專利名稱：免疫球蛋白的純化方法
技術領域：
本發明涉及抗體制備的領域，更具體地說，涉及用于分離抗體的分離基質。本發明也包括裝有新基質的層析柱和分離抗體的方法。
背景技術：
免疫系統由許多相互依賴的細胞類型構成，它們共同保護身體免于細菌、寄生蟲、真菌、病毒的感染，并防止腫瘤細胞生長。免疫系統的哨兵是巨噬細胞，這些巨噬細胞在它們的宿主血流中不斷地漫游。在受到感染或免疫接種攻擊時，巨噬細胞做出的反應是吞噬侵入物，該侵入物被識別為外源分子，稱作抗原。這個由輔助T細胞介導的過程，顯示了復雜的反應鏈，導致刺激β-細胞。這些β-細胞進而產生出與外源侵入物結合的蛋白質，稱作抗體。這種抗體和抗原之間的結合過程標志著外源侵入物經過補體系統的吞噬或激活而被解體。有五種不同類別的抗體即免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些抗體不僅在它們的生理作用方面有所不同，而且在結構上也有所不同。從結構上說，IgG抗體是一類特殊的免疫球蛋白，也許因為它們在成熟免疫應答中起著主要作用，因此對其進行了廣泛深入的研究。
免疫球蛋白所具有的生物活性如今已被應用于各種不同的應用領域，例如人或獸醫的診斷、保健和治療領域。實事上，在最近幾年中，單克隆抗體和重組抗體構建體已經成為目前在臨床試驗中研究的最大類的蛋白質，并被FDA批準為治療和診斷用藥物。為了補充表達系統和生產策略，純化流程被設計成用簡單、經濟實惠的方式來獲得非常純的抗體。
免疫球蛋白的傳統分離方法是基于選擇性可逆沉淀包含免疫球蛋白的蛋白質級分，而把其它類的蛋白質留在溶液中。典型的沉淀劑是乙醇、聚乙二醇、感膠離子鹽即抗離液鹽(如硫酸銨和磷酸鉀)以及辛酸。通常，用這些沉淀方法所得到的產物非常不純而且費時、費力。此外，向原料中加入沉淀劑不利于使用上清液作其它用途而且引起了清除問題，特別是在大量純化免疫球蛋白時。
離子交換層析是另一種眾所周知的蛋白質分級分離方法，常常用于分離免疫球蛋白。然而，由于荷電離子交換配體會與所有帶相反電荷的化合物起反應，因此離子交換層析的選擇性會比其它層析分離的選擇性稍低一些。
A蛋白和G蛋白親和層析是受歡迎的和廣泛使用的免疫球蛋白分離純化方法，尤其是用于分離單克隆抗體，主要是由于易于使用而且可獲得高純度。慣常配合采用離子交換、疏水作用、羥基磷灰石(hydrxyapatite)和/或凝膠過濾步驟，特別是以A蛋白為基礎的一些方法，已經成為許多生物制藥公司選擇的抗體純化方法。然而，盡管這些方法可以共用，但仍然存在著對于有效替代方法不斷增長的需要和要求，這些方法針對有關以A蛋白為基礎的培養基的常見問題，如成本、當pH值增加時的滲漏和不穩定性。
疏水作用層析(HIC)也是一種被全面描述的用于分離免疫球蛋白的方法。然而，疏水基質需要向原材料中加入感膠離子鹽以使免疫球蛋白有效地結合。通過連續梯度或分級梯度降低感膠離子鹽的濃度，將已結合的抗體從基質中釋放出來。如果想要獲得高純度的產物，建議將疏水層析和進一步的步驟配合使用。因此，這種方法的缺點是需要向原材料中加入感膠離子鹽，這就產生了新問題，并因此增加了大批量用戶的成本。對于除了細胞培養物上清以外的其它原材料，例如乳清、血漿和卵黃，在大量應用中，在很多情況下是禁止向原材料中加入感膠離子鹽的，因為鹽會防礙耗去原材料的免疫球蛋白的任何經濟可行的使用。另一個在大量應用中的問題就是幾千公升廢物的清除。
親硫吸附層析作為一種新的分離免疫球蛋白的層析吸附原理，由J.Porath于1985年提出(J.Porath等；FEBS Letters，第185卷，第306頁，1985)。在這篇論文中，描述了如何將二乙烯基砜活化瓊脂糖與各種包含游離巰基的配體偶合，顯示免疫球蛋白在0.5M硫酸鉀即感膠離子鹽存在下發生特異結合。人們假設砜基(來自乙烯砜間隔基)和配體中所得的硫醚是一種結構需要，以獲得所描述的抗體結合的特異性和能力。然而接下來還介紹了，如果配體還包含芳基，那么硫醚可能會被氮或氧所置換(K.L.Knudsen等，Analytical Biochemistry，第201卷，第170頁，1992)。盡管所描述的用于親硫層析的基質通常有良好的性能，但它們也有較大的缺點，就是需要向原材料中加入感膠離子鹽以確保免疫球蛋白的有效結合，基于上述已討論過的原因，這是一個難題。
已經公開了與環氧活化瓊脂糖偶合的其它親硫配體(J.Porath等，Makromol.Chem.，Makromol.Symp.，第17卷，第359頁，1998；A.Schwarz等，Journal of Chromatography B，第664卷，第83-88頁，1995)，例如2-巰基吡啶、2-巰基嘧啶和2-巰基噻唑啉。然而，在沒有添加感膠離子鹽的情況下，所有這些親和基質的親和常數仍然不足以確保抗體的有效結合。
US 6,498,236(Upfront Chromatography)涉及免疫球蛋白的分離。所公開的方法包括下述步驟使包含帶負電荷洗滌劑并含有免疫球蛋白的溶液與固相基質接觸，從而使至少部分免疫球蛋白可以與固相基質結合；使固相基質與洗脫液接觸，以從固相基質中釋放出免疫球蛋白。含免疫球蛋白溶液的特征還在于其pH范圍為2.0-10.0，總的含鹽量相當于最大為2.0時的離子強度，感膠離子鹽的濃度最大為0.4M。相信存在于溶液中的洗滌劑可以阻遏其它生物分子與基質的粘合，例如硫酸辛酯、溴酚藍、辛烷磺酸酯、月桂基肌氨酸鈉和己烷磺酸酯。固相基質用式M-SP1-L定義，其中M是指基質骨架，SP1是指包含單或二環芳族部分或者是雜芳族部分的配體。
Liu等(Yang Liu，Rui Zhao，Dihua Shangguan，Hongwu Zhang，Guoquan LiuNovel sulfmethazine ligand used for one-step purificationof immunoglobulin G from human plasma，Journal of Chromatography B，792(2003)177-185)研究了sulfmethazin(SMZ)與人IgG的親和力。因此，公開了包含磺酰基的配體，其中R基團是雜環。根據這篇文章，將SMZ固定在單分散性、無孔的、交聯聚(縮水甘油基甲基丙烯酸酯)珠子上。然后在高效親和層析法中使用這些珠子以從人血漿中分離出IgG。在pH 5.5時達到最大吸附。這些珠子顯示了與其它蛋白質最小的非特異相互作用。因此，配體能夠吸附抗體，而它們與其它蛋白質的相互作用又恰好足以在所用的吸附緩沖液中提供阻滯作用。然而，眾所周知，酯化合物如甲基丙烯酸酯隨著pH值增高易于被水解。因此，與A蛋白和G蛋白基質類似，其中所公開的分離基質預期在通常的現場清潔(cip)工序中是不穩定的。
US 4,725,355涉及包含載體和吸附劑的體液純化培養基，該培養基包括至少一種磺胺類藥物，用于吸附和除去體液中的致病物質。所述磺胺類藥物是化療藥，更具體地說是特征為芳族R基團的磺酰胺。通過體液進口和出口之間的容器的體液流路可以提供培養基。
EP 0 197 521涉及免疫球蛋白吸附劑和吸附裝置。更具體地說，公開了用于免疫球蛋白的吸附劑，這種吸附劑包括含羥基的不溶于水的載體，載體上帶有雙胺化合物。雙胺化合物由以下通式表示NH2(CH2)nNH2其中n為3-9的整數。所述化合物通過硅烷偶聯劑或其衍生物連接，而雜環化合物通過雙官能試劑連接到雙胺上。因此R基團是芳族結構。
然而，仍然需要純化抗體或抗體構建體的替代方法，這些方法能夠滿足純度、安全性、功效和經濟可行的要求。
發明簡述因此，本發明的一方面是pH值約為中性時能夠在低離子強度吸附抗體的分離基質。這可以通過權利要求1中所限定的分離基質實現。
本發明的另一方面是能夠高度選擇性地吸附抗體的分離基質。
本發明的具體方面是能吸附抗體而其它蛋白質不需要任何必需相互作用就可以通過的分離基質。
本發明的再一方面是制備用于分離抗體的基質的方法，這包括能夠通過親硫鍵、疏水鍵和/或氫鍵相互作用吸附抗體的官能團，這種方法易于改變配體結構。這可以通過將胺和/或多胺固定到多孔載體以及隨后將所述固定化胺磺酰化的步驟得以實現。
本發明的又一方面是通過把液體中的抗體吸附到分離基質上來分離抗體的方法，這種方法不要求添加任何洗滌劑就可以達到吸附。
根據下文的發明詳述，本發明的其它方面和優勢將會變得顯而易見。
附圖簡述
圖1顯示一些選擇的與載體有潛在結合點的磺酰化胺的實例。
定義本文所用的術語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文可互換使用。
術語“配體”在本文中意指能夠和靶化合物相互作用的分子或化合物如抗體。
術語“間隔臂”在本文中意指把配體與分離基質的載體隔開的元素。
“伯胺”定義為分子式RNH2，其中R是指有機基。
“仲胺”定義為分子式R2NH，其中R是指有機基。
術語“磺酰胺”使用的是它的普通含義，即對于任何化合物來說，磺酰胺都是包含磺酸的一個或多個酰胺。
磺酰基定義為分子式-S(＝O)2R，其中R是指有機基。
術語“洗脫液”在本文中使用的是它的普通含義，即可從分離基質中釋放出一種或多種化合物的適當pH和/或離子強度的緩沖液。
發明詳述第一方面，本發明涉及一種分離基質，其包含固定有配體的多孔載體，所述配體任選通過間隔臂固定，其中所述配體包含一個或多個磺酰胺，其中磺酰基的至少一個R基團是脂族化合物。
在一個實施方案中，磺酰胺通過其氮與多孔載體偶合。在另一個實施方案中，磺酰胺通過其硫與多孔載體偶合。然而，本發明也包括分離基質，該分離基質包含以不同方向偶合的磺酰胺，即作為酰胺-偶合和砜-偶合的磺酰胺混合物的配體。
在一個實施方案中，所述配體包含至少一個伯胺或仲胺。
分離基質可以用于分離(例如純化或分析)抗體和其它表現出等同結合性質的化合物，例如包含免疫球蛋白部分或抗體片段的融合蛋白。本發明的發明人已經表明，用包含一個或多個磺酰胺的分離基質，就能夠高容量、極佳選擇性地純化抗體。與上述US6,498,236不同，它利用芳族部分或雜芳族部分作為抗體純化的離子交換配體，本發明不需要向液體中添加洗滌劑就可以達到純化，所述液體在用無荷電配體接觸基質之前就包含有抗體。
眾所周知，磺酰胺含有胺，其中所述胺的至少一個R基團是磺酰基。在本發明基質的一個實施方案中，磺酰基的R基團是脂族無環基或脂族環基，例如1-4、例如1-2個碳原子和/或雜原子的直鏈，其中的一個或多個氫被雜原子取代。在一個實施方案中，磺酰基的脂族R基團是甲基。在另一個實施方案中，磺酰基的脂族R基團是乙基。
在一個替代的實施方案中，磺酰基的R基團是取代或未取代的芳族基，例如單芳族基或多芳族基。在又一個實施方案中，磺酰基的R基團不僅包含脂族基而且包含芳族基。
在本發明分離基質的一個實施方案中，配體是磺酰化單胺，例如半胱胺或氨。在一個替代的實施方案中，配體是磺酰化多胺，例如三亞乙基四胺(trietylentetraamine)。這種磺酰化多胺可以包含任何合適數量的胺，例如2-10個。在說明性的實施方案中，每個多胺都包含2-6個胺。
在本發明分離基質的一個具體實施方案中，配體是作為固定到載體上的聚合物的重復單元出現的。所述聚合物可以是任何合適的多胺，例如聚亞烷基亞胺。在一個實施方案中，聚合物是聚乙烯胺。本領域技術人員將會認識到，這種聚合物的胺含量可以不同，例如包含任何所需次序的伯胺和/或仲胺。因此，在一個實施方案中，所述聚合物顯示有兩個或多個不同的配位基。按照本領域的標準方法，所述聚合物易于由合適的單體產生。將多胺偶合到載體的方法為本領域技術人員通曉且易于實施，例如通過原位聚合或接枝聚合物，參見例如PCT/SE02/02159(Ihre等)。這個實施方案的優點在于能夠得到最佳性能的分離基質，例如通過改變聚合物長度、支鏈等等。
在一個實施方案中，配體是無環化合物。
本發明分離基質的多孔載體可以是任何合適的材料。在一個實施方案中，載體由交聯碳水化合物材料構成，例如瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、魔芋(konjac)、角叉菜聚糖、吉蘭糖(gellan)、藻酸鹽等等。所述載體可以按照標準方法制備，例如反懸浮膠凝作用(S HjerténBiochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)。或者，載體是商售產品，例如瓊脂糖凝膠TMFF(SepharoseTMFF)(AmershamBiosciences AB，Uppsala，瑞典)。因此，在本發明基質的一個實施方案中，載體是交聯多糖。在具體的實施方案中，所述多糖是瓊脂糖。通常將這種碳水化合物材料在其配體上固定化之前烯丙基化。簡單地說，可以按照標準方法，用烯丙基縮水甘油醚、烯丙基溴或任何其它合適的活化劑進行烯丙基化。
在一個替代的實施方案中，本發明分離基質的多孔載體由交聯合成聚合物構成，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等等。按照標準方法，容易制備出這些聚合物的載體，參見例如“Styrene basedpolymer supports developed by suspension polymerization″(R ArshadyChimica e L′Industria 70(9)，70-75(1988))。或者，SourceTM(AmershamBiosciences AB，Uppsala，瑞典)等商售產品可以按照本發明進行表面改性。然而，在這個實施方案中，優選將載體的表面改性以增加其親水性，通常是將大部分暴露殘基雙鍵轉化成羥基。
本發明任何合適形式的分離基質如層析基質，可以是如大體球形粒子或整塊的；濾片或膜；芯片、表面、毛細管等等。因此，本發明也包括填充上述基質的層析柱。在一個有利的實施方案中，所述柱是由普通材料做成，例如生物相容性塑料如聚丙烯，或者是玻璃。柱的大小可適于試驗室純化抗體，也可適于大量純化抗體。在一個具體的實施方案中，本發明的柱帶有luer銜接頭、連接管和圓頂形螺帽。因此，本發明也包括試劑盒，該試劑盒包括填充上述分離基質的層析柱；至少一種緩沖液；使用說明書，用于說明在分離區室中純化抗體的步驟。在一個具體的實施方案中，本發明的試劑盒也包括luer銜接頭、連接管和圓頂形螺帽。
第二方面，本發明涉及一種用于分離抗體的基質的制備方法，該方法包括第一步，將胺和/或多胺固定到多孔載體上；第二步，使所述胺磺酰化。多孔載體可以如上所述，任何標準固定化方法都可以使用，參見例如Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson等，Greg T.Hermanson，A.Krishna Mallia和Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992。然而，本領域技術人員將會認識到，一些分離基質同樣可以通過將磺酰胺直接固定到載體上進行制備，這取決于配體的性質。
第三方面，本發明涉及從液體中分離抗體的方法，該方法包括下述步驟(a)提供包含至少一種抗體的液體(b)使所述液體與包含至少一個或多個磺酰胺基團的分離基質接觸，由此一種或多種抗體就吸附到所述基質上了；任選地，(c)讓洗脫液通過所述基質以釋放出一種或多種抗體；(d)從洗脫液的流分中回收至少一種抗體。
在本文中，應該理解，術語“抗體”也包括抗體片段和任何包含抗體或抗體片段的融合蛋白。因此，本發明方法可用于分離任何免疫球蛋白樣分子，這些分子有抗體的結合特性。包含抗體的液體例如可以是來源于產生抗體的細胞培養物或發酵肉湯的液體，希望從中純化出一種或多種所需要的抗體。或者，液體可以是血液或血漿，希望從中除去一種或多種抗體以獲得純的液體。因此，在本發明方法的一個實施方案中，步驟(a)所提供的液體也包含一種或多種不是抗體的其它蛋白質。正如在下面的實驗部分所表明的，通常，本發明方法能夠以相對低的離子強度選擇性吸附抗體。意想不到的是，本發明的發明人發現了使用有一個或多個磺酰胺基團的多孔分離基質能夠只吸附抗體，而不吸附除抗體以外的其它蛋白質。因此，本發明方法提供高產量的純的抗體制劑。用常規試驗，本領域技術人員就能夠容易地選擇用于每種磺酰胺配體結構的最佳條件，這將在以下實驗部分進行討論。例如，本領域眾所周知，可以通過改變凝膠的性質將分離基質的性能最佳化；在這種情況下，可改變磺酰胺的R基團或取代度，即載體上的配體密度。也可將用于每種配體的吸附緩沖液中的鹽濃度最佳化。因此，在本發明的一個實施方案中，步驟(b)吸附的鹽濃度約為0.25M Na2SO4。在一個具體的實施方案中，配體包含單胺，在鹽濃度高于約0.5M Na2SO4時實施步驟(b)。
本發明方法可以使用任何合適形式的分離基質如層析基質，可以是例如大體球形粒子或整塊的；濾片或膜；芯片等等。因此，在一個有利的實施方案中，步驟(b)的分離基質在層析柱中。
步驟(b)的分離基質的載體和配體可以是上述中的任何一種。
如上所述，本發明已經意想不到地發現，使用本發明的新型分離基質，能夠在中性pH時高選擇性地吸附抗體。因此，在一個實施方案中，在pH 6.5-8.3，例如7.2-7.6，如約7.4時實施步驟(b)。
通過標準洗脫，例如通過使用遞減離子強度的洗脫液，可容易地釋放出吸附到柱子上的抗體。因此，在一個實施方案中，步驟(c)是梯度洗脫，通過向分離基質中加入遞減鹽濃度的洗脫液進行，優選使所述洗脫液通過基質。所述梯度可以是任何形狀的梯度，例如線性梯度或階式梯度。其它的洗脫方案同樣有用，例如在洗脫液中添加競爭性結合劑，向洗脫液中添加會置換基質上已吸附的抗體的化合物如乙醇、鹽等等，或者改變溫度等等。
或者，通過調節pH如降低或增加pH來實施步驟(c)的洗脫。如上所述，pH調節也可以與鹽梯度結合起來。在一個具體的實施方案中，步驟(b)在高于中性的pH時實施，而步驟(c)是通過加入遞減pH的洗脫液實施梯度洗脫。
本發明方法可用來回收任一種單克隆抗體或多克隆抗體，例如來源于哺乳動物宿主如小鼠、嚙齒動物、靈長類動物和人的抗體，或者來源于培養細胞如雜交瘤的抗體。在一個實施方案中，從步驟(d)中回收的抗體是人抗體或人源化抗體。抗體可以是任一類別的抗體，也就是說，選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在一個具體的實施方案中，從步驟(d)中回收的抗體是免疫球蛋白G(IgG)。本發明也包括任一上述抗體的片段和包含這些抗體的融合蛋白的純化。
本發明方法可以定量吸附抗體。因此，在一個實施方案中，本發明方法除了包括如上定義的方法外，還包括步驟(e)即用分光光度法測定抗體數量。上述方法和有用的設備是本領域技術人員眾所周知的。這種方法在分析步驟中同樣有用。
最后，本發明也涉及一種分離基質，其包含固定有配體的多孔載體，所述配體任選通過間隔臂固定，其中所述配體包含一個或多個乙酰胺基團。這樣的乙酰胺基團例如可以是三亞乙基四胺。有關磺酰胺基質的載體上文已有描述。本領域技術人員用標準方法，例如上文已提到的一些方法，就可以容易地將乙酰胺基團固定到多孔載體上。本發明的這一方面也包括液相層析法，該方法使用的是包含乙酰胺配體的分離基質。這種方法可用于分離生物分子，例如蛋白質、病毒、核酸如DNA或RNA、質粒等等。本領域技術人員可容易地對用于吸附和洗脫的適當條件作出選擇。
附圖詳述圖1顯示一些選擇的與載體有潛在結合位點的磺酰化胺的實例。更具體地說，圖1從左到右顯示半胱胺；氨(上一行)；二亞乙基三胺；和三亞乙基四胺(下一行)。
實施例部分本實施例僅用于說明本發明，不得解釋為對本發明范圍的限制，本發明范圍由所附權利要求限定。下文或本說明書其它部分所給出的所有參考文獻均通過引用結合到本文中。
實施例1磺酰胺分離基質的制備下面所提供的是有關本發明分離基質的制備，其中磺酰基的R基團是脂族基。
概要基質的容積是指沉降床容積。
基質的重量(克)是指吸水干重。當然這些基質仍然是水溶性溶劑化材料。
由于使用磁力攪拌棒會直接損壞珠子，因此對于大規模反應攪拌，是指上掛式電動攪拌器。在封閉的小瓶中進行小規模反應(凝膠最多20ml或20g)，則攪拌是指使用搖床。
使用常規方法分析官能團并測定烯丙基化、環氧化的程度，或者珠子上的離子交換基團的取代度。這些方法最后通過附加凝膠的元素分析，特別是對硫原子的元素分析進行補充。
下面舉例說明本發明分離基質的一種制備方法，由交聯瓊脂糖凝膠(瓊脂糖凝膠(Sepharose)TM6FF，Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)開始。對于每一步驟都有具體的實施例進行說明。
A.基質上引入烯丙基如下所述，用烯丙基縮水甘油醚活化瓊脂糖凝膠(Sepharose)TM將100g瓊脂糖凝膠6FF的水分吸干成78g，與0.4g NaBH4、11g Na2SO4和60ml 50％NaOH水溶液混合。將所得混合物于50℃攪拌1小時。加入80ml烯丙基縮水甘油醚后，將懸浮液于50℃再劇烈攪拌20小時。過濾混合物后，凝膠依次用500ml蒸餾水、500ml乙醇、200ml蒸餾水、200ml 0.2M乙酸和500ml蒸餾水洗滌。滴定分析得出取代度為0.4mmol烯丙基/ml凝膠。
B.基質上引入胺基除了半胱胺的固定化是在特殊的自由基加成條件下進行外，基質上直接通過胺基的氮原子引入胺基。在一個典型的方法中，通過在堿性條件下溴化烯丙基和親核取代優先實現偶合到基質上。
半胱胺瓊脂糖凝膠TM(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)10g烯丙基活化凝膠(0.4mmol烯丙基/ml排水凝膠)用二烷洗滌，轉移到裝有12ml二烷中含半胱胺-HCl(1g)的溶液的反應容器中。將反應溫度加熱到70℃并加入AIBN(0.9g)。于70℃攪拌下，反應17小時。過濾反應混合物后，凝膠依次用3×10ml二烷、3×10ml乙醇、3×10ml蒸餾水、3×10ml 0.5M HCl水溶液和3×10ml蒸餾水洗滌。得到半胱胺瓊脂糖凝膠TM，取代度為0.34mmol胺/ml凝膠。
通過溴化作用活化烯丙基瓊脂糖凝膠TM將溴加入到100ml烯丙基活化瓊脂糖凝膠TM6FF(0.4mmol烯丙基/ml排水凝膠)、4g AcONa和100ml蒸餾水的攪拌懸浮液中，直至獲得持久性黃色溶液。然后加入甲酸鈉直至懸浮液完全脫色。過濾反應混合物，凝膠用500ml蒸餾水洗滌。然后將活化的凝膠直接轉移到反應容器中，再與合適的配體進一步反應。
二亞乙基三胺瓊脂糖凝膠TM將10g溴活化的凝膠(0.4mmol烯丙基/ml排水凝膠)轉移到裝有二亞乙基三胺溶液(12.5ml)的反應瓶中。于50℃攪拌下，反應17小時，過濾反應混合物后，凝膠依次用3×10ml蒸餾水、3×10ml 0.5M HCl水溶液和3×10ml蒸餾水洗滌。得到二亞乙基三胺瓊脂糖凝膠TM，取代度為0.56mmol胺/ml凝膠。
三亞乙基四胺瓊脂糖凝膠TM將10g溴活化的凝膠(0.4mmol烯丙基/ml排水凝膠)轉移到裝有三亞乙基四胺溶液(12.5ml)的反應瓶中。于50℃攪拌下，反應17小時。過濾反應混合物后，凝膠依次用3×10ml蒸餾水、3×10ml 0.5M HCl水溶液和3×10ml蒸餾水洗滌。得到三亞乙基四胺瓊脂糖凝膠TM，取代度為0.62mmol胺/ml凝膠。
五亞乙基六胺瓊脂糖凝膠TM將10g溴活化的凝膠(0.4mmol烯丙基/ml排水凝膠)轉移到裝有五亞乙基六胺溶液(12.5ml)的反應瓶中。于50℃攪拌下，反應17小時。過濾反應混合物后，凝膠依次用3×10ml蒸餾水、3×10ml 0.5M HCl水溶液和3×10ml蒸餾水洗滌。得到五亞乙基六胺瓊脂糖凝膠TM，取代度為0.61mmol胺/ml凝膠。
聚乙烯亞胺瓊脂糖凝膠TM將10g溴活化的凝膠(0.4mmol烯丙基/ml排水凝膠)轉移到裝有12.5ml聚乙烯亞胺溶液(50％水溶液)的反應瓶中。于50℃攪拌下，反應17小時。過濾反應混合物后，凝膠依次用3×10ml蒸餾水、3×10ml0.5M HCl水溶液和3×10ml蒸餾水洗滌。得到聚乙烯亞胺瓊脂糖凝膠TM，取代度為0.45mmol胺/ml凝膠。
氨瓊脂糖凝膠TM1)將10g溴活化的凝膠(0.32mmol烯丙基/ml排水凝膠)轉移到裝有疊氮化鈉(1g)的水(3ml)溶液的反應瓶中，通過加入50％NaOH水溶液，調節pH為12。于50℃攪拌下，反應17小時。過濾反應混合物后，凝膠依次用3×20ml蒸餾水和3×10ml DMF洗滌。將排水凝膠在DTE(1.5g)和DBU(1.2ml)的DMF(7.5ml)溶液中在室溫下攪拌18小時進行進一步還原。過濾反應混合物后，凝膠依次用3×10mlDMF、3×10ml乙醇和3×10ml蒸餾水洗滌。得到胺瓊脂糖凝膠TM，取代度為0.21mmol胺基/ml凝膠。
2)將10g溴活化的凝膠(0.4mmol烯丙基/ml排水凝膠)轉移到裝有疊氮化鈉(1g)的水(3ml)溶液的反應瓶中，通過加入50％NaOH水溶液，調節pH為12。于50℃攪拌下，反應17小時。過濾反應混合物后，凝膠依次用3×20ml蒸餾水和3×10ml DMF洗滌。將排水凝膠在DTE(1.5g)和DBU(1.2ml)的DMF(7.5ml)溶液中在室溫下攪拌18小時進行進一步還原。過濾反應混合物后，凝膠依次用3×10ml DMF、3×10ml乙醇和3×10ml蒸餾水洗滌。得到胺瓊脂糖凝膠TM，取代度為0.26mmol胺基/ml凝膠。
C.用磺酰氯衍生化通用方法5g胺偶合凝膠用3×10ml乙醇洗滌，再用3×10ml DCM(二氯甲烷)洗滌。將凝膠轉移到小瓶中，再加入DCM(2ml)和3.3當量的DIPEA，將所得混合物攪拌5分鐘。逐滴加入溶解于DCM(3ml)的3當量的甲磺酰氯后，將反應混合物于室溫攪拌18小時。過濾反應混合物后，凝膠依次用3×10ml DCM、3×10ml乙醇、3×10ml蒸餾水、3×10ml 0.5M HCl和3×10ml蒸餾水洗滌。
實施例2IgG的選擇性吸附為了測試本發明新的非芳族磺酰胺配體是否選擇性地吸附人免疫球蛋白(IgG)，在不同條件下對IgG和三種不同的模型蛋白的吸附性進行測試。這種測試方法的原理是，將蛋白質(15μl)注射到HR5/5柱(含有固定在SepharoseTMFast Flow(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)上的磺酰胺配體)中，該柱用緩沖液A(含有鹽和緩沖液組分)平衡。將15ml緩沖液A泵過柱子，然后應用從緩沖液A至緩沖液B(緩沖液B含有緩沖液組分但沒有鹽)的5ml線性梯度(參見以下UNICORNTM方法)。然后監測280nm、254nm和215nm處的層析圖。
為了評價從柱中吸附的樣品量和洗脫的樣品量，將加到柱子中的相同數量的樣品直接注射到監測器內，對反應進行積分。
實驗使用六種組合的吸附緩沖液(緩沖液A#)和解吸緩沖液(緩沖液B#)1.緩沖液A120mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)+0.50M Na2SO4緩沖液B120mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)2.緩沖液A220mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)+0.25M Na2SO4緩沖液B120mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)3.緩沖液A320mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.0)+0.50M Na2SO4緩沖液B220mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.0)4.緩沖液A420mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.0)+0.25M Na2SO4
緩沖液B220mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.0)5.緩沖液A220mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)+0.25M Na2SO4緩沖液B3100mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.0)6.緩沖液A520mM甘氨酸緩沖液(pH 10.0)+0.50M Na2SO4緩沖液B420mM甘氨酸緩沖液樣品所使用的樣品是牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)、運鐵蛋白(TRANSF)和人免疫球蛋白(IgG，Gammanorm)。將各蛋白質溶解于緩沖液A中，濃度為15mg/ml，每次只向柱中注入一種蛋白質。
儀器裝置液相層析法(LC)系統KTATMExplorer(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)10XT或相當的裝置。
軟件UNICORNTM注射量 SuperloopTM15μl柱 HR 5/5儀器參數流速0.5ml/min檢測器池10mm波長280nm、254nm和215nmUNICORNTM方法主要方法0.00 基準CV，1.00{ml}，任何
0.00柱位置 位置1旁通0.00自動調零UV0.00波長280{nm}254{nm}215{nm}1.00波長280{nm}254{nm}215{nm}1.10注射(1)#VIAL，10#INJVOL1{μl}，No，NoAir1.10自動調零UV4.00柱位置(位置2)KOLONN5.00注射(1)#VIAL2，10#INJVOL2{μl}，No，NoAir20.00 梯度100{％B}，2.00{基準}25.00 梯度100{％B}，0.00{基準}25.10 梯度0{％B}，1{基準}29.00 梯度0{％B}，0{基準}34.00 梯度0{％B}，0{基準}34.10 結束方法結果與討論1(a)磺酰胺配體pH 7.4時吸附和解吸條件為了確證非芳族磺酰胺配體是否選擇性地吸附免疫球蛋白，將人IgG上樣到1ml填充本發明新基質的柱(HR 5/5)中。此外，也上樣了牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)和運鐵蛋白(TRANSF)等蛋白質。將五種不同pH和不同鹽(Na2SO4)含量的不同緩沖液用作吸附緩沖液。表1和表2中，列出了得自pH 7.4(緩沖液A1和A2)的結果。如下表1所示，在將0.25M Na2SO4加入到流動相時，BSA、RIB A和TRANSF沒有被吸附到所研究的配體上。然而，IgG已定量地被吸附到基于多胺的四個配體中的三個配體上，并且所上樣IgG的90％已被吸附到了第四個配體上，即基于三亞乙基四胺的配體上。此外，僅有一種氨(單胺)，即基于半胱胺的配體吸附IgG。
表1用20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)+0.25M Na2SO4(緩沖液A2)作為吸附緩沖液，牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)、運鐵蛋白(TRANSF)或人免疫球蛋白(IgG)在不同磺酰胺配體上的吸附量。
a配體已通過和CH3SO2Cl的反應轉化成磺酰胺(參見磺酰胺介質的制備部分)。
b相對吸附量((吸附量/上樣量)×100)。吸附量的計算根據(上樣量-用吸附緩沖液洗脫的量)。
如下表2所示，如果使用較高離子強度的流動相(緩沖液A1；0.50M的Na2SO4)，那么運鐵蛋白就會被部分地吸附到一些配體上(表2)，而IgG被吸附到所有的配體上。最有選擇性的配體是基于二亞乙基三胺、聚乙烯亞胺和氨1的磺酰胺配體(表2)，因為BSA、RIB A和TRANSF沒有被吸附到這些配體上。
表2用20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)+0.50M Na2SO4(緩沖液A1)作為吸附緩沖液，牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)、運鐵蛋白(TRANSF)或人免疫球蛋白(IgG)在不同磺酰胺配體上的吸附量。
a配體已通過和CH3SO2Cl的反應轉化成磺酰胺(參見磺酰胺介質的制備部分)。
b相對吸附量((吸附量/上樣量)×100)。吸附量的計算根據(上樣量-用吸附緩沖液洗脫的量)。
上述結果表明，根據pH 7.4吸附緩沖液的離子強度，不同磺酰胺配體對于IgG吸附都是最適合的。
理想的免疫球蛋白的吸附劑不僅必須具有顯著的選擇性，而且要能夠進行有效洗脫。可以用20mM磷酸鹽(pH 7.4)，不加鹽，將大部分吸附到的IgG解吸。如果用緩沖液A1作為流動相吸附IgG，那么使用解吸緩沖液B1就可以回收70-100％吸附到的IgG。然而，當使用緩沖液A2吸附時，IgG很難洗脫，但通過使用緩沖液B3(100mM乙酸鹽緩沖液，pH 4.0)就能容易地被解吸。
1(b)磺酰胺配體pH 4.0時吸附和解吸條件如下表3和表4所示，在酸性條件下吸附IgG顯然不如在pH 7.4時那樣有選擇性。通過使用加入了0.25M Na2SO4的20mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.0)(緩沖液A4)作為吸附緩沖液，基于半胱胺、三亞乙基四胺和二亞乙基三胺的配體分別吸附IgG上樣量的40％、40％和60％(表3)。在相同條件下，核糖核酸酶A和運鐵蛋白沒有被吸附。然而，上樣的牛血清白蛋白的90％、10％和100％分別被吸附到基于半胱胺、三亞乙基四胺和二亞乙基三胺的配體上。
表3用20mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.0)+0.25M Na2SO4(緩沖液A4)作為吸附緩沖液，牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)、運鐵蛋白(TRANSF)或人免疫球蛋白(IgG)在不同磺酰胺配體上的吸附量。
a配體已通過和CH3SO2Cl的反應轉化成磺酰胺(參見磺酰胺介質的制備部分)。
b相對吸附量((吸附量/上樣量)×100)。吸附量的計算根據(上樣量-用吸附緩沖液洗脫的量)na未分析。
上述結果表明，基于三亞乙基四胺的配體對于IgG是最有選擇性的被測配體。樣品IgG含有不同免疫球蛋白的亞類(59％的IgGl、36％的IgG2、4,9％的IgG3和0.5％的IgG4)。如果吸附緩沖液的鹽含量增加，那么由于吸附其它蛋白質而使對IgG的選擇性降低。表4顯示了將緩沖液A3(20mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.0)+0.50M Na2SO4)用作吸附緩沖液的結果。很顯然，核糖核酸酶A和運鐵蛋白都被吸附到一些配體上。此外，與使用緩沖液A4的情況比較，使用緩沖液A3時，牛血清白蛋白被高水平吸附(表3和表4)。當使用緩沖液A3時，最有選擇性的配體似乎是基于五亞乙基六胺的配體，因為僅有BSA、RIB和TRANSF上樣量的10％、20％和10％被分別吸附。這可以與50％上樣量被吸附的IgG進行比較(表4)。
表4用20mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.0)+0.5M Na2SO4(緩沖液A3)作為吸附緩沖液，牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)、運鐵蛋白(TRANSF)或人免疫球蛋白(IgG)在不同磺酰胺配體上的吸附量。
a配體已通過和CH3SO2Cl的反應轉化成磺酰胺(參見磺酰胺介質的制備部分)。
b相對吸附量((吸附量/上樣量)×100)。吸附量的計算根據(上樣量-用吸附緩沖液洗脫的量)。
用緩沖液B2(20mM乙酸鹽緩沖液，pH 4.0)，就能容易地完成所有吸附樣品的定量解吸。
1(c)磺酰胺配體pH 10.0時吸附和解吸條件已經進行了幾個pH 10.0的實驗，根據表5，可以看到，通過使用吸附緩沖液A5(20mM甘氨酸緩沖液(pH 10.0)+0.5M Na2SO4)，IgG被定量吸附到基于半胱胺和三亞乙基四胺的配體上。然而，用解吸緩沖液B4(20mM甘氨酸緩沖液)只能洗脫出IgG吸附量的10％。為了得到IgG的定量解吸，就要將pH改為酸性條件，例如通過使用解吸緩沖液B3(100mM乙酸鹽緩沖液，pH 4.0)。
表5用20mM乙酸緩沖液(pH 4.0)+0.50M Na2SO4(緩沖液A3)、20mM磷酸緩沖液(pH 7.4)+0.50M Na2SO4(緩沖液A1)或20mM甘氨酸緩沖液(pH 10.0)+0.50M Na2SO4(緩沖液A5)作為吸附緩沖液，人免疫球蛋白(IgG)在兩個不同的磺酰胺配體上的吸附量。
a配體已通過和CH3SO2Cl的反應轉化成磺酰胺(參見磺酰胺介質的制備部分)。
b相對吸附量((吸附量/上樣量)×100)。吸附量的計算根據(上樣量-用吸附緩沖液洗脫的量)。
實施例3CH3SO2Cl和CH3COCl修飾的胺配體間的比較(甲磺酰胺和乙酰胺配體)為了證實本發明的磺酰胺結構和抗體的相互作用比乙酰胺配體的更強，因此制備基于兩種胺配體三亞乙基四胺和半胱胺的每一類型的兩種配體(按照上述實驗部分的實施例2)。在下表6中，顯示四種不同緩沖液系統(緩沖液B1-3和B5)的IgG吸附結果。表6清楚地顯示出，與乙酰胺配體比較，本發明的磺酰胺結構可以在所有試驗條件下更有效地吸附IgG。在使用緩沖液A1和A5作為吸附緩沖液時，基于半胱胺的乙酰胺配體是唯一能夠吸附IgG(上樣量的50％)的配體。然而，當20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中的鹽濃度從0.5MNa2SO4降低到0.25M Na2SO4時，這種配體就不能吸附IgG了。兩種甲磺酰胺配體在所有試驗條件都可以吸附IgG。這些結果清楚地表明，本發明的甲磺酰胺配體是比乙酰胺配體更好的IgG吸附劑。
表6使用四種不同吸附緩沖液時，人免疫球蛋白(IgG)在磺酰胺配體和乙酰胺配體上的吸附量。
a緩沖液A120mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)+0.50M Na2SO4b緩沖液A220mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)+0.25M Na2SO4c緩沖液A320mM乙酸鹽緩沖液(pH 40)+0.50M Na2SO4d緩沖液A520mM甘氨酸緩沖液(pH 10.0)+0.50M Na2SO4e配體已通過和CH3SO2Cl的反應轉化成磺酰胺(參見磺酰胺介質的制備部分)f配體已通過和CH3COCl的反應轉化成酰胺(參見制備部分)。
權利要求
1.一種分離基質，其包含固定有配體的多孔載體，所述配體任選通過間隔臂固定，其中所述配體包含一個或多個磺酰胺，其中磺酰基的R基團是脂族化合物。
2.權利要求1的基質，其中磺酰胺是通過其氮偶合到多孔載體上的。
3.權利要求1的基質，其中磺酰胺是通過其硫偶合到多孔載體上的。
4.前述權利要求中任一項的基質，其中R基團是甲基。
5.前述權利要求中任一項的基質，其中磺酰胺的氮是伯胺或仲胺。
6.前述權利要求中任一項的基質，其中所述配體是單胺。
7.權利要求1-5中任一項的基質，其中所述配體是多胺。
8.權利要求7的基質，其中每個多胺都包含2-6個胺。
9.前述權利要求中任一項的基質，其中所述配體以固定到載體上的聚合物的重復單元存在。
10.權利要求9的基質，其中所述聚合物是聚乙烯亞胺。
11.權利要求9或10的基質，其中所述聚合物有兩種或多種不同的配位基。
12.前述權利要求中任一項的基質，其中所述配體是脂族化合物。
13.前述權利要求中任一項的基質，其中所述載體是交聯多糖。
14.填充權利要求1-13中任一項所定義的分離基質的層析柱。
15.權利要求14的層析柱，該層析柱是基本上無菌的。
16.權利要求14或15的層析柱，該層析柱是一次性使用的。
17.一種制備用于抗體分離的基質的方法，該方法包括第一步，將胺和/或多胺固定到多孔載體上；第二步，使所述胺磺酰化，以提供脂族磺酰胺配體。
18.一種制備用于抗體分離的基質的方法，該方法包括第一步，活化多孔載體；第二步，把磺酰胺通過其硫結合到活化位點上，以提供脂族磺酰胺配體。
19.從液體中分離出抗體的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供包含至少一種抗體的液體(b)使所述液體與分離基質接觸以將一種或多種抗體吸附到所述基質上，所述分離基質包含一種或多種脂族磺酰胺配體，任選地，(c)讓洗脫液通過所述基質以釋放出一種或多種抗體；(d)從洗脫液的流分中回收至少一種抗體。
20.權利要求19的方法，其中步驟(a)中提供的液體也包含一種或多種其它蛋白質。
21.權利要求19或20的方法，其中步驟(b)的分離基質在層析柱中。
22.權利要求19-21中任一項的方法，其中步驟(b)的分離基質如權利要求1-13中任一項所定義。
23.權利要求21的方法，其中步驟(b)在接近中性pH時實施，例如pH 7.2-7.6，優選約為7.4。
24.權利要求19-23中任一項的方法，其中步驟(c)是梯度洗脫，通過向分離基質中加入遞減鹽濃度的洗脫液實施。
25.權利要求19-24中任一項的方法，其中步驟(b)在中性pH或高于中性pH時實施，步驟(c)是梯度洗脫，通過加入遞減pH的洗脫液實施。
26.權利要求19-25中任一項的方法，其中步驟(d)中回收的抗體是人抗體或人源化抗體。
27.權利要求19-26中任一項的方法，其中步驟(d)中回收的抗體是免疫球蛋白G(IgG)。
28.一種測定抗體數量的方法，該方法包括如權利要求19-27中任一項所定義的方法，另外還有步驟(e)，即用分光光度法測定抗體量。
全文摘要
本發明涉及一種分離基質，該分離基質包含固定有配體的多孔載體，其中所述配體包含至少一種脂族磺酰胺。磺酰胺的氮可以是仲胺或叔胺。本發明也涉及裝有所述分離基質的層析柱，以及通過將免疫球蛋白樣化合物吸附到包含了脂族磺酰胺配體的分離基質上進行分離的方法。
文檔編號B01J20/30GK1898265SQ200480038282
公開日2007年1月17日 申請日期2004年12月21日 優先權日2003年12月23日
發明者G·格拉德, B·-L·約翰松, J·-L·馬盧瓦塞爾, N·諾爾曼 申請人:通用電氣健康護理生物科學股份公司