，本發明提供的技術方案為內毒素吸附劑，以球形多孔纖維素為載體，固載有效量的多粘菌素B為配基構成。較好的方案是球形多孔纖維素的粒度為0.20-0.40毫米。更好的方案是每克內毒素吸附劑固載的多粘菌素B為30-40毫克。球形多孔纖維素載體的強度較瓊脂要好，使用更為安全。尤其是以粒度為0.20-0.40亳米的球形多孔纖維素為載體時，每克內毒素吸附劑固載的多粘菌素B可達30-40毫克，每克吸附劑可吸附內毒素80-120納克。本發明的目的之二是克服現有技術的缺陷，提供一種新的制備內毒素吸附劑的方法。為實現上述目的，本發明提供的技術方案為內毒素吸附劑的制備方法，以球形多孔纖維素為載體，先與過碘酸鈉反應，再4建合有效量的多粘菌素B，經硼氫化鈉還原得到內毒素吸附劑。更具體地，是包括以下步驟A.過碘酸鈉活化球形多孔纖維素向含有球形多孔纖維素的懸浮液中，加入過碘酸鈉溶液，使體系中過碘酸鈉溶液的濃度在1.0-2.0克/升之間，控制溫度15-25°C，反應l-3小時，升溫30-35°C，繼續反應1Q-30分鐘。B.活化球形多孔纖維素固載多粘菌素B向活化球形多孔纖維素中加入10-20克/升的多粘菌素B硼酸緩沖溶液，控制體系溫度30-40°C，反應0.5-2小時。加入硼氫化鈉溶液，使其濃度在0.8-1.5克/升，反應2-4小時，再加入硼氫化鈉溶液，使其濃度在1.6-3.0克/升，降至室溫，繼續反應10-20小時。用5N濃度的鹽酸調節體系pH值5.5-6,繼續攪拌1G-2Q分鐘。C.吸附劑無熱源處理在潔凈環境中，向吸附劑中加入2倍體積的0.1-1N醇-鈉溶液，浸泡1-4小時，用滅菌注射用水沖洗至中性。球形多孔纖維素以過碘酸鈉活化后鍵合多粘菌素B,然后用硼氫化鈉還原的合成路線可以用如下反應式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>因為過碘酸鹽氧化纖維素具有高度專一性，沒有明顯的副反應，能使纖維素鏈中葡萄糖環上的C2-C3鍵斷開，使原來的羥基轉化成具有高還原性的二醛基，利用多粘菌素B上氨基與醛基發生反應形成共價一睫結合，將多粘菌素B固載在纖維素上，然后用硼氬化鈉將未反應的活化基團還原，可得到生物相容性良好的內毒素吸附劑。上述方法采用多孔球形纖維素作為載體，提高了內毒素吸附劑的多粘菌素固載量，使吸附效果更佳。另外，上述方法工藝過程簡單，而且因為反應在水性體系中進行，操作安全環保，中間產物處理方便，工藝溫和，不會使多粘菌素B在反應過程中發生結構的改變。此外，通過使用化學4定合的方式將多粘菌素B連接在載體上，使固載的配基穩定，在后續的滅菌及使用過程中不會大量脫落。本發明A步驟中的球形多孔纖維素的懸浮液中球形多孔纖維素的濃度可以為60-70克/升，B步驟中的多粘菌素B硼酸緩沖溶液的PH值可以為9.7。本發明對活化球形多孔纖維素在多粘菌素B硼酸緩沖溶液中的濃度沒有嚴格的限制，只要保證液體充分，可使活化球形多孔纖維素在體系中懸浮即可，如可使活化球形多孔纖維素在多粘菌素B硼酸緩沖溶液的濃度為40-60克/升。本發明中的J求形多孔纖維素可以通過商業途徑購買，可通過現有技術中的已知方法自行制備，亦可參考如下方法制得A.制備纖維素粘膠液將30克脫脂棉，浸漬在270克19%的氬氧化鈉水溶液中，室溫下堿化2小時，然后抽濾，擠去堿液，裝入密閉容器內，老化3天。然后向其中加入18克二碌u化爿暖，3(TC下石黃化5小時左右，得到橙色粘膠液，向其中加入300克6%的氬氧化鈉溶液，攪拌均勻制得纖維素黃原酸酯粘膠液。B.制備交聯球形纖維素顆粒將油相分散劑900克氯苯、320克四氯化碳和2克油酸鉀混合攪拌30分鐘，使之均勻。將水相纖維素黃原酸酯粘膠液300克、致孔劑聚合度為200的聚乙二醇50克和30克交聯劑三偏磷酸鈉混合均勻，調整PH值至IO.2，然后將水相加入到油相中，調整攪拌速度使粘膠液分散成大小適宜的液珠，升溫至5(TC，反應1.5小時，然后升溫到9(TC,保溫2小時，攪拌下自然冷卻至室溫，過濾，得到含有致孔劑的交聯纖維素球形顆粒。C.后處理將纖維素球形顆粒用大量自來水沖洗，然后用75%酒精浸泡過夜，再用大量去離子水洗凈，過濾得到球形多孔纖維素顆粒。下面參照具體實施例對本發明予以詳細il明。具體實施方式實施例1A.過碘酸鈉活化球形多孔纖維素先將球形多孔纖維素真空抽濾，除去表面水份。向三口燒瓶中加入50克球形多孔纖維素，再加入770毫升純化水，控制溫度在22土rc,攪拌使球形多孔纖維素懸浮于純化水中，形成球形多孔纖維素懸浮液。稱取1.3克過多典酸鈉于燒杯中，加入2G毫升水溶解，配成過石典酸鈉溶液。將過石典酸鈉溶液加入燒弁瓦中，再加入10毫升水洗滌燒杯，將洗滌液倒入燒瓶中，繼續攪拌l小時，升溫至31土rc攪拌10分鐘，濾出反應殘液，活化纖維素球用純化水洗滌兩次，室溫^呆存。B.活化纖維素球固載多粘菌素B先稱取15克多粘菌素B硫酸鹽，加入1升pH值為9.7的硼酸緩沖溶液中，升溫至31±rC,攪拌溶解1小時，用5N氫氧化鈉調節溶液pH值至9.7,制得多粘菌素B硼酸溶液備用。將活化球形多孔纖維素球加入四口燒并瓦中，快速加入多粘菌素B硼酸溶液，開啟攪拌，升溫至3i±rc，用W的氫氧化鈉調節溶液pH值至9.7，反應1小時。將1.2克硼氫化鈉溶解于20毫升純化水中，加入反應體系中，混合物在31±1。C繼續反應2小時。再將1.2克硼氫化鈉溶解于20毫升純化水中，加入到反應體系中，停止加熱，反應體系降至室溫，繼續攪拌14小時。用1N的鹽酸調節體系pH值為5.7,繼續攪拌10分鐘，濾出反應殘液，得到約50毫升左右固載多粘菌素B的纖維素球，用純化水洗滌兩次，室溫^呆存。C.吸附劑無熱源處理1.4克氫氧化鈉溶解于84毫升純化水中，再加入36毫升95%酒精，混合均勻得0.5N醇-鈉溶液。將固載多粘菌素B的球形多孔纖維素加入至上述0.5N醇-鈉溶液中，浸泡2小時，用注射用水洗至中性，得到無熱原的內毒素吸附劑一。實施例2A.過碘酸鈉活化球形多孔纖維素先將球形多孔纖維素真空抽濾，除去表面水份。向三口燒并瓦中加入50克球形多孔纖維素，再加入770毫升純化水，控制溫度在26±rc，攪拌使球形多孔纖維素懸浮于純化水中，形成球形多孔纖維素懸浮液。稱取0.8克過碘酸鈉于燒杯中，加入2G毫升水溶解，配成過碘酸鈉溶液。將過碘酸鈉溶液加入燒瓶中，再加入10毫升水洗滌燒杯，將洗滌液倒入燒瓶中，繼續攪拌3小時，升溫至34土rC攪拌20分鐘，濾出反應殘液，活化纖維素球用純化水洗滌兩次，室溫保存。B.活化纖維素球固載多粘菌素B先稱取10克多粘菌素B硫酸鹽，加入1升pH值為9.7的硼酸緩沖溶液中，升溫至3i±rc,攪拌溶解1小時，用5N氫氧化鈉調節溶液pH值至9.7,制得多粘菌素B硼酸溶液備用。將活化球形多孔纖維素球加入四口燒并瓦中，快速加入多粘菌素B硼酸溶液，開啟攪拌，升溫至39土rC，用5N氫氧化鈉調節溶液pH值至9.7,反應2小時。1.G克硼氫化鈉溶解于20毫升純化水中，加入反應體系中，混合物在39土rC繼續反應2小時。再將i.o克硼氫化鈉溶解于20毫升純化水中，加入到反應體系中，停止加熱，反應體系降至室溫，繼續攪拌10小時。用1N鹽酸調節體系pH值為5.7，繼續攪拌20分鐘，濾出反應殘液，得到約50毫升左右固載多粘菌素B的纖維素球，用純化水洗滌兩次，室溫保存。C.吸附劑無熱源處理0.48克氫氧化鈉溶解于84毫升純化水中，再加入36毫升95%酒精，混合均勻得0.1N醇-鈉溶液。將固載多粘菌素B球形多孔纖維素加入至上述0.1N醇-鈉溶液中，浸泡4小時，用注射用水洗至中性，得到無熱原的內毒素吸附劑二。實施例3A.過不典酸鈉活化球形多孔纖維素先將球形多孔纖維素真空抽濾，除去表面水份.向三口燒瓶中加入50克球形多孔纖維素，再加入770毫升純化水，控制溫度在16±1°C,攪拌使球形多孔纖維素懸浮于純化水中，形成球形多孔纖維素懸浮液。稱取1.6克過》典酸鈉于燒杯中，加入20毫升水溶解，配成過碘酸鈉溶液。將過碘酸鈉溶液加入燒瓶中，再加入1G毫升水洗滌燒杯，將洗滌液倒入燒瓶中，繼續攪拌l小時，升溫至31土rC攪拌30分鐘，濾出反應殘液，活化纖維素球用純化水洗滌兩次，室溫i呆存。B.活化纖維素球固載多粘菌素B先稱取20克多粘菌素B硫酸鹽，加入1升pH值為9.7的硼酸緩沖溶液中，升溫至31土rC,攪拌溶解1小時，用5N氫氧化鈉調節溶液pH值至9.7，制得多粘菌素B硼酸溶液備用。將活化球形多孔纖維素球加入四口燒瓶中，快速加入多粘菌素B硼酸溶液，開啟攪拌，升溫至31土1。C,用5N氫氧化鈉調節溶液pH值至9.7,反應0.5小時。1.5克硼氫化鈉溶解于20毫升純化水中，加入反應體系中，混合物在3i±rc繼續反應2小時。再將1.5克硼氫化鈉溶解于20毫升純化水中，加入到反應體系中，停止加熱，反應體系降至室溫，繼續攪拌15小時。用1N鹽酸調節體系pH值為5.7，繼續攪拌10分鐘，濾出反應殘液，得到約50毫升左右固載多粘菌素B纖維素球，用純化水洗滌兩次，室溫保存。C.吸附劑無熱源處理5.6克氳氧化鈉溶解于84毫升純化水中，再加入36毫升95°/。酒精，混合均勻得2.ON醇-鈉溶液。將固載多粘菌素B球形多孔纖維素加入至上述2.ON醇-鈉溶液中，浸泡1小時，用注射用水洗至中性，得無熱原的內毒素吸附劑三。檢測方法1、吸附劑多粘菌素B固載量檢測將無熱原吸附劑裝入直徑4厘米的砂芯漏斗，吸附劑在砂芯漏斗中的高度為2厘米，將^K芯漏斗裝在抽濾裝置上，開啟真空泵抽濾1分鐘，抽干球表面水份，在電子天平上準確稱量吸附劑0.0500克置于25毫升比色管中，每個樣品作一平行管，加水4.0毫升，再向各管中加入2%茚三酮溶液和Na2HP04-KH2P04(pH值=8.04)緩沖溶液各1.0毫升，混勻，于80。C反應30分鐘，冷卻至室溫加水至25毫升混勻，靜止10分鐘，于570納米處取各樣品管內溶液檢測OD值。取25毫升比色管6支，向其中分別加入200微克/毫升多粘菌素B溶液O、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5毫升，加水稀釋至4.0毫升，再向各管中加入2%茚三酮溶液和Na2HP04-KH2P04(pH值=8.04)緩沖溶液各1.0毫升，混勻，于80。C反應30分鐘，冷卻至室溫加水至25毫升混勻，靜止10分鐘，于570納米處4企測0D值。根據標準溶液和吸光度回歸線性方程，由吸附劑的吸光度在線性方程上求得吸附劑多粘菌素B固載量，以毫克/克吸附劑表示。2、吸附劑內毒素吸附量檢測在潔凈環境中，稱無熱原吸附劑1克于50毫升去熱原錐形瓶中，用滅菌注射用水沖洗兩次，吸干表面水份，加入25毫升10納克/毫升的內毒素溶液，蓋上瓶塞，密封。同時做細菌內毒素才全查用水空白樣和內毒素溶液原始樣。力文入恒溫水浴振蕩器中，設定溫度37°C,190轉/分鐘，振蕩吸附2小時，用顯色基質鱟試劑法檢測內毒素溶液濃度，計算吸附劑內毒素吸附量以納克/克吸附劑表示。按照上述方法對通過實施例1、2、3制得的吸附劑一、吸附劑二、吸附劑三進行;險測，；險測結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根據上表的才企測結果，可以看出通過本發明方法制備的內毒素吸附劑，其多粘菌素B的固載量及內毒素的吸附量均遠遠大于現有技術中的內毒素吸附劑。基于本發明精神或主要特征的具體形式并不僅限于上述實施例，還可有多種組合或變化，如各種時間、溫度等均可在一定程度上進行調整，因此，無論從哪一點來看，本發明的上述實施方式都只能認為是對本發明的說明而不能限制本發明，在與本發明權利要求書相當的含義和范圍內的任何變化，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。權利要求1、內毒素吸附劑，其特征在于它是以球形多孔纖維素為載體，固載有效量的多粘菌素B為配基構成。2、根據權利要求1所述的內毒素吸附劑，其特征在于所述球形多孔纖維素的粒度為0.20-0.40毫米。3、根據權利要求1所述的內毒素吸附劑，其特征在于每克內毒素吸附劑固載的多粘菌素B為30-40毫克。4、內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于以球形多孔纖維素為載體，先與過碘酸鈉反應，再鍵合有效量的多粘菌素B,經硼氪化鈉還原得到內毒素吸附劑。5、根據權利要求4所述的內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟A.過碘酸鈉活化球形多孔纖維素向含有球形多孔纖維素的懸浮液中，加入過碘酸鈉溶液，使體系中過碘酸鈉溶液的濃度在1.0-2.G克/升之間，控制溫度15-25°C,反應l-3小時，升溫30-35。C,繼續反應10-30分鐘。B.活化球形多孔纖維素固載多粘菌素B向活化^t形多孔纖維素中加入10-20克/升的多粘菌素B硼酸緩沖溶液，控制體系溫度30-40°C,反應0.5-2小時。加入硼氬化鈉溶液，使其濃度在0.8-1.5克/升，反應2-4小時，再加入硼氬化鈉溶液，使其濃度在1.6-3.0克/升，降至室溫，繼續反應10-20小時。用5N濃度的鹽酸調節體系pH值5.5-6,繼續攪拌1G-2G分鐘。C.吸附劑無熱源處理在潔凈環境中，向吸附劑中加入2倍體積的0.1-1N醇-鈉溶液，浸泡l-4小時，用滅菌注射用水沖洗至中性。6、根據權利要求5所述內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于所述A步驟中的球形多孔纖維素的懸浮液中球形多孔纖維素的濃度為60-70克/升。7、根據權利要求5所述內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于所述B步驟中的多粘菌素B硼酸緩沖溶液的PH值為9.7。8、根據權利要求5所述內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于所述B步驟中球形多孔纖維素在多粘菌素B硼酸緩沖溶液中的濃度為40-60克/升。全文摘要內毒素吸附劑，以球形多孔纖維素為載體，固載有效量的多粘菌素B為配基構成。內毒素吸附劑的制備方法，以球形多孔纖維素為載體，先與過碘酸鈉反應，再鍵合有效量的多粘菌素B，經硼氫化鈉還原得到內毒素吸附劑。具有內毒素吸附劑性質穩定，多粘菌素B固載量大，吸附效果好等優點。文檔編號B01J20/22GK101322933SQ200810028949公開日2008年12月17日申請日期2008年6月17日優先權日2008年6月17日發明者凡董申請人:珠海麗珠醫用生物材料有限公司