通過模擬移動床層析純化多肽的方法

專利名稱：通過模擬移動床層析純化多肽的方法
技術領域：
本發明涉及使用模擬移動床層析(simulated moving bedchromatography)來純化多肽的方法以及適于純化多肽的模擬移動床層析系統和裝置。
背景技術：
和介紹用于蛋白質純化的層析分離通常以批處理方式(batch mode)來進行，即，使用單個填充柱并隨后進行平衡、裝載、洗滌、洗脫和再生/凈化。該方式導致過程比較長而總產量相當低。此外，由于批處理方式中蛋白質吸收的動力學限制，層析柱只能裝載至它們所謂的動態負載量(capacity)，其通常是它們平衡負載量的30至50％。如果該柱子在平衡中運行，這依次需要使用體積是通常所需的2到3倍的柱子。由于蛋白質層析樹脂非常昂貴，這具有增加產品純化成本的主要經濟后果。此外，批處理柱層析中的洗滌和洗脫過程需要相當大的流體體積，其也是由于批處理方式操作中，由于使用的純化水必須是特殊處理的而具有的經濟后果。
模擬移動床(SMB)層析已經用于石化和礦業中。還發現SMB層析應用于醫藥工業中來分離對映體。
SMB層析的其他應用包括，例如，從果糖-葡萄糖溶液中分離果糖和從甜菜或甘蔗糖漿中分離蔗糖。通過離子交換樹脂有差異地吸收溶液成分以致在模擬移動床中顯現分離波形。
發明概述本發明涉及使用模擬移動床(“SMB”)層析通過與至少一種非本質(immaterial)成分分離來純化免疫反應性蛋白質的方法、這些方法中可用的SMB系統和裝置、通過SMB層析分離的免疫反應性蛋白質和使用分離的免疫反應性蛋白質治療患者的方法。
一方面，本發明涉及使用模擬移動床層析將在流體混合物中的免疫反應性化合物與至少一種非本質成分分離的方法。根據這個方面，該方法包括步驟(a)提供模擬移動床裝置，其包括流體中進行交流(conducting communication)的多個組件，所述組件包括至少一種固相；(b)將流體混合物連續引入所述模擬移動床裝置中，其中流體混合物以逆流方式和所述固相接觸；(c)實現免疫反應性化合物與至少一種非本質成分的分離；和(d)收集免疫反應性成分來提供其純化的成分。根據這方面的一個實施方案，免疫反應性化合物和固相的結合程度比至少一種非本質成分高或低。優選，免疫反應性化合物和固相的結合程度比至少一種非本質成分高。根據另一實施方案，該方法進一步包括通過將促進免疫反應性成分分離的洗脫劑和固相接觸來實現所述分離的步驟。合適的洗脫劑包括酸性緩沖劑。合適的固相包括結合蛋白質A或蛋白質G的支持物質。可以使用層析方法如吸附層析、分配層析、離子交換層析、大小排阻層析或親和層析來實現分離。優選，使用親和層析實現分離。本發明還涉及根據這些方法制得的免疫反應性化合物。
另一方面，本發明涉及當免疫反應性化合物和至少一種非本質成分兩者都存在于流體混合物中時，將免疫反應性化合物與至少一種非本質成分分離的模擬移動床(“SMB”)系統。根據這方面，SMB系統包括多個區域，區域含有逆流地和所述流體混合物接觸的固相，其中所述區域包括(i)結合區域，其中免疫反應性化合物和至少一種非本質成分與固相差異結合；(ii)洗滌區域，其中至少一種非本質成分優先與固相分離；和(iii)洗脫區域，其中免疫反應性化合物優先與固相分離。根據一個實施方案，洗滌區域是在結合區域和洗脫區域的中間。固相可以優先和免疫反應性化合物結合。根據該實施方案的一個方面，固相包含用于親和層析的配體。合適的固相可以包含蛋白質A或蛋白質G。另一合適固相包含陽離子交換樹脂。根據該實施方案的一個方面，模擬移動床系統進一步包括洗脫區域和結合區域中間的洗脫洗滌區域。以及，該實施方案可以進一步包括洗脫洗滌區域和結合區域中間的再生區域，以及在再生區域和結合區域中間的平衡區域。本發明還涉及包括使用模擬移動床系統將免疫反應性化合物與至少一種非本質成分分離的方法，以及使用該模擬移動床系統制得的純化的免疫反應性化合物。
根據另一方面，本發明涉及使用模擬移動床層析從抗體和至少一種非本質成分兩者都存在的流體混合物中將抗體與至少一種非本質成分分離的方法，其包括步驟(a)提供模擬移動床裝置，包括流體中進行交流的多個組件，所述組件包括至少一種固相，其包含優先和抗體結合的親和層析配體；(b)將流體混合物連續引入所述模擬移動床裝置中，其中流體混合物以逆流方式和固相接觸；(c)實現抗體與至少一種非本質成分的分離；和(d)收集抗體來提供其純化的成分。
再一方面，本發明涉及模擬移動床(“SMB”)系統，用于抗體和至少一種非本質成分兩者都存在的流體混合物中將抗體與至少一種非本質成分分離。根據這個方面，SMB系統包括含有固相的多個區域，固相含有親和樹脂，其和流體混合物是逆流地接觸，其中所述區域包括(i)結合區域，其中抗體和至少一種非本質成分與固相有差異地結合；(ii)第一洗滌區域，其中至少一種非本質成分優先與固相分離；和(iii)洗脫區域，其中抗體優先與固相分離。
另一方面，本發明涉及使用模擬移動床層析將流體混合物中的免疫反應性化合物與至少一種非本質成分分離的方法，包括步驟(a)提供模擬移動床裝置，其包括至少一個與所述裝置進行交流的流體中的組件，所述組件包括至少一種固相，且其中所述裝置包括多個由組件穿過的區域；(b)將流體混合物連續引入結合區域的組件中，其中流體混合物以逆流方式和固相接觸，且其中免疫反應性化合物和固相結合；(c)將洗滌緩沖液連續引入洗滌區域中含有結合的免疫反應性化合物的組件中，其中洗滌緩沖液以逆流方式和固相接觸，并基本從所述組件移除至少一種非本質成分；(d)將洗脫緩沖液連續引入洗脫區域中含有結合的免疫反應性化合物的組件中，其中洗脫緩沖液以逆流方式和固相接觸，并借此將免疫反應性化合物與固相基本分離；和(e)從組件連續地移除含有免疫反應性化合物的產物流。根據一個實施方案，模擬移動床裝置包括多個組件。優選，固相包括親和配體。合適的親和配體包括蛋白質A或蛋白質G。根據一方面，免疫反應性化合物包括抗體或抗體片段。本發明還涉及通過這些方法大量制得的純化的抗體或抗體片段。
根據另一方面，本發明提供了從至少一種非本質成分純化免疫反應性化合物的改良方法，改進包括使用了含有蛋白質A或蛋白質G固相的模擬移動床親和層析。
使用本發明SMB方法分離的合適免疫反應性化合物包括抗體和抗體片段。這樣的免疫反應性化合物包括結合選自CD20、CD40、CD40L、CD23、CD4、CD80和CD86抗原的那些。
定義根據本發明以及如在此所用的，將以下術語定義成具有以下的意思，除非另外明確地規定術語“免疫反應性化合物”指的是包括來自免疫球蛋白的抗原結合區域和/或恒定區的化合物。一方面，包括結合抗原的化合物。免疫反應性化合物另外可以包括來自非抗體化合物的肽序列，如細胞因子、細胞因子配體和其他抗原。這樣的免疫反應性化合物包括抗體、抗體片段、結構域缺失的抗體，或連接另一特定結合成分的抗體或其混合物。結構域缺失的抗體包括如那些WO02/060995中描述的化合物，其所公開的在此引入作為參考。其他免疫反應性化合物包括融合蛋白，其包括免疫球蛋白鏈和氨基酸序列如配體結合配偶體的氨基酸序列或粘著物氨基酸序列變體融合的區域。這樣的融合蛋白包括美國專利No.5,428,130和5,565,335中所描述的那些，其所公開的在此引入作為參考。
在此術語“抗體”以最寬的理解來使用并特別涵蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、人源化抗體、靈長類源化抗體、結構域缺失抗體，和抗體片段，只要它們顯示了所需的生物活性。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優選包括抗原結合區域或其可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab′、F(ab′)Z，和Fv片段；雙體；線性抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。結構域缺失抗體也可以考慮為抗體片段用于本發明的目的，該抗體含有其中一個或多個恒定區的至少一部分已經改變或刪除來提供改良生理特性(例如縮短了血清半衰期)的免疫球蛋白。優選實施方案中，結構域缺失的抗體包括缺失CH2結構域的恒定區。
“層析”指的是任何用于混合物和成分化學分離的分析技術，其依賴于混合物中成分對于固相的選擇性吸附。實例包括吸附層析、分配層析、離子交換層析、大小排阻層析，和親和層析。
在此所用的“吸附劑”通常指的是層析中所用的固相，對其移動相成分顯示了選擇性的親和性。因為這樣的親和性可以采取吸附以外的各種方式(包括大小排阻或絡合)，所以該術語指的是吸附混合物中成分的固相和非技術上從移動相吸附成分的固相，但是通過減緩了層析系統中一種成分相對于另一種成分的遷動速度其仍然起吸附劑的作用。
當涉及成分或級分時“純化的”表明其相對濃度(成分或級分的重量除以混合物中所有成分或級分的重量)至少增加20％。一系列實施方案中，相對濃度至少增加40％、50％、60％、75％、100％、150％或200％。當從其得到純化的成分的相對濃度(從其得到純化的成分或級分的重量除以混合物中所有成分或級分的重量)減少至少20％、40％、50％、60％、75％、85％、95％、98％或100％時也可以認為該成分或級分得到了純化。仍然另一系列的實施方案中，成分或級分純化至相對濃度至少為50％、65％、75％、85％、90％、97％、98％或99％。當一個實施方案中成分或級分是與其它成分或級分“分離”時，將理解為另一個實施方案中成分或級分是以在此所提供的水平得到了“純化”。
“組件”指的是模擬移動床裝置的一部分。一個組件可以包括一個或多個柱子或管子(vessel)。
“環”用來描述SMB系統的組件怎樣在SMB系統中互相之間以循環的方式來配置，因為每個組件的出口包括下一個組件的進口。因此術語“環”不應限制地理解為組件和組件中柱子的環狀結構。
“多成分混合物”指的是包括可以使用前述層析方法分離的三種或多種成分或級分的流體混合物，因為每種成分或級分對所用的吸附劑顯示了不同的親和性。
“非本質成分”指的是存在于含有免疫反應性化合物的流體混合物中的成分，其不是免疫反應性化合物，并將其和免疫反應性成分分離。非本質成分可以包括宿主細胞蛋白(HCP)、抗生素和其它存在于流體混合物中的成分。
“傳質效應(mass transfer effects)”通常指的是導致混合物的成分顯示與在所給系統中混合物不同的擴散行為并脫離理想系統的那些物理現象。傳質效應因此包括使用軸向擴散系數、粒子內部擴散系數、和膜傳質系數模建的效應。因此傳質效應還包括由于附加柱的死體積向前(fronting)和擴散。如果在所述的平衡3-6的任何區域中傳質校正項(以下將更詳細討論)多于移動相速度(理想系統的移動相速率)的2％，來獲得前述的純度和產量的分離就受到不可忽略的傳質效應的阻礙。本發明的設計還延及其中傳質校正速度增大或減小了對于理想系統的移動相速度多于1、3、5、7.5、10、15、20、30、50、75、100％、200％、400％、600％、1000％，或更高的系統。
如在此所用的，“與其它成分基本分離”意思是分離的成分含有的每種其它成分不超過約20％重量，優選每種其它成分不超過約5％重量，以及更優選每種其它成分不超過約1％重量。
如在此所用的，“不含有基本量成分的液流(stream)”意思是液流至多含有約20％重量的成分，優選至多約5％重量的成分，以及更優選至多含有約1％重量的成分。
附圖簡述

圖1描述了分離和純化免疫反應性化合物如細胞培養中產生的抗體的常規方法流程圖。
圖2描述了免疫反應性化合物如來自細胞培養的抗體分離和純化另一常規方法的流程圖。
圖3描述了本發明的四(4)區域模擬移動床層析(SMB)系統圖。
圖4描述了根據圖3的SMB系統的實施方案圖。
圖5描述了本發明另一四(4)區域SMB系統圖。
圖6描述了根據圖5的SMB系統的實施方案圖。
圖7描述了本發明八(8)區域SMB系統圖。
圖8描述了本發明具有二十(20)個柱子的八(8)區域模擬移動床(SMB)系統圖。圖8表示了圓盤傳送帶(carousel)裝置的二維圖，其中柱子以圓周排列。
圖9描述了本發明具有二十(20)個柱子的八(8)相模擬移動床層析系統的另一實施方案圖。
圖10描述了本發明具有二十(20)個柱子的八(8)相模擬移動床層析系統的另一實施方案圖。
圖11描述了如實施例3中所述的圖9中描述的SMB裝置的一個循環轉換中二十個(20)柱子洗滌1的UV結果。
圖12描述了圖9中所描繪的SMB系統的九個(9)完整旋轉的抗體濃度(IgG滴度)、IgG流量和宿主細胞蛋白質濃度(HCP)的曲線。在該圖中頂端菱形(◆)曲線表示IgG流量；較低的菱形(◆)曲線表示IgG滴度；以及方塊(■)曲線表示HCP。
發明詳述根據一方面，本發明涉及模擬移動床(“SMB”)系統和適用于免疫反應性化合物如細胞培養中制得的抗體分開和分離過程中的模擬移動床層析方法。本發明的SMB系統和方法可以用于如圖1中步驟D或步驟F或圖2中的步驟B或D所指示的過程。
這些過程通常包括一個或多個層析步驟。由于蛋白質層析樹脂非常昂貴，批處理方式中使用的層析柱只能裝載至它們所謂的動態負載量(其通常是它們平衡負載量的30至50％)，如果柱子在平衡中運行，需要使用體積是通常所需的2到3倍的柱子(即，裝載至它們的平衡負載量)。因此，使用批處理方式的層析步驟具有主要的經濟后果。此外，批處理柱層析的洗滌和洗脫過程需要大量的流體體積，其也是由于批處理操作模式。以連續、逆流模式使用其中柱子裝載至平衡容量的連續層析將需要較小的柱容積。此外更有效地洗滌和洗脫過程可以導致大量減少緩沖劑的消耗。實現這的途徑之一是使用模擬移動床層析。
典型的模擬移動床系統具有充填固相的至少一個組件或多個組件。組件可以包括一個或多個柱子或管子。流體導管相互連接系統的上流和下流端來形成回路，通過其流體混合物連續循環。在特定點可以引入液體流和在另外的點可以移出流出液流。通過回路的流體恒定流動稱為“內部再循環流動(internal recirculation flow)”。選擇性提供管道和閥門的歧管(manifold)系統來放置進料的進口、洗脫緩沖液的進口(將成分與固相分離)、分離成分的出口和未結合(或較少結合)成分的出口。每個進口和出口和分離的組件(或管子或柱子)連通。進料在指定點進入系統并通過連續內部再循環流動通過固相。該移動接觸導致成分的層析分離。以相對快速率流動的未結合成分從未結合成分出口移除，如通過移除第一洗滌流出液流。將使結合化合物與固相分離的緩沖劑(洗脫緩沖液)在結合和未結合成分各自出口閥門位置之間的進口閥門加入。
以預定的時間間隔(轉換時間)將指定進口和出口閥門位置向下流移動歧管上的一個位置至下一個固相床組件，其可以是管道離散的部分，(如柱子)，或獨立的管子，如柱子。選擇該步驟的時間以致閥門的指定和內部再循環流動完全同步。在這些條件下，系統實際上達到了穩定狀態，在每個閥門位置預定的間隔依次顯示了特定產物特征。該類型的系統模擬單個位置固定的閥門而固相以恒定和連續的速率圍繞每個閥門產生恒定質量產物的再循環回路移動。另一裝置實際上間歇地移動柱子-經常固定在圓盤傳送帶上-而閥門位置是固定的。
如果增加組件(或管道或柱子)和閥門位置的數量，模擬模型將更接近達到實際移動床系統的特征。批處理和模擬移動床系統之間的重要區別是在模擬移動床方法中內部再循環流動是連續的。除了控制內部壓力的非常小的調節，進入和流出速率是連續的和恒定的，因此盡可能精密地近似實際的移動床系統。
平衡的SMB系統顯示了沿著再循環回路路徑的穩定狀態成分分離波形。該波形伴隨著閥門同步轉換沿著再循環回路移動來保持所期望的穩定狀態。在這樣的SMB系統中，可以將區域看成是固定的，組件穿過區域移動。
模擬移動床方法實現了固相和液相的逆流移動以及伴隨的連續移動床超越無固體物理移動批處理層析的優勢。SMB方法利用了含有至少一種固相的系列組件連接形成循環。在一些系統中，每個組件包含至少一個或兩個或比較均勻大小的柱子，且這些柱子連接形成連續的循環。通過以移動(液)相流動方向周期性地將一個組件(如果組件包括多個柱子，一個柱子)的進口和出口端口向前移動來模擬固相移動，以致產物端口總是接近系統中產物的部分分離濃度波。與連續移動床系統相似，將端口轉換時間、區域長度、和區域流動速率全部平衡，達到目的水平的產物流純度。因此，可以將區域看成是固定的，組件通過一個區域至另一個移動。
1.免疫反應性蛋白質分離的一般方法本發明的SMB方法可以用作將免疫反應性化合物如細胞培養制得的抗體與非本質成分分離的方法的一部分。
圖1繪制了將免疫反應性化合物如細胞培養制得的抗體與至少一種非本質成分分離和分開的一般方法示意圖。本發明的方法可以用作該一般方法中的分離步驟或作為其他本領域所用一般方法中的分離步驟來分離和純化免疫反應性化合物如通過重組和細胞培養方法生產的抗體。
根據圖1所示的方法，處理步驟A中的細胞培養物懸液來收集細胞。步驟B中，澄清細胞懸液(除去細胞、細胞碎片和沉淀)。適于步驟B的方法之一是深部過濾；其他合適的方法包括離心和切向流過濾。步驟C中濾液用Triton X-100溫育，適合在容器如儲罐中。認為用TritonX-100處理可以滅活可能存在的病毒。步驟D中，濾液含有至少一種非本質成分，如宿主細胞蛋白(“HCP”)，為了除去宿主細胞蛋白(“HCP”)和其他非本質成分將免疫反應性化合物進行根據本發明方法的模擬移動床層析。優選使用親和層析。根據優選方面，使用含有蛋白質A或蛋白質B的固相。可以使用帶有任何常用固相主鏈(包括，例如，瓊脂糖、受控制的純玻璃、合成有機聚合物，等等)的天然或重組蛋白質A或蛋白質G的任何蛋白質A或蛋白質G親和吸附劑。根據一方面，固相含有重組蛋白質A。合適的固相包括那些Prosept rA(Millipore，Bedford，MA)和MabSelect(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。可以使用本領域技術人員公知的其他固相用于將免疫反應性化合物如抗體與HCP和其他非本質化合物分離。步驟E中，將產物流進行低pH溫育步驟。儲罐可以方便地用于該步驟。相信根據該步驟的低pH溫育可以滅活溶液中可能存在的病毒。步驟F包括陽離子交換層析，優選使用結合和洗脫模式的陽離子交換固相。合適的陽離子交換固相包括使用復合材料如Hyper D(Biosepra)的SP Sepharose XL樹脂和觸手(tentacle)樹脂(Merck或Tosohaas)的強陽離子交換吸附劑，和使用羧甲基(CM)配體的弱陽離子交換吸附劑。本發明的SMB方法可以用于該分離步驟中(以及步驟D)。相信步驟F可以去除瀝濾了的蛋白質A(其中步驟D使用了含有蛋白質A的固相的親和層析)并且還可以去除可能存在的病毒和其他污染物。步驟G包括陰離子交換層析，優選使用流動通過模式的強陰離子交換固相。合適的固相包括Fractogel TMAC。相信由于陰離子交換劑吸附，步驟G可以去除殘余的污染物(包括DNA)和可能存在的病毒。步驟H包括納濾(nanofiltration)步驟。合適的方法包括死端(dead end)過濾，相信步驟H通過大小排阻可以去除可能存在的病毒。步驟I包括超濾或透濾步驟。步驟I用來將溶液中的抗體濃度調節成適于保存的濃度，和如果顯示了，進行緩沖劑交換使其成為適于保存的緩沖劑。
大規模生產抗體的另一方法顯示于圖2中。該方法的步驟包括(a)補料分批發酵CHO細胞培養物產生15.000升培養液，含有0.5-2g/L抗體；(b)離心來去除生物質；(c)蛋白質A層析(該步驟的主要目的是去除(大多數的)宿主細胞蛋白質(HCP))；(d)陽離子交換層析(該步驟的主要目的是去除從親和凝膠中漏出的任何蛋白質A配體，由于蛋白質A配體和抗體都結合至凝膠，并在選擇性洗脫過程中發生分級)；以及(e)陰離子交換層析(主要目的是去除(吸附的)DNA，未吸附的MAb，由于其本質上是相當堿性的)。
2.SMB系統的描述本發明涉及使用SMB系統作為免疫反應性化合物如細胞培養物產生的抗體或抗體片段分離和純化方法一部分的方法。
本發明的一方面，SMB系統可以用來使用蛋白質A親和樹脂將免疫反應性化合物與宿主細胞蛋白和其他非本質成分分離。為了適應蛋白質A親和方法中可靠的免疫反應性化合物分離所需的所有步驟，使用了實驗裝置，其包括區域，區域用于將免疫反應性化合物與固相結合、去除未結合成分、從固相分離/洗脫免疫反應性化合物和固相再生/再平衡。
根據本發明的這個方面，免疫反應性化合物在中性pH和蛋白質A組件結合，在一個或兩個洗滌步驟中去除未結合成分，在低pH分離/洗脫免疫反應性化合物，且通過一個、兩個或三個連續的步驟再生和再平衡組件。所有這些步驟通過含有至少一個組件的SMB系統連續進行，組件通過具有多個區域的環移動。
根據本發明的一個方面，所述環由多個區域組成，合適的是四至八個區域，取決于所用的洗滌和再生/平衡步驟的數量。根據本發明的方法，獲得了純化的免疫反應性化合物的連續流，使用的固相和所用緩沖劑的量與批處理方式相比大量減少。本發明的一方面涉及如此所述的多區域SMB系統用于使用蛋白質A親和吸附劑的抗體純化。
蛋白質A親和SMB層析是減少蛋白質A親和層析中巨大成本的強有力途徑。組件(或柱子)體積的減少立刻導致減少的商品成本，此外，較小的組件更容易充填并在操作過程中通常導致較少的問題。完全自動連續的系統需要更少的操作者操縱，因此減少了失敗的風險。
根據本發明的另一個方面，在此描述的SMB系統還可以適用抗體純化過程中的陽離子交換層析步驟，其通常發生在蛋白質A親和層析步驟之后。該步驟使用SMB系統的經濟效益和蛋白質A親和層析步驟是相似的。
A.一般的四(4)區域SMB系統(i)圖3圖3繪制了本發明的四區域SMB系統。
根據一實施方案，將進料加至兩個(2)并聯的柱子，并使得二次穿過兩個(2)并聯的柱子。因此傳質(mass transfer)遍布至四個柱子。圓盤傳送帶或其它相似裝置可以用來相對于固定閥門以及進口和出口流地移動柱子。柱子從吸附區域移動至左邊進入吸附洗滌(或第一次洗滌)區域。在此所用的緩沖劑洗滌未結合物質并除去內毒素。將吸附洗滌的(或第一洗滌)區域的流出液進料回吸附區域來最小化產品的損耗。吸附洗滌(或第一洗滌)區域由兩個(2)柱子串聯組成，因此減少了所需緩沖劑量約40％。在由兩個(2)柱子串聯組成的洗脫區域洗脫產物，再次利用所得到的逆流效應。接著洗脫區域是洗脫洗滌區域。在該區域所用的緩沖劑可以是稀釋的平衡緩沖劑，其緩沖劑容量比洗脫區域的緩沖劑容量要低得多。將洗脫洗滌緩沖劑循環進洗脫區域以減少水成本。
圖4繪制了圖3SMB系統另一實施方案的方法流程圖，用于抗體分離的四區域SMB系統。根據該實施方案，吸附區域的柱子(位置7和位置8)是并聯連接的來減少壓力下降。吸附區域吸附劑(固相)的量是dimensioned以致傳質不受限制。根據該實施方案的一方面，柱子排列在圓盤傳送帶上。圓盤傳送帶的旋轉時間設定成滿足進料流所需的容量。
圖4所示的系統中，將從吸附區域進入洗滌(或第一洗滌)區域的隙間液體洗出并將其回料入吸附區域。大多數內毒素和宿主細胞蛋白在此除去并在從吸附區域流出的廢物流中結束。洗滌(或第一洗滌)區域后，抗體在洗脫區域得到洗脫；位置3和4的柱子包括洗脫區域。位置1和2的柱子包括洗脫洗滌區域并用來洗出隙間洗脫劑并將其回料入洗脫區域因此節約洗脫劑。為了在洗脫區域獲得所需的pH，將洗脫緩沖劑運用至該實施方案中的洗脫區域，然而，需要濃縮。
(ii)圖5圖5繪制了四(4)區域SMB系統的另一個實施方案。該系統不同于圖3中所示的那個。
根據一實施方案，吸收區域具有2乘以3個并聯柱子，因此略微增加了凝膠的使用。吸附區域、吸附洗滌(或第一洗滌)區域，和洗脫區域基本上和圖3的系統相同；然而，沒有洗脫洗滌區域。這可能導致產物回收降低因為小量洗脫劑將進入吸附區域的最后一個柱子。將來自產物罐的小液流泵入鹽/pH梯度區域。該區域建立了pH和鹽濃度的梯度過渡。保持流速低于隙間液體轉移的速度(回至洗脫區域)來保證最小化產品損耗。用洗脫劑和產物預飽和柱子也將提高洗脫區域的效率。
圖5 SMB系統的另一實施方案繪制于圖6中。原理與上述圖3和4的系統相似，省略了洗脫洗滌區域。然而，該實施方案包括了另一個區域，夾帶物濾去(entrainment rejection)區域。這考慮到較高的流出液濃度。此外，該區域將在系統中產生pH分布(位置3和4的柱子中)。這可以給予經過蛋白質的等電點的相對平穩地過渡，因此最小化產品的分解。
用于圖6中所示實施方案的各個柱子可以比圖3或圖4系統中所用的那些小得多。系統體積和凝膠的利用率也顯著較高。其主要原因是在吸附區域為活性的凝膠體積的級分高于圖3或圖4系統中的(12個柱子中的6個而不是4個中的2個)。吸附區域的凝膠絕對量大約和圖3或圖4系統中的相同。
B.一般的八(8)區域SMB系統圖7繪制了本發明的八(8)區域SMB系統。根據一實施方案，所有方法步驟在兩相中進行。吸附和洗脫區域具有二乘以二的并聯柱子來降低線性流速。所有其他區域具有兩個串聯的柱子來利用逆流效應。
圖8至10描述了本發明八(8)區域SMB系統的另一實施方案。
實施例1描述了使用圖8實施方案進行的方法。
實施例2描述了使用圖9實施方案進行的方法。
圖10繪制了八(8)區域SMB系統另一實施方案。在該實施方案中，包括吸附劑的再生。每批次運行系統只消毒一次，即，每15,000升一次。吸附區域包括四個柱子，其連接成二乘以二的并聯柱子。在第一洗滌區域隙間液體回料至吸附區域。第一洗滌區域中，三個柱子串聯連接來最大化逆流接觸的效果。為了最小化高鹽濃度和濃縮MAb溶液之間的接觸將第一洗滌緩沖劑以上升流(upflow)引入。當柱離開吸附區域后，床的頂端比底部含有更多的濃縮進料溶液。圖10的實施方案中，用用于第二個洗滌區域的流出液或緩沖劑稀釋第一洗滌區域緩沖劑來獲得節約用水。第二洗滌區域具有兩個柱子并設計在其移動至位置11之前在位置12建立低鹽濃度。在其移動至洗脫區域前將來自產物罐的非常低的產物流泵入柱子11來預飽和柱子。因此位置11的唯一功能是產物濃縮，該處理步驟的普通名稱是夾帶物濾過。在洗脫區域，將洗脫緩沖劑以上升流引入二乘二的并聯柱子中。用用來從洗脫洗滌區域的位置5和6洗出洗脫劑的洗脫洗滌緩沖劑稀釋洗脫緩沖劑。因而，為了補償稀釋效果運用至洗脫區域的洗脫緩沖劑必須濃縮。柱子1至4用來平衡和再生并包括平衡區域和再生區域。如果再生需要特定濃度的氫氧化鈉，運用至系統的再生緩沖劑必須具有較高濃度來適應稀釋。圖10繪制的該系統尤其適合于圓盤傳送帶型SMB系統，其具有在一個系統中使用不同流向的適應性。
為了有助于理解，現在將通過以下實施例進一步說明本發明。當然，涉及本發明的實施例不應視作是特異性地限制發明，本領域技術人員理解范圍內的本發明這樣的改變，現在已知或后來發展的，將認為是落入如在此所述和此后所要求的本發明范圍內的。
實施例實施例1使用八區域模擬移動床系統純化單克隆抗體將模擬移動床(SMB)技術運用至單克隆抗體的蛋白質A初步純化步驟中。系統由20個二十個柱子組成，柱子放置于旋轉的圓盤傳送帶上排列成環狀。八個獨立的區域建為SMB連續系統。
A.設備描述中心閥門(valve)，其由三個部分組成(頂端、中部和底部)，描繪了八個處理區域。在過程中閥門的頂部件保持固定并且出口的內部連接劃定了處理區域。閥門的中間部分是Teflon環可以使底部自由旋轉。閥門的底部與每個柱子的頂端和底部連接。
每個處理區域需要特定的緩沖劑和流速。使用八個HPLC泵將持續流體流傳遞至閥門的頂部的進口部分。
通過以特定間隔旋轉圓盤傳送帶的控制器保持柱子的旋轉。特定停留時間后，圓盤傳送帶旋轉一個位置至下一個位置，創造逆流流動來減少緩沖劑消耗和增加樹脂容量。
B.區域描述在該實施例中，二十個柱子連接至中心閥門上(參見圖8)。在一瞬間，將標記一至二十的柱子對應下列洗滌區域(i)平衡區域從柱子一開始，將平衡緩沖劑(10mM EDTA/50mM Tris(堿)/0.5MNaCl，pH7.5)以向上方向運用至柱子中。柱子一的流出液送往柱子二的底部，收集其流出液于樣品管中用于將來的分析。
(ii)再生區域將再生緩沖劑(4M尿素/50mM Tris(堿)pH7.0)以向下方向運用至柱子三。柱子三的流出液送往柱子四的頂部，收集其流出液于樣品管中用于將來的分析。
(iii)CIP區域原地清洗，將CIP區域緩沖劑(1％磷酸)以向下方向運用至柱子五的頂部。柱子五柱子的流出液送往柱子六的頂部，收集其流出液于樣品管中用于將來的分析。
(iv)洗脫洗滌區域將純化水(MilliQ)以向上方向運用至柱子七，將其流出液以向上方向運用至柱子八。柱子八的流出液通過UV儀監控并收集于樣品管中用于將來的分析。
(v)洗脫區域將洗脫區域緩沖劑(100mM甘氨酸/200mM乙酸pH3.5)以向上方向運用至并聯方式的的柱子九和柱子十。將柱子九和十的流出液合并成單流，然后將其分開以向上方式來洗滌柱子十一和十二。將柱子十一和柱子十二的流出液合并形成產物流，其通過UV儀監控并收集于樣品管中用于將來的分析。
(vi)第二洗滌區域將第二洗滌區域緩沖劑(50mM Tris(堿)/100mM甘氨酸pH7.5)以向下方向運用至柱子十三。將柱子十三的流出液以向下流動運用至柱子十四，收集其流出液于樣品管中用于將來的分析。
(vii)第一洗滌區域將第一洗滌區域緩沖劑(10mM EDTA/50mM Tris(堿)/0.5M NaCl)以向下方向運用至柱子十五。柱子十五的流出液通過UV儀監控，然后以向下方向運用至柱子十六。柱子十六的流出液和進料流合并。
(viii)吸附區域將進料流，其含有宿主細胞蛋白和單克隆抗體以及其它成分的混合物，在線和柱子十六的流出液混合。然后將新的液流分開并以向下方向平行運用至柱子十七和柱子十八。將柱子十七和柱子十八的流出液混合然后分開并以向下方向平行運用至柱子十九和柱子二十。將柱子十九和柱子二十的流出液合并并收集于樣品管中用于將來的分析。
C.處理描述通過以上所示的柱子編號的區域描述表示了一瞬間。當特定的停留時間過去以后，圓盤傳送帶以順時針方向旋轉一步。如實施例，這意味著先前暴露于向下方向平衡緩沖劑中的柱子一現在位于柱子二十之前所在的位置。因此，柱子二十現在位于柱子十九之前的位置，諸如此類延及整套柱子。從處理角度來說，這意味著柱子十九和柱子十八的流出液合并然后分開以向下方向運用至柱子二十和柱子一。持續柱子旋轉直至再沒有進料處理。
區域描述中的每個區域在進料處理中具有特定的目的。從CIP區域開始，再生步驟作為加工-清洗步驟來進行。再生區域確保任何非特異性結合化合物與樹脂分離。實施平衡區域來置換再生區域緩沖劑并在柱子中創造出初始裝載階段中允許抗體結合的環境。在吸附區域，進料流將所需產物引至柱子。第一洗滌區域置換了裝載進料和洗出非特異性蛋白質和其它雜質。實施第二洗滌區域使傳導性達到可接受基線。創造洗脫區域來將抗體與蛋白質A配體分離并收集抗體。洗脫洗滌區域是測試部分，檢測在洗脫區域中是否所有抗體都得到了有效地洗出。
由于方法的經濟效果依賴于處理過程中消耗的緩沖劑體積，進行實驗來測定進行上述分配給每個區域的任務所需緩沖劑的最小量。表I描述了每個部分測試的柱容積范圍。
表I
B.結果處理液流中發現的產物、宿主細胞蛋白(HCP)和慶大霉素相對量的概述顯示于以下的表II中。
表II
NA-未獲得。對于洗滌1的情況，該液流是和進料流合并的，因而，沒有分別測量。
使用該實施例所述的SMB方法獲得了83.8％的蛋白質回收。產物未計入的量可能在再生部分發現。產物集合中的抗體濃度比進料流中高～8.6倍。就單聚物含量和抗體完整性而言的產物質量通過SEC和CE-SDS來研究，并顯示了具有和批處理蛋白質A層析相當的數值。
洗脫集合中HCP降低3.05對數(＞99.9％去除)和慶大霉素下降3.46對數(＞99.96％去除)。HCP濃度和按比例擴大運行的常規蛋白質A層析所得到的結果非常相似。慶大霉素含量低四倍。
實施例2使用另一八區域模擬移動床系統純化單克隆抗體將與實施例1所述SMB系統相似的模擬移動床系統用于純化抗體。該系統也是由二十(20)個柱子組成，柱子附著在旋轉圓盤傳送帶上排列成圓環。建立了八個獨立區域用于SMB連續系統。該系統圖繪制于圖9中。
該系統的結構與圖8中所述的不同之處在于(a)所有柱子以下流方式操作和(b)洗脫洗滌區域使用了四(4)個串連的柱子和洗脫區域使用了兩個(2)串連的柱子。
實施例3抗體純化可再現性的證明實施例2(以及圖9中所示的)所述的模擬移動床系統用來檢驗本發明抗體純化方法的可再現性。SMB系統中單個柱子(該情況中為20個柱子)之間和SMB循環之間(旋轉)都需要可再現性。通過比較來自洗滌1的UV結果柱子之間的可再現性顯示于圖11中。檢測器繪制于圖9中如柱子15和柱子16之間的UV。來自該檢測器的信號顯示了20個柱子的轉換，表示了SMB循環兩個獨立的旋轉在該特定位置的來自20個獨立柱子的洗滌1。如從圖11可見的，來自所有20個轉換的記錄信號是一致的，甚至兩個獨立旋轉有重疊，因此證明柱子到柱子的純化可再現性。
旋轉(系統20個柱子的)之間的可再現性顯示于圖12中。圖12繪制了抗體濃度(IgG滴度)、IgG流量(flux)，和宿主細胞蛋白濃度(顯示了SMB系統9個全旋轉的HCP)的曲線。IgG流量(mg/ml)通過頂端菱形曲線(◆)來表示。IgG滴度(mg/ml)通過較低的菱形曲線(◆)來表示。HCP(ppm)通過方塊(■)曲線來表示。
權利要求
1.使用模擬移動床層析從流體混合物中將免疫反應性化合物與至少一種非本質成分分離的方法，包括步驟(a)提供模擬移動床裝置，其包括流體中進行交流的多個組件，所述組件包括至少一種固相；(b)將流體混合物連續引入所述模擬移動床裝置中，其中流體混合物以逆流方式和固相接觸；(c)實現免疫反應性化合物與至少一種非本質成分的分離；和(d)收集免疫反應性化合物來提供其純化的組分。
2.根據權利要求1的方法，其中所述免疫反應性化合物和固相的結合程度比至少一種非本質成分高或低。
3.根據權利要求2的方法，其中所述免疫反應性化合物和固相的結合程度比至少一種非本質成分高。
4.根據權利要求3的方法，進一步包括通過將促進免疫反應性化合物分離的洗脫劑和所述固相接觸來實現所述分離的步驟。
5.根據權利要求4的方法，其中所述固相包括和蛋白質A或蛋白質G結合的支持物材料。
6.根據權利要求5的方法，其中所述洗脫劑包括酸性緩沖劑。
7.根據權利要求1的方法，其中使用吸附層析、分配層析、離子交換層析、大小排阻層析或親和層析來實現分離。
8.根據權利要求7的方法，其中使用親和層析實現分離。
9.根據權利要求1的方法制備的免疫反應性化合物。
10.用于當免疫反應性化合物和至少一種非本質成分兩者都存在于流體混合物中時將免疫反應性化合物與至少一種非本質成分分離的模擬移動床(“SMB”)系統，其中SMB系統包括多個含有固相的區域，固相逆流地和所述流體混合物接觸，且其中所述區域包括結合區域，其中免疫反應性化合物和至少一種非本質成分與固相有差異地結合；第一洗滌區域，其中至少一種非本質成分優先與固相分離；和洗脫區域，其中免疫反應性化合物優先與固相分離。
11.根據權利要求10的模擬移動床系統，其中所述第一洗滌區域是在所述結合區域和所述洗脫區域中間。
12.根據權利要求10的模擬移動床系統，其中所述固相優先和所述免疫反應性化合物結合。
13.根據權利要求12的模擬移動床系統，其中所述固相包含用于親和層析的配體。
14.根據權利要求13的模擬移動床系統，其中所述固相包含蛋白質A或蛋白質G。
15.根據權利要求12的模擬移動床系統，其中所述固相包含陽離子交換樹脂。
16.根據權利要求10的模擬移動床系統，其進一步包括在所述洗脫區域和所述結合區域之間的洗脫洗滌區域。
17.根據權利要求16的模擬移動床系統，其進一步包括在所述洗脫洗滌區域和所述結合區域之間的再生區域。
18.根據權利要求17的模擬移動床系統，其進一步包括在所述再生區域和所述結合區域中間的平衡區域。
19.將免疫反應性化合物與至少一種非本質成分分離的方法，其包括使用權利要求10的模擬移動床系統。
20.使用權利要求10的模擬移動床系統制備的純化的免疫反應性化合物。
21.使用權利要求20的免疫反應性化合物治療需要治療的患者的方法。
22.當抗體和至少一種非本質成分兩者都存在于流體混合物中時使用模擬移動床層析將抗體與至少一種非本質成分分離的方法，包括步驟(a)提供包括進行交流的流體中多個組件的模擬移動床裝置，所述組件包括至少一種固相，其含有優先結合抗體的親和層析配體；(b)將流體混合物連續引入所述模擬移動床裝置中，其中流體混合物以逆流方式和固相接觸；(c)實現抗體與至少一種非本質成分的分離；和(d)收集抗體來提供其純化的組分。
23.用于當抗體和至少一種非本質成分兩者都存在于流體混合物中時將抗體與至少一種非本質成分分離的模擬移動床(“SMB”)系統，其中SMB系統包括多個含有固相的區域，固相包括親和樹脂，其逆流地和所述流體混合物接觸，且其中所述區域包括結合區域，其中抗體和至少一種非本質成分與固相有差異地結合；第一洗滌區域，其中至少一種非本質成分優先與固相分離；和洗脫區域，其中抗體優先與固相分離。
24.使用模擬移動床層析將在流體混合物中的免疫反應性化合物與至少一種非本質成分分離的方法，包括步驟(a)提供模擬移動床裝置，其包括與所述裝置進行交流的流體中的至少一個組件，所述組件包括至少一種固相，且其中所述裝置包括多個組件通過的區域；(b)將流體混合物連續引入結合區域中的組件，其中流體混合物以逆流方式和固相接觸，且其中免疫反應性化合物和固相結合；(c)將洗滌緩沖劑連續引入洗滌區域中含有結合免疫反應性化合物的組件中，其中洗滌緩沖劑以逆流方式和固相接觸，并從所述組件基本去除至少一種非本質成分；和(d)將洗脫緩沖劑連續引入洗脫區域中含有結合免疫反應性化合物的組件中，其中洗脫緩沖劑以逆流方式和固相接觸，并因此將免疫反應性化合物基本與固相分離；和(e)連續從組件移除含有免疫反應性化合物的產物流。
25.根據權利要求24的方法，其中所述模擬移動床裝置包括多個組件。
26.根據權利要求24的方法，其中所述固相包括親和配體。
27.根據權利要求26的方法，其中所述親和配體包括蛋白質A或蛋白質G。
28.根據權利要求24的方法，其中所述免疫反應性化合物包括抗體。
29.基本通過權利要求28的方法制備的純化的抗體。
30.在從至少一種非本質成分中純化免疫反應性化合物的方法中，改良包括使用帶有含有蛋白質A或蛋白質G的固相的模擬移動床親和層析。
全文摘要
本發明提供了使用模擬移動床(“SMB”)系統將免疫反應性化合物與至少一種非本質成分分離的方法以及用于這些方法的SMB裝置。還提供了使用SMB方法和裝置制得的純化的免疫反應性化合物以及使用純化的免疫反應性化合物的治療方法。
文檔編號B01D15/18GK1777435SQ03824460
公開日2006年5月24日 申請日期2003年9月12日 優先權日2002年9月13日
發明者J·P·特梅斯, A·M·索南斐爾德, J·P·皮拉希, L·康利, M·比紹普斯, M·潘寧斯 申請人:拜奧根Idec公司