專利名稱：用于測量血清高密度脂蛋白相關膽固醇的測定設備中保留多孔性和生物活性的粘合膜的制作方法
技術領域：
本發明涉及高密度脂蛋白(HDL)相關的膽固醇測定墊，涉及使用所述墊的方法以及進行所述方法的診斷測定設備。
背景技術：
已知在血液中存在的膽固醇的數量與冠狀動脈疾病的危險相關。膽固醇主要以蛋白交聯形式在血液中循環。運輸膽固醇的蛋白是根據其密度可細分為三類的脂蛋白。極低密度脂蛋白(VLDL)是可在肝中合成并且最終轉化成低密度脂蛋白(LDL)的富含甘油三酯的脂蛋白，其中所述低密度脂蛋白會在人體中運輸絕大多數的血清膽固醇。高密度脂蛋白(HDL)是包含在富含甘油三酸脂脂蛋白的分解代謝過程中，并且包含在從外周組織中去除膽固醇并運輸至肝臟的過程中的脂蛋白。血清HDL水平和冠脈疾病的危險之間存在反比關系。特別地，如果HDL相關的血清膽固醇比例低，那么冠脈疾病的危險就會增加。
從致動脈粥樣硬化疾病的風險評估和管理中的相對血清膽固醇的重要性來看，相當大的努力花費在篩選正常和高危個體的大數量人群中的HDL、LDL以及總膽固醇和甘油三酸脂的血清水平方面。通過對各種不同種類脂蛋白的膽固醇的血清水平進行常規測量可以監測出高危個體治療方面的有效性。
特定HDL膽固醇測量的一個方法是基于，典型地，在第二族陽離子，如Mg2+、Mn2+、或Ca2+的存在下，在血清中通過多陰離子化合物，如硫酸鹽葡聚糖、肝素、或磷鎢酸鹽對非HDL脂蛋白進行選擇沉淀。沉淀的特定性和程度取決于眾多因素，包括沉淀試劑的類型和濃度。通常，帶有增加的多陰離子濃度的血清膽固醇的沉淀順序是VLDL、LDL和HDL。盡管少量的HDL的脫脂脂蛋白E(apoE)可以和低密度顆粒共沉淀，但是HDL通常在完全使低密度顆粒沉淀的肝素或硫酸鹽葡聚糖濃度下保持可溶性。根據低密度顆粒的選擇沉淀，可以確定HDL血清膽固醇。
在典型的脂質測定過程中，提取和離心少量血液來產生澄清的血清或血清樣品液體。然后將樣品液體等分裝入幾個測定管中來進行(a)總血清膽固醇、(b)甘油三酸脂、和(c)HDL膽固醇的測量。如上沉淀HDL樣品，且在膽固醇檢測之前通過過濾和離心來去除低密度顆粒。然后使樣品與酶混合物反應，所述酶混合物含有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、過氧化物酶和可以在H2O2存在下被氧化成明顯有色產物的染料。可以根據分光光度讀取測量管，并確定所測的總HDL和LDL膽固醇的數值。
盡管描述了根據液相膽固醇的測定可以達到的準確性和可靠性，但是所述測定在普遍篩選的使用中仍有許多限制。第一，方法使用了靜脈血液樣品，需要專業技術人員來提取和分餾血液樣品，并將處理后的血液等分裝入單獨的測定管內。必須使用沉淀試劑對至少一個測定管(用于確定HDL)進行處理并且進一步加工來去除沉淀物質。盡管這些過程中的一些可以是自動的，但是設計用于此目的的分析設備是昂貴的且不會被在大型醫院以外廣泛使用。
共有美國專利Nos.5,213,964、5,213,965、5,316,196和5,451,370(每個專利均在此引作參考)公開了基本上克服了許多上述與用于測量血清膽固醇水平的液相測定過程相關的問題的方法和測定設備。在一個實施方案中，設備設計用來測量血液樣品中HDL相關的膽固醇濃度，其中血液樣品中還含有LDL和VLDL顆粒。設備包括一個過濾基質，當液體樣品通過基質移動時，其可分離可溶的和沉淀的脂蛋白。當液體樣品被引入并通過基質時，為了選擇性沉淀LDL和VLDL，設計一個與基質結合的儲器來釋放可溶性沉淀試劑。因為HDL通過篩選基質的移動較快，使HDL從沉淀脂蛋白中分離出來。然后去除了非HDL脂蛋白的液體樣品被轉移到測量表面測定膽固醇。
上述設備，雖然優于液相測定，而其也顯示出在帶有沉淀試劑的流動運輸路徑上發生污染的可能性。這樣的試劑會影響HDL的數量，或影響發生在多測定設備的其它區域中的其它測定化學過程。本發明將會指出并克服這些問題。
在EP 0408223和EP 0415298(Rittersdorf等人)中公開了測量血液樣品中HDL膽固醇的進一步方法和設備，其描述了包含下列步驟和相應成分且在試驗片上進行的連續測定方法。將血液樣品放入用于分離血液細胞組分的分離層。在毛細管力和重力的驅動下，使樣品流過含有可溶性沉淀試劑的深一層的載體，所述沉淀試劑在溶于血清樣品之后使包含在樣品中的非HDL脂蛋白沉淀。在深一層的載體中，從血清樣品中過濾出上述沉淀成分以防止其對最終HDL數量的影響。在相同的載體中，將樣品運輸到與HDL定量載體鄰接的位置上，并將其儲存直到HDL定量步驟開始為止。最后，將樣品轉移到HDL定量層上，在該層上可以通過酶反應對血清樣品中的HDL膽固醇進行定量。
這種測定設計的一個缺點在于作為儲器的載體會使沉淀組分或可溶性試劑移入樣品中，其會影響HDL的定量。此外，在血清樣品的保存過程中，HDL可被粘附到載體纖維上、沉淀試劑可以進一步導致不所需的反應、以及干燥的血清樣品使載體阻塞。
美國專利No.5,135,716(Thakore)公開了用于對血液液體樣品中HDL量化進行測量的其它設備和方法。在這些設備中，為了進行HDL量化，液體樣品通過連續地非間斷路徑從進口孔流入載體。因此，對控制樣品進入HDL測試載體的量和控制用于HDL測定的環境條件的能力是有限的。沒有設備能夠對一個液體樣品的各種分析同時進行測定。
因此，本發明的目的在于提供一種能夠克服上述已有技術缺點的HDL測定的設備。
發明內容
在一個方面，本發明包括通過將一個HDL測試墊和一個試劑墊連接而形成的測定墊，其中測定墊會保持足以使樣品通過試劑墊到達HDL測試墊的多孔性。測定墊進一步保持在試劑墊和HDL測試墊上的試劑的生物活性。
在另一方面，本發明包括對在血液液體樣品中高密度脂蛋白相關(HDL)的血清膽固醇進行測量的測定設備和使用所述設備的方法，所述血液液體樣品含有除HDL以外的其它脂蛋白。所述設備包括一個樣品分布列陣、一個可以測定HDL濃度的HDL測試墊；和一個含有可有效的從體樣品中選擇性結合并去除非HDL結合試劑的試劑墊。通過粘合層或通過加熱墊來使HDL測試墊和試劑墊連接。
在又一方面，本發明提供制備所述連接的HDL測試墊和試劑墊的方法。
圖1是多分析物測定設備的一個實施方案的側視圖。
圖2根據本發明的一個實施方案裝配的多分析物測定設備分解形式的透視圖。
圖3是根據本發明一個實施方案的多分析物測定設備的部分側視圖。
本發明的詳細內容I.定義除非特別說明，以下術語具有下列意思。
當液體能夠通過毛細作用和/或重力從一種元件傳遞到另一種元件中時，這種元件與其它元件是“液體連接”的。元件不需要直接接觸；即，其它元件在所述液體能夠流經的地方是可以介入的。
用于文中的“樣品分布墊”、“測試墊”、“HDL測試墊”、和“試劑墊”的“墊”表示薄、平墊或墊子，或一片吸水物質。墊可以由任何物質構成，例如多孔膜或纖維帶，其可以含有注入的或固定的試劑，通過它液體可以在毛細作用和/或重力下移動。
II.測定設備在圖1-3中說明根據所述發明的設備，將要進行如下討論。為了方便起見，將類似的元件編號保留在圖1-3中來識別相似的結構特征。特別地所述設備被設計成在使用少量，典型地在10-50μm之間的血液或血清樣品的情況下，測量與HDL相關的血清膽固醇(也稱作HDL相關膽固醇或簡單地為HDL膽固醇)。可以從同一樣品中同時進行其它測定，例如總膽固醇、甘油三酸脂、葡萄糖、丙氨酸轉氨酶水平(ALT)、天冬氨酸轉移酶(AST)、血液尿素氮(BUN)、或肌氨酸酐。HDL相關膽固醇的測定也可以簡單地稱為HDL或HDL測定。
參考圖1-3，說明了多分析物測定設備的各種實施方案，圖2顯示此設備的分解形式。如圖1清晰可見，多分析物測定設備14包括一個主體或支撐體15，其限定了一個特定尺寸和大小以接收一定量血液樣品的孔16，典型地血液樣品的量在25-50μl之間。所述孔可以任選地與過濾墊22在液體中接觸，該過濾墊可以位于所述支撐上邊緣形成的缺口區域20內。所述液體接觸可以是直接的，或在如圖1所示的設備中，通過在所述孔底部的盤中形成的毛細導管提供。優選地，所述支撐體是帶有所述孔、缺口區域和/或通過標準模制或機制方法形成的毛細管的塑料盤。
當樣品如圖所示按照從底到頂的方向流過墊基質時，包含在區域20中的過濾墊22用來部分去除大顆粒物質(包括血細胞)。當從基質中提取血液樣品時，優選地，墊22由玻璃纖維基質形成，此設計可通過表面濕潤來吸取水相液體，以及阻止血細胞的移動。一個墊的示例是玻璃纖維濾紙，例如Whatman提供的GF/D、PD008、或F145-02濾紙，具有大約0.16g/cm3的組裝密度和大約1mm的厚度。墊的尺寸被設定以限定吸收樣品液體的體積，優選地，在大約15-25μL之間。此外，過濾墊可以包含紅細胞捕獲試劑，例如植物凝血素、紅細胞表面膜蛋白的特異性抗體、凝血酶、或離子交換劑。在一個實施方案中，所述墊包含用于去除非HDL脂蛋白的試劑，如下進一步所述。
將樣品接觸到伸長帶或樣品分布列陣26。在孔16和陣列26之間過濾墊22可以與陣列26液體接觸中。在優選的實施方案中，由液體交流中的三個或三個以上的單獨膜形成陣列26。如圖2所示，在一個由三個液體交流的膜形成列陣26的示實施方案中，中心樣品-加入膜28將樣品液體分布在樣品收集膜30和32上。陣列26可以進一步包括沉積于樣品加入膜28和樣品收集膜30之間的一個或一個以上的試劑膜，圖中未顯示。試劑膜可含有一種或多種試劑。在一個實施方案中，如進一步所述，試劑膜可以含有可選擇性去除LDL和VLDL的一種或一種以上試劑。在另一個實施方案中，試劑膜可以用作吸取芯(wick)來吸取用于多種測試的樣品。陣列26還可以被泡沫墊27或其它支撐體支撐，如圖2所示。優選地，陣列26是由玻璃纖維的基質組成的多重膜。基質的組裝密度和厚度要足以吸收并分散加樣到樣品加入膜和樣品收集膜上的樣品液體的體積量，例如10-25μL。基質具有在大約0.16g/cm3和4.0g/cm3之間的優選組裝密度。一個示范性的帶形物質是Whatman提供的F-165-25A玻璃纖維濾紙，其具有大約0.2gm/cm3的組裝密度和大約0.12mm的厚度。
所述設備進一步包括四個或四個以上測試墊64、66、68和70，其均是可濕潤、能吸水的反應測試墊。用于特別測定的每個測試墊都含有分析物-依賴性試劑，其可有效的在所述墊中產生分析物-依賴性變化，如下進一步所述，此變化可被已知方法測得。在特別測定中可以使用測試墊的所有或任何完整的亞型。
理想地，測試墊是多孔聚合物膜，優選具有大約100-150μm的厚度和大約3mm的邊緣尺寸。優選地，每個墊的吸收量在大約0.5-1.0μL之間。在一個實施方案中，一些或所有的反應墊均是非對稱的膜；也就是，膜在穿過膜的厚度上具有多孔性梯度。
在一個實施方案中，測試墊64是HDL測試墊，其含有對在所述墊中有HDL存在的情況下產生變化的有效的試劑。在另一實施方案中，HDL測試墊64是聚合物膜，其含有測定HDL水平的試劑。一個示范性的帶形物質是由PallCorporation提供的BTS-83非對稱聚砜膜(EastHills，NY)。如需要，可以根據用于酶固定的已知方法，將如過氧化物酶的HDL測定試劑固定到測試墊膜上(見，例如美國專利No.4,999,287；美國專利No.5,419,902；Blum，L.J.等人，Anal.Lett.20(2)317-26(1987)；Kiang，S.W.等人，Clin.Chem.22(8)1378-82(1976)；Guilbault，G.G.，Ed.，Modern Monographs in Analytical Chemistry，Vol.2Analytical Uses of Immobilized Enzymes(1984)；Torchilin，V.P.，Progress in Clinical Biochemistry and Medicine，Vol.11ImmobilizedEnzymes in Medicine(1991))。
試劑墊74與HDL測試墊64接觸，且含有用于HDL膽固醇的沉淀的化學物質。在一個實施方案中，試劑墊是和HDL測試墊相同的物質，即，非對稱聚砜膜。在一個優選實施方案中，試劑墊74由具有大約1μm或1μm以下的多孔尺寸的多孔聚合物膜組成。在圖1所顯示的設備中，試劑墊74由單膜組成，但是本發明還將需要使用多重堆疊的膜，即，最多大約6個，其中至少一個或優選地，每個膜均含有用于結合非HDL脂蛋白的試劑。
優選地，試劑墊具有大約100-150μm的厚度，大約3×6mm的邊緣尺寸，以及大約0.5-1.0μL的吸收量。其含有至少一種對從液體樣品中選擇性去除LDL和VLDL顆粒有效的試劑。例如，所述試劑可以是抗體，或優選地，多陰離子LDL-和VLDL結合劑。在有或沒有第二族陽離子，例如Mg2+、Mn2+或Ca2+存在的情況下，本領域所公知的這樣的試劑包括磺化多糖、肝素、和磷鎢酸鹽。優選試劑是磺化多糖，例如硫酸鹽葡聚糖，其具有50,000到500,000道爾頓的典型分子量，任選地，與乙酸鎂或氯化鎂結合，任選地，進行緩沖來保持中性pH。所述試劑可以是對從液體樣品中結合以及去除非HDL脂蛋白有效的固定劑。試劑墊對捕獲試劑墊中的相關的非HDL脂蛋白以及防止其進入HDL測試墊64是有效的。在一個實施方案中，可以將如過氧化氫酶的試劑固定在試劑墊74中，所述試劑對分解任何從測試墊64向下散播的生成的過氧化氫均有效。
如實施例6所述單獨使用加熱、或如實施例1-3所述使用能被熔融的作為熱活化粘合劑的丙烯酸共聚物，將HDL測試墊64和試劑墊74粘合在一起。合并的HDL測試墊和試劑墊叫做測定墊。
設備14還包括作為伸長支撐體的反應棒60，其可以是透明的或具有窗戶，例如窗戶76(圖2)。透過窗戶可以通過支撐看到測試墊64、66、68和70。這些窗戶可以是透明物質或僅僅在支撐體中開口。通過音波焊接，或其它適合的粘合方法，將測試墊和測定墊通過透明或半透明粘合材料附著到反應棒上。
通過封固裝置將反應棒固定在支撐體15上，此封固裝置可有效地(a)將設備保持在樣品分布位置上，其中測試墊和測定墊與樣品分布陣列、過濾墊或孔隔開，以及(b)將設備轉移到測試位置，其中測試墊和測定墊與樣品分布列陣、過濾墊和孔在液體中連接。此封固裝置還可以在使所需量的樣品流入測定墊和/或測試墊之后，和/或在一段特定接觸時間之后，通過將設備從測試位置轉移到測試墊和/或測定墊不能與樣品孔(其可以與“樣品分布”位置相同)液體連接的位置來阻斷這樣的液體連接。可以通過監測測試墊頂表面上的反射作用來控制這樣的轉移，其會反應出濕潤的程度，如共有美國專利No.5,114,350所述，該專利的內容在此作為參考。或者，當已知墊材料對樣品攝入的吸收量和速率時，僅僅通過使用預定接觸時間就足以精確地控制樣品的數量。
封固裝置可以包括，例如，一對回彈組件，例如彈力塊71、72，其可將測定墊偏向朝向非轉移或樣品分布位置，在此位置上將所述墊和樣品分布陣列、過濾墊、毛細導管或樣品孔隔開。通過回彈組件的壓縮或釋放，如圖3所示，可以選擇性的建立和分離測定墊之間的液體連接。液體連接可以通過直接接觸或通過中介物實現。支撐塊可以被彈簧或活塞類活動壓縮。或者，將外部機械設備用于主體15和/或反應棒60并且將一個移向另一個。這樣的設備包括常規組分，例如夾子、活塞、步進馬達、蝸輪等。一個示范性系統是Cholestech LDX分析器，其是有利于和此處所述的測定設備一起使用的設備齊全的自動分析器。
在進一步的實施方案中，HDL測試墊包括生物傳感器，如PCT公開申請No.WO99/58966(Dobson等人)所述，其內容在此處作為參考。該文件公開了小規模的生物傳感器設備，包括導電表面、導電表面上的電介質材料層和大量延伸穿過電介質層的孔。每個孔含有與導電表面接觸的生物聚合物，并且可作為將化學反應轉化成電信號的微電極。在使用中，將含有待測分析物的液體灌入孔中以使其與生物聚合物進行接觸。在本發明的HDL測定設備中，當通過HDL測試墊64與樣品液體連接、即圖3所示的測試位置時，即可達到此目的。
典型地，微電極孔中的生物聚合物是酶，例如，用于HDL相關的膽固醇、膽固醇氧化酶的測量。由膽固醇氧化酶將膽固醇氧化成相應的酮、釋放過氧化氫，而后其可被膽固醇氧化酶轉化成水和氧氣。然后對氧氣或對過氧化氫進行電化學測量。可以使用的電化學方法包括電流測量法，如Clark氧電極，可以測量由氧氣的還原或過氧化氫的氧化產生的電流，或伏安法。對在微電極上用于各種分析物測量(見，例如，R.J.Forster，Chem.Soc.Rev.289-297(1994))，如多巴胺(Pihel等人，Anal.Chem.68(13)2084-9(1996))和富勒烯(Soucaze-Guillous等人，Anal.Chem.65(6)669-72(1993))以及過氧化氫(Horrocks等人，Anal.Chem.65(24)3605-14(1993)；Nowall等人，Electroanalysis9(2)102-9(1997)；Dequaire等人，J.Am.Chem.Soc.124(2)240-53(2002)的循環伏安法使用進行了描述。
III.使用粘合層制備測定墊如圖1所示，在一個實施方案中，如實施例1-3所述，通過在試劑墊74和HDL測試墊64之間形成粘合層80來制備測定墊。通過粘合層80的結合，試劑墊74和HDL測試墊64形成一個復合結構即測定墊。值得注意的是所述粘合層僅需要固定相對的墊，如通過外周密封，或延伸到相對墊的整個表面。
優選地，由丙烯酸共聚物形成粘合層。典型地，共聚物將會，但不必需地，具有低于所使用HDL測定試劑的變性溫度或低于會損害HDL測定試劑的溫度的熔點。一個示范性的共聚物是乙烯基丙烯酸共聚物(EAA)。EAA作為不同顆粒大小的分散體由Michelman提供(具有大約75℃熔點的Cincinati OH，P/H MP 4990R)。一個優選顆粒大小是30-500nm，且平均顆粒大小為大約90nm。其它聚合物，包括聚乙烯乙二醇、聚乙烯對苯二甲酸乙二醇酯、和聚乙烯醇，也可以用作粘合層。可以將這些共聚物進行交聯并進一步與第二種不同的聚合物進行共聚。在另一實施方案中，由力敏粘合劑或蠟乳劑形成粘合層。在又一實施方案中，由熱熔性粘合劑形成粘合層，如在美國專利No.6,596,112所述，其在此處引用作為參考。值得注意的是，在測定墊保留使樣品從試劑墊流入HDL測試墊的合適孔的前提下，可以使用任何物質作為粘附層。
典型地，通過將共聚物溶于合適的溶劑，通常為水溶液，來制備復合測定墊。將共聚物乳液或溶液層涂于試劑墊74。可以使用任何適合涂覆墊的方法，包括將墊浸入乳液或溶液中、噴涂墊或通過吸取芯將聚合物溶液用于墊上。可以只涂覆墊的一面或兩面。通過一段適合的時間將墊干燥，即50℃下大約20分鐘。然后將沉淀劑分散到非對稱膜的大孔面(暗面)上。
當試劑墊和HDL測試墊均形成非對稱膜時，以使試劑墊的小孔面(亮面)與HDL測試墊的開孔面(暗面)相接觸方向將試劑墊和HDL測試墊定向。
通過對涂覆的試劑墊74和HDL測試墊64加熱和/或加壓來形成HDL測試墊64和試劑墊74之間的共聚物粘合層。由此共聚物與相鄰墊材料形成結合。在所需溫度和壓力下，可以使用能提供熱量的任何適合的設備來對墊進行加熱。加熱墊的優選溫度為大約80℃。可以使用任何適合的壓層機。
試劑墊上共聚物的濃度必須足以使測定墊保留使樣品從試劑墊流到HDL測試墊的多孔性。共聚物提供粘合性的合適濃度為大約4.0％到大約10.0％乳液。聚合物涂層的優選濃度為4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％。一個優選乳液是5.5％EAA乳液。
在將測試墊粘合到試劑墊之前或之后，可以通過任何適合的方法將HDL試劑分散到HDL測試墊64上。優選地，在將測試墊粘合到試劑墊之后，將HDL試劑分散到測試墊上。
IV.使用加熱制備測定墊在一個實施方案中，如實施例6所述，在加熱到足以至少部分熔融試劑墊或HDL測試墊中的至少一個的溫度下，將含有試劑的試劑墊74與HDL測試墊64粘合來制備測定墊。如美國專利No.6,596,112所述將試劑墊和HDL墊加熱到大約65℃以上至大約220℃，該專利內容引入此處作為參考。在一個優選實施方案中，當將試劑墊和HDL測試墊加熱到大約165℃以上時，墊之間開始互相粘合。在另一優選實施方案中，將試劑墊和HDL測試墊加熱到大約93℃、121℃、148℃、165℃、200℃或205℃以上。按如上所述的方向將墊定向。在將測試墊粘合到試劑墊之前或之后，將HDL試劑分散到HDL測試墊上。在一個優選實施方案中，在將測試墊粘合到試劑墊之后，將HDL試劑分散到HDL測試墊上和/或將用于沉淀非HDL膽固醇的化學物質分散到試劑墊上。在一個特別優選的實施方案中，在測試墊與試劑墊粘合之后，分別將HDL試劑和用于沉淀的化學物質分散到HDL測試墊和試劑墊上。
V.使用打印工藝將試劑分散到測定墊上在另一實施方案中，使用結合雕刻凹版或網紋圓筒的印刷工藝，將一種或一種以上的試劑加入預-層疊膜的相對的面上。在此實施方案中，使用小于飽和體積的HDL試劑和沉淀劑。通過使用非飽和體積，可以將試劑限制到其各自膜上。大約80ml/1000平方英寸(80ml/0.645平方米)的體積是典型的飽和體積。試劑的體積在25到55ml/1000平方英寸(25到55ml/0.645平方米)的范圍內是合適的，然而，在一個實施方案中使用了20ml/1000平方英寸(20ml/0.645平方米)的試劑。可以在HDL試劑之前或之后加入沉淀劑。在這個印刷工藝的其它實施方案中，可以用與HDL試劑中所述的方法類似的方法將含有兩種必須保持分離的成分的其它試劑加入。或者，可以將單獨的試劑加入到單獨的非層疊膜上。
VI.測定方法在操作中，將血液樣品放置在孔16中，并且使其滲過過濾墊22來去除包括紅細胞的大顆粒并由此浸入樣品分布列陣26。在一個實施方案中，當設備處于“樣品分布”階段，如測定墊不與樣品分布陣列、過濾墊、毛細導管或樣品孔液體連接時，進行這些步驟樣品孔。
血清樣品從樣品加入膜28移動到樣品收集膜30和32。當血清樣品到達樣品收集膜時，將如圖3所示，優選地，通過移動反應棒60來將設備調節到測量位置以使測定墊與樣品分布列陣液體連接。在此位置，通過毛細流動將樣品分布列陣中的樣品液體引入試劑墊。再通過毛細流動將樣品液體進一步引入HDL測試墊。使反應棒持續在該位置上直到達到測試墊上所需的潤濕程度。如需要，在所需量樣品液體浸入測定墊，和/或一定接觸時間之后，移去棒以阻斷樣品分布列陣與測定墊之間的液體連接。
在血清與HDL測試墊64接觸之前，將樣品血清與含在單獨試劑墊74中的沉淀劑或結合劑進行接觸，以使非HDL脂蛋白結合到各自的載體上。因此設備可有效地從血清中去除非HDL脂蛋白，同時允許包括液相HDL的樣品液體流至帶有其它元件的HDL測試墊64(如圖2)。此實施方案的一個優點是樣品分布列陣和上游元件中不含有非HDL結合劑；這樣的試劑只存在于試劑墊74中。因此，這些試劑在除HDL以外的分析物的測定中的干擾可能性將會被消除。
在操作中，如圖1-3所述的實施方案中，當樣品通過包括墊74和64的HDL測定路徑時，其前沿以向上的方向通過墊74，在墊74中使非HDL脂蛋白反應以及被捕獲，并且直接通過鄰近的測試墊64，在墊64上HDL與其中的測定試劑反應，以測量HDL相關膽固醇的量。在這段時間中，樣品的其它部分連續與墊74接觸，并且以類似的方式從墊74流入墊64，直到墊64的吸收能力飽和為止。由此，在測試墊64中的HDL相關膽固醇的定量開始的同時，在試劑墊74中開始結合反應。優選地，從樣品分布基質中移入到HDL測定路徑(包括墊74和64)的樣品液體的體積等于或大于測試墊64的吸收能力，且小于或等于測試墊64和試劑墊74合并的吸收能力。
在這些實施方案中，當樣品液體與含有結合劑的試劑墊74接觸時，后者會與HDL測試墊64直接接觸，由此在HDL測定反應之前限制血液樣品與結合劑的短暫接觸。因此，樣品制備和HDL評估要分別進行，其中樣品制備包括，例如，過濾血液細胞成分和，任選地，血液樣品的臨時存儲以及使血液樣品與如溫度、壓力和大氣壓這樣的測試需要或條件相適應。因為減少了血液樣品與不同試劑的短暫接觸，所以阻止了任何對HDL評估的化學干擾。如需要，在樣品加入和去除細胞組分之后，而在與結合劑接觸之前，測定可被中斷一段的時間，例如，來調節周圍大氣壓或調節室溫來支持測試。通過將設備保持在樣品分布的位置中來完成上述步驟。在最后，如需要，樣品分布基質可被外設計成另具儲器的功能。
HDL測試墊含有用于定量HDL相關膽固醇的試劑。優選地，這些試劑包括用于從HDL中釋放純膽固醇的膽固醇酯酶、用于通過與純膽固醇反應產生H2O2的膽固醇氧化酶、過氧化物酶、和一個在過氧化物酶和H2O2存在的情況下轉化成具有明顯有色信號的反應產物的偶合染料系統。如上所述，測試墊還包括可對H2O2和/或O2進行有效的電化學定量的生物傳感器。
剩下的測試墊66、68和70還包括在墊上產生變化的測定試劑，其可通過已知的肉眼鑒別或指示劑的方法被光學檢測。在本發明設備和方法的優選實施方案中，在試劑墊74，而非樣品分布列陣或過濾墊上放置非HDL結合劑。在此實施方案中，可以消除在除HDL之外的分析物的測定中來自這些試劑的干擾的可能性。
優選地，每個測試墊均含有通過分析物與酶的反應產生H2O2的試劑組分；隨后H2O2可將底物試劑轉化成具有有色信號的反應產物，或如上所述，其被電化學測量。使用了多種底物特異的氧化酶的、用于酶產生H2O2的、以及隨后氧化染料以形成有色的反應產物的酶有色反應是已知的。
具有四個或四個以上測試墊的設備可以用于同時測量HDL膽固醇(HDL)、葡萄糖、總膽固醇(TC)、甘油三酯脂質(TRG)、ALT、AST、BUN、和/或肌氨酸酐。每個墊均含有上述普通的路徑成分(過氧化物酶和偶合染料系統)以使產生的H2O2產生具有明顯有色信號的反應產物。每個暴露于血清中而非暴露于沉淀劑或結合劑的總膽固醇測試墊和HDL測試墊包括除普通路徑成分以外的膽固醇酯酶、其用于從血清脂蛋白中以純膽固醇形式釋放酯化的膽固醇，所述血清脂蛋白包括HDL、LDL和VLDL顆粒；和膽固醇氧化酶，用來通過與樣品液體中的純膽固醇反應產生H2O2，如上所述。葡萄糖測試墊除了普通路徑成分以外包括葡萄糖氧化酶。甘油三酯墊除普通路徑成分以外還包括脂肪酶、L-甘油激酶、和用于從甘油三酯經過中間產物L-甘油-3-磷酸產生H2O2的L-甘油-3-磷酸氧化酶。加入到TRG中的血清樣品不暴露于沉淀劑或結合劑，因此其包含所有的血清甘油三酯，所以TRG信號代表總血清甘油三酯。
還可以使用參考的標準墊；見，例如，共有美國專利No.5,114,350所描述的系統，其在此處作為參考。
實施例下列實施例用于說明本發明而非限制本發明。
實施例1制備HDL測試墊將HDL試劑在77μl/in2的加入體積下加入到BTS-83聚砜膜并且在連續的滾動工藝中、在50℃下干燥20分鐘。制備含有下列HDL試劑的測試墊膽固醇氧化酶36.5單位/ml、膽固醇酯酶215單位/ml、過氧化物酶200單位/ml、4-氨基安替比林1.88mg/ml、和TOOS(3-[乙基(3-甲基苯基)氨基]-2-羥基丙烷磺酸12.05mg/ml。可以用這個方法制備例如100尺的長的墊并進行切割以適合測定設備。
實施例2制備帶有結合試劑的試劑墊在浸漬槽中，將含有EAA分散體的試劑的水溶液以5.5％的濃度加到BTS-83聚砜膜上，并且在連續滾動的工藝中、在50℃下干燥20分鐘。接下來，使用注射泵將含有1-5mg/ml的硫酸鹽葡聚糖(500,000MW)和35mM的Mg(OAc)2分散到相同的膜上以計量一個膜表面上的試劑。可以用這個方法制備例如100尺的長的墊并進行切割以適合測定設備。
實施例3制備測定墊分別根據實施例1和2制備HDL測試墊和試劑墊。對墊進行定向以使試劑墊的亮面(小孔尺寸)與HDL測試墊的暗面或開孔面進行接觸。將壓層機器通過二膜并在連續滾動的工藝中在80℃度下加熱20秒。
實施例4代表的測定過程使用基本上如實施例3所述的測定墊，在LDX分析器中進行典型的測定。手工切割粘合墊部分至反應膜大小并使其與反應棒接觸。或者，使用超聲波焊接，在連續滾動的工藝中將層疊的測定墊連于反應棒。將血清樣品加載到樣品孔中。在樣品分布之后，將反應棒與粘合墊接觸大約4秒鐘，這段時間足以將足夠的血清轉移到HDL測試墊上，在其后將棒轉回其原來的方向。顯影3分鐘并且用LDX分析器檢測反應。
實施例5試劑墊上丙烯酸共聚物的濃度改變試劑墊上的EAA濃度來確定膜的多孔性。基本上根據實施例2來制備試劑墊。將從20％濃度開始的EAA的一系列稀釋液加入到試劑墊。根據實施例3將試劑墊粘合到HDL測試墊上。用依文氏藍的稀釋水溶液測試試劑墊的暗面以確定通過試劑墊并進入HDL測試墊的有色溶液的滲透和/或擴散。可使溶液預先滲透和/或散播的EAA的最高濃度為大約10％EAA。
實施例6使用加熱法制備測定墊在連續滾動工藝中，將兩層沒有加入任何試劑的BTS 83層壓在一起。膜的方向如實施例3中所述。使用常規的凹版印刷涂刷器，將硫酸鹽葡聚糖(500,000MW)和Mg(Oac)2的水溶液涂覆到層壓品的開孔面上。選擇凹版印刷涂刷器將非飽和體積的試劑分散到層壓品的單層上。隨著干燥，以類似的方式將HDL試劑加于相對的膜。從實施例1和2所顯示的水平開始濃縮試劑來補償已使用了的減少的體積。
權利要求
1.一種測量除HDL以外還含有其他脂蛋白的血液液體樣品中高密度脂蛋白(HDL)相關的血清膽固醇的測定設備，所述設備包括樣品分布陣列；HDL測試墊，其中可以測定HDL濃度；和試劑墊，其含有從液體樣品中有效地選擇性結合以及去除非HDL的結合劑；其中所述HDL測試墊和所述試劑墊相聯接。
2.根據權利要求1所述的設備，其中所述HDL測試墊與所述試劑墊通過熱成型結合劑進行連接。
3.根據權利要求1所述的設備，其中所述HDL測試墊與所述試劑墊通過丙烯酸共聚物粘合劑進行連接。
4.根據權利要求3所述的設備，其中所述丙烯酸共聚物是乙烯基丙烯酸共聚物。
5.根據上述權利要求中的任何一項所述的設備，其中所述HDL測試墊或所述試劑墊中的至少一個是由聚砜層組成的。
6.根據上述權利要求中的任何一項所述的設備，進一步包括一個在樣品與所述樣品分布陣列接觸之前有效地從血液液體中去除細胞成分的過濾墊。
7.根據上述權利要求中的任何一項所述的設備，進一步包括用于容納所述過濾墊的盒式體，所述盒式體包括用于容納所述血液液體樣品的孔并與所述過濾墊液體連接。
8.根據上述權利要求中的任何一項所述的設備，進一步包括一個反應棒，其含有可有效地將所述反應棒吸附到所述盒式體的封固裝置。
9.根據上述權利要求中的任何一項所述的設備，其中所述試劑包括結合多陰離子試劑。
10.根據權利要求9所述的設備，其中所述結合多陰離子試劑包括磺化多糖。
11.根據上述權利要求中的任何一項所述的設備，其中所述HDL測試墊含有在HDL膽固醇存在的情況下產生可檢測到的變化的試劑。
12.根據權利要求11所述的設備，其中可以從光學上檢測到所述變化。
13.根據上述權利要求中的任何一項所述的設備，其中所述HDL測試墊包括生物傳感器。
14.根據權利要求13所述的設備，其中所述生物傳感器可有效地通過電化學方法測量氧氣或過氧化氫產物。
15.一種制備適用于測量血清膽固醇的設備的方法，其包括提供由具有小孔面和開孔面的非對稱聚砜膜構成的試劑墊和HDL測試墊；用HDL測試墊對試劑墊定向以使試劑墊的小孔面與HDL測試墊的開孔面接觸；加熱以使所述HDL測試墊與所述試劑墊粘合；和將(i)HDL測試試劑加入到所述HDL測試墊以及(ii)可有效地從液體樣品中選擇性結合和去除非HDL的試劑加入到所述試劑墊以形成所述設備。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述加熱為大于165℃的溫度。
17.一種制備適用于測量血清膽固醇的設備的方法，包括用丙烯酸共聚物涂覆試劑墊；將(i)HDL測試試劑加入到所述HDL測試墊以及(ii)可有效地從液體樣品中選擇性結合和去除非HDL的試劑加入到所述試劑墊；加熱以粘合所述HDL測試墊和所述試劑墊以形成所述設備。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述丙烯酸共聚物是乙烯基丙烯酸共聚物。
19.根據權利要求18所述的方法，其中乙烯基丙烯酸共聚物是大約4.0％到大約10.0％的乳液。
20.根據權利要求17-19的任一項所述的方法，在所述涂覆步驟之后進一步包括干燥所述試劑墊的步驟。
21.根據權利要求17-20的任一項所述的方法，其中每個所述HDL測試墊和試劑墊均具有小孔面和開孔面；其進一步包括使HDL測試墊與試劑墊定向的步驟以使試劑墊的小孔面面向HDL測試墊的開孔面。
22.根據權利要求17-21的任一項所述的方法，其中所述加熱步驟包括使用75℃和90℃之間的溫度。
23.一種測量除HDL以外還含有其它脂蛋白的血液液體樣品中高密度脂蛋白(HDL)相關血清膽固醇的方法，其包括使樣品與層壓品接觸，該層壓品包括(i)具有HDL膽固醇的可檢測指示劑的HDL測試墊，(ii)含有可有效地從液體樣品中選擇性結合和去除非HDL試劑的試劑墊；其中所述血液液體樣品通過所述層壓品中的毛細作用和/或重力通過通過所述層壓品以便進行HDL濃度的測量。
24.根據權利要求23所述的方法，其中當所需量的樣品被移走時，所述過濾墊和所述樣品分布墊之間的接觸被阻斷。
25.根據權利要求23或24所述的方法，其中所述試劑包括磺化多糖。
26.根據權利要求23-25的任一項所述的方法，其中所HDL測試墊或所述試劑墊中的至少一個包括多孔聚合物膜。
27.根據權利要求23-26的任一項所述的方法，其中所述試劑墊包括多堆疊層，其中至少一個含有可有效地結合非HDL試劑。
28.根據權利要求23-27的任一項所述的方法，其中所述HDL濃度的測量是通過光學檢測。
29.根據權利要求23-28的任一項所述的方法，其中所述HDL測試墊包括生物傳感器。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述生物傳感器可有效地通過電化學方法測量氧氣或過氧化氫的產物。
全文摘要
本發明涉及一種用于測量樣品中HDL相關膽固醇濃度的測試墊，一種使用所述墊的方法和一種進行所述方法的診斷測定設備。所述測定墊包括聚合物粘合劑或熱層壓結合劑。所述測定設計可以防止用于HDL定量反應或在相同樣品中進行其它測定時用于去除的試劑的干擾性。如需要，可以在不中斷測定的情況下進行非HDL脂蛋白的去除和HDL膽固醇的測定。
文檔編號B01D39/00GK1764841SQ200480008009
公開日2006年4月26日 申請日期2004年4月1日 優先權日2003年4月2日
發明者R·M·瓊斯 申請人:霍萊斯太克公司