專利名稱：一種從紫蘇葉提取物中脫除紫蘇酮的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種用高速逆流色譜法(HSCCC)從紫蘇葉脂溶性粗提物中脫除紫蘇酮的方法。
背景技術：
天然產物開發及植物活性成分研究是食品科學、醫學及營養學共同關注的領域，也是當今時代發展的必然。該領域被譽為21世紀的研究熱點，并且有許多成果被廣泛應用于功能性食品(保健食品)。這類食品除了具有一般食品皆有的營養和感官功能外，還具有一般食品所沒有的或不強調的調節人體生理活動的功能。其中真正起生理作用的成分是生理活性物質，它可作用于人的誘發病態(人體健康態和疾病態之間的第三態)，促使機體向健康狀態復歸，達到增加健康的目的。
國際功能性食品的研究與開發在經歷第一和第二代之后，現已發展到第三代。通過提取、分離、純化其有效的生理活性成分，鑒定活性成分的結構，研究其構效和量效關系，保持生理活性成分在食品中的有效穩定態勢，或者直接將生理活性成分處理成功能性食品，稱為第三代功能性食品。目前，在美國、日本等發達國家的市場上，大部分是第三代功能性食品。而我國盡管功能性食品市場上已有一定規模，但與發達國家相比還有不小的差距。目前我國的功能性食品大部分是建立在食療基礎上，一般都采用多種既是藥品又是食品的中藥配制產品，這是我國功能性食品的特點。它的好處是經過了前人的大量實踐，證實是有效的。如架我們能采用現代高新技術，對具有中國特色的功能性食品原料進行全面的基礎和應用研究，不僅研究其中的功能因子，還應研究分離保留其活性和穩定性的工藝技術，包括如何去除這些原料中有毒物質，開發出具有明確量效和構效的第三代功能性食品，就能與國際接軌，參與國際競爭。
紫蘇[Perilla frutescens(L.)Britt]別名赤蘇、紅蘇、香蘇，是原產于喜馬拉雅山及中國的中南部地區的一種唇形科一年生草本植物，現主要分布于中國、印度、日本、朝鮮等國。紫蘇是我國傳統的藥食兩用植物，亦是國家衛生部首批頒布的既是食品又是藥品的60種中藥之一。紫蘇性溫、辛、入肺經，具有化痰平喘、散寒解表、理氣寬胸和解郁安胎作用。紫蘇葉中含有豐富的營養物質和黃酮類化合物，其中粗蛋白含量高達28％，β-胡蘿卜素9～10mg/100g，此外維生素B2也較豐富，可被廣泛應用于功能性食品、藥品和化妝品。紫蘇葉經水蒸汽蒸餾可得紫蘇精油，含量為0.3％～0.7％，其成分因品種、產地等因素不同，差異較大。按精油中主成分的不同，可將紫蘇分為如下4種紫蘇醛型占50％～60％，主要含30％～60％紫蘇醛和10％～30％檸檬烯；呋喃酮型占20％～25％，其主要成分有香薷酮、紫蘇酮、彎刀酮和異白蘇酮等；苯基丙烷型約占20％，其主成分有蒔蘿油腦、欖香素和內豆蔻醚等；檸檬醛型不足1％，主成分為檸檬醛。
紫蘇葉除了含有多種活性成分外，也含有有害成分。紫蘇酮是3位取代的呋喃化合物，此結構與腐爛的甘薯有毒成分甘薯苦醇為同類化合物，有藥理毒性實驗證明，紫蘇酮會產生神經毒抑制中樞作用，如食草動物的肺水腫，肺充血。但紫蘇酮在50×10-6～100×10-6濃度下，能完全抑制萵苣和大馬唐的生長，可用于農藥生產。紫蘇葉脂溶性提取物及紫蘇精油中含有紫蘇酮，可能會導致神經毒，對機體運動，呼吸及循環中樞產生廣泛的抑制作用。考慮到紫蘇葉脂溶性提取物及紫蘇精油在功能性食品中應用的安全性，必須對紫蘇酮進行脫除。但到目前為止，未見從紫蘇葉及提取物中脫除紫蘇酮的報道。
紫蘇酮的結構式如下 高速逆流色譜(High Speed Countercurrent Chromatography，簡稱HSCCC)是一種新型的液-液分配色譜，其原理是基于樣品在旋轉螺旋管內的互不混溶的兩相溶劑間分配不同而獲得分離，因而無須任何固體載體或支撐體，能達到在短時間內實現高效分離和制備，并且可以達到幾千個理論塔板數。與其它柱色譜相比較，它克服了固定相載體帶來的樣品吸附、損失、污染和峰形拖尾等缺點。目前此項技術已被應用于生化、生物工程、醫藥、天然產物化學、有機合成、環境分析、食品、地質、材料等領域。美國FDA及世界衛生組織(WHO)都引用此項技術作為抗生素成分的分離檢定，90年代以來，HSCCC被廣泛地應用于天然藥物成分和活性成分的分離制備和分析檢定中。國內外的研究表明，HSCCC技術已經從農產品、中草藥等天然產物中分離純化與制備了數百種單體成分，這些成分包括黃酮類、生物堿類、蒽醌類、皂苷類、大環內酯類、多酚類、兒茶素類、多糖類、糖蛋白類等物質。但到目前為止，HSCCC技術也沒有應用于紫蘇酮的分離制備和脫除。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服傳統分離技術的缺陷，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，提供一種從紫蘇葉脂溶性粗提物中脫除紫蘇酮的方法。該方法適用于各種型號的高速逆流色譜儀和不同工藝條件制備的紫蘇葉脂溶性粗提物，脫除率達到99％以上，具有選擇性好，工藝簡單的特點。
本發明的技術方案包括如下步驟采用高速逆流色譜法進行脫除，它包括制備構成固定相、流動相的溶劑體系；先用固定相充滿高速逆流色譜儀柱子，調節主機轉速，將流動相泵入柱內；待體系動態平衡后，由進樣閥進樣；樣品為紫蘇葉脂溶性粗提物或紫蘇精油；根據紫外圖譜監測器分別接收紫蘇酮和其它組分。首先選擇一個溶劑體系的兩相組合，溶劑體系由三個組分構成，A組分可選自正戊烷、正己烷、正庚烷等正構烷烴，B組分可選自甲醇、乙醇、正丁醇等脂肪醇，C組分為水，優先選擇正己烷-甲醇-水體系。
根據溶解度常數，在不破壞體系平衡的情況下，調節A，B，C，三組分的體積比依次為2-6∶1-5∶0.1-2，例如4∶5∶2；5∶3∶1；上述體系上相為固定相，下相為流動相。經一次分離可從紫蘇葉脂溶性粗提物中脫除紫蘇酮，脫除率達到99％以上。
實驗條件適合溫度20-30℃，在上述溫度范圍內，紫蘇酮的脫除效率變化不大，對峰形基本沒有影響。
樣品為不同工藝條件制備的紫蘇葉脂溶性粗提物或紫蘇精油，不需要任何預處理操作，可以直接進樣。
主機轉速和流速需控制在一定范圍，按體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開，采用美國Pharma-Tech Research生產的CCC-1000型高速逆流色譜儀，該機型柱體積為850mL，進樣圈有20mL，并配有BT3020型BiotronikHPLC泵，Knauer UV-Vis檢測器，Pharmacia LKB組分收集器。進樣前，先用固定相充滿高速逆流色譜儀柱子，調整主機轉速為600-1000rpm，以0.5-3mL/min的流速將流動相泵入柱內。
根據紫外圖譜監測器接收除紫蘇酮外的其它組分，濃縮蒸干，即可從紫蘇葉脂溶性粗提物中脫除紫蘇酮，同時得到高純度的紫蘇酮。整個分離過程不超過7h，固定相的保留率為55％左右。采用氣相色譜法(GC)，分析紫蘇酮的脫除率以及紫蘇酮的純度。
本發明采用優選的溶劑系統，控制實驗條件溫度、調整主機轉速和流動相流速的工藝條件，可以高效率的脫除紫蘇酮(脫除率達到99％以上)，同時得到高純度的紫蘇酮(純度達到95％以上)。本方法適用于各種型號的高速逆流色譜儀，具有脫除率高，選擇性好，工藝簡單的特點。
具體實施例方式
實施例1選取正己烷-甲醇-水體系在半制備高速逆流色譜儀上來脫除紫蘇酮。先按4∶4∶2體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜止分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備高速逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20mL進樣圈，柱體積為850mL，BT3020型Biotronik HPLC泵，Knauer UV-Vis檢測器，Pharmacia LKB組分收集器。稱取紫蘇葉脂溶性粗提物1000mg，溶于10mL的兩相溶劑(等體積的上、下相)中待用。進樣前，先用固定相充滿高速逆流色譜儀柱子，調節主機轉速為750rpm，以1mL/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；根據紫外圖譜監測器分別接收紫蘇酮和其它組分，濃縮蒸干。采用氣相色譜法(GC)進行分析，紫蘇酮的脫除率達到99％左右，同時獲得高純度的紫蘇酮。
實施例2選取正戊烷-乙醇-水體系在半制備高速逆流色譜儀上來脫除紫蘇酮。先按4∶2∶1體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜止分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備高速逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20mL進樣圈，柱體積為850mL，BT3020型Biotronik HPLC泵，Knauer UV-Vis檢測器，Pharmacia LKB組分收集器。稱取紫蘇葉脂溶性粗提物1000mg，溶于10mL的兩相溶劑(等體積的上、下相)中待用。進樣前，先用固定相充滿高速逆流色譜儀柱子，調節主機轉速為750rpm，以2mL/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；根據紫外圖譜監測器分別接收紫蘇酮和其它組分，濃縮蒸干。采用氣相色譜法(GC)進行分析，紫蘇酮的脫除率達到99％左右，同時獲得高純度的紫蘇酮。
實施例3選取正庚烷-甲醇-水體系在半制備高速逆流色譜儀上來脫除紫蘇酮。先按6∶5∶2體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜止分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備高速逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20mL進樣圈，柱體積為850mL，BT3020型Biotronik HPLC泵，Knauer UV-Vis檢測器，Pharmacia LKB組分收集器。稱取紫蘇葉脂溶性粗提物1000mg，溶于10mL的兩相溶劑(等體積的上、下相)中待用。進樣前，先用固定相充滿高速逆流色譜儀柱子，調節主機轉速為600rpm，以1.5mL/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；根據紫外圖譜監測器分別接收紫蘇酮和其它組分，濃縮蒸干。采用氣相色譜法(GC)進行分析，紫蘇酮的脫除率達到99％左右，同時獲得高純度的紫蘇酮。
實施例4選取正己烷-乙醇-水體系在半制備高速逆流色譜儀上來脫除紫蘇酮。先按6∶5∶1體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜止分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備高速逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20mL進樣圈，柱體積為850mL，BT3020型Biotronik HPLC泵，Knauer UV-Vis檢測器，Pharmacia LKB組分收集器。稱取紫蘇葉脂溶性粗提物1000mg，溶于10mL的兩相溶劑(等體積的上、下相)中待用。進樣前，先用固定相充滿高速逆流色譜儀柱子，調節主機轉速為800rpm，以1.2mL/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；根據紫外圖譜監測器分別接收紫蘇酮和其它組分，濃縮蒸干。采用氣相色譜法(GC)進行分析，紫蘇酮的脫除率達到99％左右，同時獲得高純度的紫蘇酮。
實施例5選取正己烷-正丁醇-水體系在半制備高速逆流色譜儀上來脫除紫蘇酮。先按4∶5∶2體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜止分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備高速逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20mL進樣圈，柱體積為850mL，BT3020型Biotronik HPLC泵，Knauer UV-Vis檢測器，Pharmacia LKB組分收集器。稱取紫蘇葉脂溶性粗提物1000mg，溶于10mL的兩相溶劑(等體積的上、下相)中待用。進樣前，先用固定相充滿高速逆流色譜儀柱子，調節主機轉速為800rpm，以1.5mL/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；根據紫外圖譜監測器分別接收紫蘇酮和其它組分，濃縮蒸干。采用氣相色譜法(GC)進行分析，紫蘇酮的脫除率達到99％左右，同時獲得高純度的紫蘇酮。
權利要求
1.一種從紫蘇葉提取物中脫除紫蘇酮的方法，它包括制備上相固定相、下相流動相的溶劑體系；先用固定相充滿高速逆流色譜儀柱子，調節主機轉速，將流動相泵入柱內；待體系動態平衡后，由進樣閥進樣；樣品為紫蘇葉脂溶性粗提物或紫蘇精油；根據紫外圖譜監測器分別接收紫蘇酮和其它組分。其特征在于所述的溶劑體系由正戊烷、正己烷或正庚烷，甲醇、乙醇或正丁醇，和水組成，三組分的體積比依次為2-6∶1-5∶0.1-2，上相為固定相，下相為流動相。
2.根據權利要求1所述的一種從紫蘇葉提取物中脫除紫蘇酮的方法，其特征在于所述的主機轉速為600-1000rpm，所述的流動相泵入柱內的流速為0.5-3mL/min。
3.根據權利要求1或2所述的一種從紫蘇葉提取物中脫除紫蘇酮的方法，其特征在于所述的溶劑體系為正己烷-甲醇-水，三組分的體積比依次為4∶4∶2，主機轉速為750rpm，流動相泵入柱內的流速為1mL/min。
4.根據權利要求1或2所述的一種從紫蘇葉提取物中脫除紫蘇酮的方法，其特征在于所述的溶劑體系為正戊烷-乙醇-水，三組分的體積比依次為4∶2∶1，主機轉速為750rpm，流動相泵入柱內的流速為2mL/min。
5.根據權利要求1或2所述的一種從紫蘇葉提取物中脫除紫蘇酮的方法，其特征在于所述的溶劑體系為正庚烷-甲醇-水，三組分的體積比依次為6∶5∶2，主機轉速為600rpm，流動相泵入柱內的流速為1.5mL/min。
6.根據權利要求1或2所述的一種從紫蘇葉提取物中脫除紫蘇酮的方法，其特征在于所述的溶劑體系為正己烷-乙醇-水，三組分的體積比依次為6∶5∶1，主機轉速為800rpm，流動相泵入柱內的流速為1.2mL/min。
7.根據權利要求1或2所述的一種從紫蘇葉提取物中脫除紫蘇酮的方法，其特征在于所述的溶劑體系為正己烷-正丁醇-水，三組分的體積比依次為4∶5∶2，主機轉速為800rpm，流動相泵入柱內的流速為1.5mL/min。
全文摘要
本發明涉及的是一種用高速逆流色譜法(HSCCC)從紫蘇葉脂溶性粗提物中脫除紫蘇酮的方法。它包括制備上相固定相、下相流動相的溶劑體系正構烷烴如正戊烷、正己烷或正庚烷，脂肪醇如甲醇、乙醇或正丁醇，和水組成，三組分的體積比依次為2－6∶1－5∶0.1－2；條件溫度20－30℃，用固定相充滿柱子，主機轉速600－1000rpm，以0.5－3ml/min的流速將流動相泵入柱內；待體系動態平衡后，進樣閥進樣；樣品為紫蘇葉脂溶性粗提物或紫蘇精油；根據紫外圖譜監測器接收除紫蘇酮外的其它組分，濃縮蒸干，即可從紫蘇葉脂溶性粗提物中脫除紫蘇酮，同時得到高純度的紫蘇酮。本方法適用于各種型號的高速逆流色譜儀和不同工藝條件制備的紫蘇葉脂溶性粗提物，脫除率達到99％以上，具有選擇性好，工藝簡單的特點。
文檔編號B01D15/08GK1973856SQ20061016748
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月28日 優先權日2006年12月28日
發明者胡曉丹, 王建中, 張德權, 孫愛東, 王曉楠, 劉玉軍 申請人:胡曉丹