專利名稱：一種測定硫普羅寧濃度的方法
技術領域：
本發明屬分析化學領域，具體涉及一種經化學衍生化后利用液相色譜法定量測定硫普羅寧的方法。
背景技術：
硫普羅寧(Tiopronin)，分子式為HS-CH(CH3)-CONH-CH2-COOH。
硫普羅寧首先在日本上市，而后德、意、美、瑞士等國家相繼作為改善肝功能藥物應用臨床。國外長期使用證實該藥能全面、明顯改善病毒性肝炎、酒精性肝損傷的肝功能指標及有關癥狀，具有療效確切、安全可靠等特點。硫普羅寧用于慢性肝炎的輔助治療，安全性高，多數不良反應輕微且短暫。
已報道的硫普羅寧濃度的測定方法有分光光度法、化學發光法、電化學氧化后安培檢測法、流動注射熒光檢測法和伏安法，這些方法操作繁瑣且靈敏度和專屬性差；衍生化后氣相色譜聯用質譜法，儀器費用昂貴，且重現性差，難以在大多數分析實驗室中實施。
發明內容
本方法的目的是提供一種簡便而準確的測定樣品中硫普羅寧濃度的方法。
本發明的技術方案通過如下方法和步驟施行取待測樣品(血漿、尿液、腦脊液、生物組織等生物材料以及制劑和原料藥)，加入穩定劑，再加入過量的衍生化試劑和催化劑反應，加入定量的提取溶劑進行液液提取進行樣品處理，漩渦，離心，取有機相吹干，用定量復溶試劑復溶，用液相色譜法測定硫普羅寧衍生物的濃度。
本發明所述的樣品進行預處理，采用蛋白沉淀、稀釋過濾、液液萃取或固相萃取。
上述測定硫普羅寧濃度的方法中，加入的穩定劑為EDTA-2Na和微生素C。
上述測定硫普羅寧濃度的方法中，加入的催化劑為0.1mol/L NaOH。
上述測定硫普羅寧濃度的方法中，加入的提取溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、苯、甲苯或三氯甲烷。
上述測定硫普羅寧濃度的方法中，加入的復溶試劑為乙腈。
上述測定硫普羅寧濃度的方法中，所用衍生化試劑為通式(1)的對溴苯乙酰基溴。
上述測定硫普羅寧濃度的方法中，所用反應溶劑為水、乙腈、丙酮、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、甲苯、苯、乙醚、乙酸乙酯、二甲亞砜或石油醚。
上述測定硫普羅寧濃度的方法中，采用液相色譜-紫外檢測器測定硫普羅寧衍生物的峰面積，用標準曲線校正方程換算成硫普羅寧的濃度。
上述測定硫普羅寧濃度的方法中，采用通用型的液相色譜柱，其填料為十八烷基鍵合相硅膠、辛烷基鍵合相硅膠或者氰基鍵合相硅膠。
本發明方法能排除其他物質對硫普羅寧的干擾，采用通用型的液相色譜柱和紫外檢測器即可對樣品中硫普羅寧進行高效液相色譜測定，本方法簡便、準確、可靠，線性范圍10~1000ng，最小檢出量3.3ng，線性相關系數r＝0.9989，RSD小于15％，平均回收率70％以上。本方法可用于血漿、尿液、腦脊液、生物組織等生物材料以及制劑和原料藥中硫普羅寧濃度的定量測定。
圖1為典型色譜圖，其中A空白血漿；B血漿中硫普羅寧衍生物對照品；C血漿樣品。
圖2為典型色譜圖，其中A空白；B制劑樣品；C硫普羅寧衍生物對照品。
具體實施例方式
實施例1色譜條件美國Angilent HP-1100型高效液相色譜儀，包括在線脫氣、四元泵、柱溫箱、紫外檢測器、惠普色譜工作站及20μL手動進樣系統；色譜柱Diamonsil TMC18(150×4.0mm I.D.，5μm)；柱溫30oC；流動相pH1.8三氟乙酸水溶液-乙腈60∶40；流速1.0mL/min；檢測波長263nm。
樣品制備
取血漿樣品1mL，精密加入內標溶液40μL(50μg/mL奧沙普秦)，加入0.5mg/mL p-BPB甲醇液(對溴苯乙酰基溴，2，4’-Dibromacetophenon，化學式4-(Br)C8H4COCH2Br)40μL，再加入0.1mol/L NaOH 40μL，搖勻，避光室溫放置30min，加入1mol/L HCl 400μL，搖勻，加入乙酸乙酯5mL，漩渦振蕩2min，8000rpm高速離心15min后，取上層有機相，用氮氣吹干，殘渣加入80μL乙腈復溶，然后取20μL進樣作HPLC測定。
線性試驗取空白血漿1mL，分別加入硫普羅寧對照品溶液，使血漿濃度分別為0.04、0.2、0.4、1、2、3和4μg/mL，以下按“樣品制備”項處理。以衍生物峰面積與內標峰面積之比(Y)，對藥物濃度(C，ng/mL)進行線性回歸，計算結果為Y＝0.05192×C-0.0122(r＝0.9989，n＝7)。
精密度和回收率試驗取空白血漿1mL，分別加入硫普羅寧標準溶液，配制高、中、低三個濃度點(0.04、0.4和4μg/mL)的標準血樣，每個濃度點平行5份，以下按“樣品制備”項處理。根據線性回歸方程計算其實測濃度，計算每種濃度的實測平均值及相對標準偏差，精密度以相對標準偏差(RSD)表示，(C實測/C理論)×100％即為回收率。表1是精密度和回收率試驗結果。
表1
實施例2樣品制備取尿樣1mL，精密加入內標溶液40μL(50μg/mL奧沙普秦)，加入0.5mg/mLp-BPB甲醇液(對溴苯乙酰基溴，2，4’-Dibromacetophenon，化學式4-(Br)C8H4COCH2Br)40μL，再加入0.1mol/L NaOH 40μL，搖勻，避光室溫放置30min，加入1mol/L HCl 400μL，搖勻，加入乙酸乙酯5mL，漩渦振蕩2min，8000rpm高速離心15min后，取上層有機相，用氮氣吹干，殘渣加入80μL乙腈復溶，然后取20μL進樣作HPLC測定。
線性試驗分別加入硫普羅寧對照品溶液，使血漿濃度分別為0.04、0.2、0.4、1、2、3和4μg/mL，以下按“樣品制備”項處理。以衍生物峰面積與內標峰面積之比(Y)，對藥物濃度(C，ng/mL)進行線性回歸，計算結果為Y＝0.0788×C-0.0065(r＝0.9978，n＝7)。
實施例3樣品制備取內含硫普羅寧的制劑少許稱重，以25ml乙腈溶解，過濾并用乙腈洗滌不溶物，合并濾液及洗滌液于100ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度。取溶液100μL，加入0.5mg/mL p-BPB甲醇液(對溴苯乙酰基溴，2，4’-Dibromacetophenon，化學式4-(Br)C8H4COCH2Br)40μL，再加入0.1mol/L NaOH 40μL，搖勻，避光室溫放置30min，加入0.1mol/L HCl 40μL，然后取20μL進樣作HPLC測定。
線性試驗精密分別取1、5、10、50、100、200μg/mL硫普羅寧標準溶液100μL，按“樣品制備”項處理。以衍生物峰面積對硫普羅寧濃度進行線性回歸，其回歸方程為A＝65.95C-28.93，相關系數r＝0.9997。
權利要求
1.一種測定硫普羅寧濃度的方法，其特征是包括下述步驟1)取待測樣品，加入穩定劑，2)加入過量的衍生化試劑和催化劑反應，3)加入定量的提取溶劑進行樣品預處理，4)復溶試劑復溶，5)液相色譜法測定硫普羅寧衍生物的濃度。
2.根據權利要求1所述的測定硫普羅寧濃度的方法，其中所述的待測樣品包括血漿、尿液、腦脊液、生物材料以及制劑和原料藥。
3.根據權利要求1所述的測定硫普羅寧濃度的方法，其特征是所述的穩定劑為EDTA-2Na和微生素C。
4.根據權利要求1所述的測定硫普羅寧濃度的方法，其特征是所述的的催化劑為0.1mol/L NaOH。
5.根據權利要求1所述的測定硫普羅寧濃度的方法，其特征是所述的的提取溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、苯、甲苯或三氯甲烷。
6.根據權利要求1所述的測定硫普羅寧濃度的方法，其特征是所述的的復溶試劑為乙腈。
7.根據權利要求1所述的測定硫普羅寧濃度的方法，其特征是所述的衍生化試劑為式(1)的對溴苯乙酰基溴，
8.根據權利要求1所述的測定硫普羅寧濃度的方法，其特征是所述的反應溶劑為水、乙腈、丙酮、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、甲苯、苯、乙醚、乙酸乙酯、二甲亞砜或石油醚。
9.根據權利要求1所述的測定硫普羅寧濃度的方法，其特征是所述的液相色譜法是采用液相色譜-紫外檢測器測定硫普羅寧衍生物的峰面積，用標準曲線校正方程換算成硫普羅寧的濃度。
10.根據權利要求9所述的測定硫普羅寧濃度的方法，其特征是所述的液相色譜法采用通用型的液相色譜柱，其填料為十八烷基鍵合相硅膠、辛烷基鍵合相硅膠或氰基鍵合相硅膠。
全文摘要
本方法公開了一種測定硫普羅寧濃度的方法。以由結構式(1)表示的對溴苯乙酰基溴對樣品中硫普羅寧進行化學衍生化之后，再采用高效液相色譜法測定硫普羅寧衍生物。此方法能排除其他物質對硫普羅寧的干擾，采用通用型的液相色譜柱和紫外檢測器即可對硫普羅寧進行高效液相色譜測定，線性范圍10～1000ng，最小檢出量3.3ng。血漿中硫普羅寧回收率70％以上，RSD小于15％。本發明可十分準確地用于血漿、尿液、腦脊液、生物組織等生物材料以及原料藥和制劑中硫普羅寧濃度的定量測定。
文檔編號B01J20/281GK1766603SQ200510029990
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月23日 優先權日2005年9月23日
發明者段更利, 黃滔敏 申請人:復旦大學