專利名稱：檢測和去除內毒素的方法
技術領域：
本發明涉及從樣品中檢測并去除內毒素的方法。
內毒素(ET)是脂多糖家族，其與蛋白質和磷脂一起形成了革蘭氏陰性細菌的細胞外壁。內毒素只出現在這組細菌中，并且在其外膜的排布，穩定性和屏障功能中起重要作用。多種噬菌體利用內毒素或總(general)脂多糖來特異性地檢測其宿主細菌。
所有內毒素變體都包含與磷脂A共價結合的異源多糖(Holst，O.，1999，Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides.InEbdotoxin inhealth and disease(Brade，H.，Morrison，D.C.，Opal，S.，Vogel，S.eds.)，MarcelDekker Inc.New York)。脂質A將內毒素固定在細菌外膜。所述異源多糖包含核心寡糖和O抗原，其出現在周圍的溶液中并決定細菌的血清學特性。O抗原包含重復的寡糖單元，其組成是菌株特異性的(見上文Holst等所述)。核心寡糖的特征性結構單元(building blocks)是2-酮-3脫氧辛酸(2-keto-3-deoxyoctonate)(KDO)和L-甘油-D-甘露庚糖(Hep)。
不同類型的內毒素最保守的部分是磷脂A。內核心區與脂質A的保守性相似，外核心區已經具有很高的變異。內核心區，KDO和磷脂A本身攜帶大量磷酸鹽基團作為替代物，并因此使得內毒素帶負電荷。此外，磷脂A和核心區上的磷酸基團可以用阿拉伯糖，乙醇胺，和磷酸鹽不定取代。O抗原的各個糖結構單元是乙酰化的，唾液酸化的或者糖基化的。O抗原除了其重復單元的數量不同以外還有其它變化，因此每種細菌的內毒素群體具有一定的異源性(Palva E.T.，Makela P.H.，Lipopolysaccharide heterogeneityin Salmonella typhimurium analysed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis.Eur J Biochem.1980；107(1)137-43；Goldman R.C.，LeiveL.，Heterogeneity of antigenic-side-chain length in lipopolysaccharide fromEscherichia coli 011l and Salmonella typhimurium LT2.，Eur J Biochem.1980；107(1)145-53)。
內毒素是實際上在所有沒有相應預防措施的水溶液中均可發現的生化分子。人和動物中的內毒素可導致膿毒癥，導致免疫系統產生強烈的錯誤反應。因此，當制備藥物蛋白時，內毒素污染應當被精確檢測并應當隨后完全去除。內毒素代表了遺傳工程制藥，基因治療或被注入人或動物的物質(例如獸醫治療或在動物實驗中)的一個問題。然而，不僅在藥物中，而且在研究應用(例如動物細胞轉染實驗)中，可觀察到內毒素抑制或降低轉染效率。
為能夠在臨床研究框架中使用蛋白，歐洲和美國藥典要求對內毒素水平而言蛋白的水平在特定邊界值以下(例如，免疫血清球蛋白0.91EU/ml，相當于5EU/kg體重和小時(劑量＝EU/kg*h)；EU＝內毒素單位；FDA(食品和藥品監督局)(Food and Drug Administration)Guideline on Validation of LALas End Product)。如果藥物或蛋白中含有過高的內毒素水平，可導致受試物的死亡。被錯誤導引的免疫防御系統造成患者過度反應而導致損害。這可導致組織炎癥，血壓降低，心跳加速(heart racing)，血栓形成，休克等。即使較長時間暴露于皮克級的內毒素也可導致慢性副作用，例如免疫缺陷，膿毒癥癥狀等。在物質生產的框架內，尤其是在具有“藥品生產質量管理規范(GMP)”的方法中，試圖盡可能去除內毒素。然而，去除蛋白質，多糖和DNA中的內毒素很麻煩。就蛋白質本身而言，由于其內在的性質有大量問題，例如帶電狀態或疏水性，從而實質上阻止了內毒素去除并可導致去除過程中大量產物丟失。
目前，只描述了三種在生物溶液中檢測內毒素的方法，只有前兩種得到了FDA的許可。1.“兔熱原實驗”；在該方法中，將內毒素溶液注入活兔子體內，并由此激發免疫反應。這種內毒素誘導的免疫反應通過出現發熱來檢測。2.“鱟變形細胞溶解試驗(LAL)”-實驗，該實驗是目前使用最頻繁的(Bio Whittacker，Inc.，Charles-River，Inc.，Associates of Cape Cod，Inc.，allUSA)，其可以明顯改善的方式被標準化。使用該方法，馬蹄蟹(Limuluspolyphemus)的血液凝聚可在內毒素接觸后測定。3.還有一種可能是使用特殊細胞培養系統(Sterogene Inc.，USA)，使用該系統可以通過特定細胞因子的出現而顯示單核細胞的活化。
但前兩種方法非常昂貴(cf.競爭比較內毒素檢測)并且，由于需要大量實驗動物以及稀有的馬蹄蟹的血液，所述方法就動物保護而言至少存在問題。LAL實驗實際上也可小型化并自動化，但由于其組分的低穩定性，其在應用中具有大量缺點。一旦LAL溶液被打開，由于其組分將在幾小時內發生聚集，必須馬上進行處理并用完。所有實驗方法都需要熟練技術人員，并且所述方法非常容易受到干擾的影響，這是因為例如兔的免疫系統可對相同劑量的內毒素產生完全不同的反應。Sterogene公司的細胞培養方法同所有細胞培養方法一樣，也非常復雜，并有標準化問題。
可完全確認沒有容易掌握并且經濟的內毒素檢測方法，而且目前使用的方法有一系列缺點。因此需要可以避免這些缺點的方法。
通常有一系列方法可將內毒素從生物溶液中完全去除。尤其對蛋白質而言，目前仍沒有通常可應用的標準方法。可使各種所用的方法適合各種蛋白質的具體特性，并適應蛋白的相應生產過程。有多種可能來去除內毒素，這些方法的每一種都具有特定的優點和缺點。
超濾(Petsch，D.& Anspach，F.B.，2000，J.Biotechnol.76，97-119以及其中的參考文獻)用來從水和含有低分子量組分(例如鹽，糖和抗生素)的溶液中完全去除內毒素，但不適合高分子量的蛋白質或者DNA。
2階段提取(2-phase extraction)(例如WO0166718，Merck)目的是將水溶性蛋白質和DNA從內毒素中分離，但在純化的產物中產生清潔劑殘余。由于純化步驟需要多次重復，該方法還非常耗時。
陰離子交換物(DEAE)法也用于從DNA和堿性蛋白中去除內毒素(例如US5990301，Qiagen；WO 9414837，Enzon)，但其需要低離子強度(＜50mMNaCl)，并且導致酸性蛋白的蛋白共吸收。
從DNA和蛋白質(例如BSA，肌球蛋白，γ-球蛋白，細胞色素C)中完全去除內毒素的方法還有親合吸收(例如多粘菌素B，組胺，組氨酸，聚賴氨酸)，例如GB 2192633(Hammersmith醫院)對多粘菌素B是有毒的，并且在低離子強度的情況下導致蛋白的共吸收。
此外，使用免疫親合層析，其對具體的內毒素的特異性僅可通過昂貴的針對核心寡糖的抗體(US 5179018，Centocor；WO 0008463，Bioserv)獲得。
此外，因子C(LAL實驗的組分)的S3δ-肽(WO 0127289)(WO 9915676，bothNational University of Singapore)用于蛋白質(例如BSA，糜蛋白酶原)，然而該方法在高離子強度的情況下的效率較低，并且生產費用較高(在昆蟲細胞培養物中的生產)。
在制藥工業的應用中，發現主要有三種方法適合靶蛋白質的性質；·陰離子交換層析
·反相層析；其缺點是其并非對所有蛋白都合適-尤其對疏水蛋白質而言存在問題。該方法還非常耗時。
·Rem Tox(Millipore Company)該方法缺點是除了需要非常長的保溫期(incubation period)以外，非特異性結合組分較高且蛋白質回收通常不充分。
使用現有方法可以在許多情況下實現從蛋白質中粗去除內毒素，使其濃度達到10EU/ml。但余下的內毒素濃度總還具有毒性作用。因此，進行進一步的去除(＝精制)，或根據藥物應用中蛋白質的劑量，由歐洲藥典(例如5EU/kg體重以及靜脈內應用的小時數)和FDA中規定為強制性的。然而，現有的方法通常不能令人滿意地保證該精制純化步驟。目前的市場方法在這方面具有明顯的缺點，并且對具體蛋白質而言，通常不能使用或者將造成大量丟失靶蛋白。
本發明的目的因而是提供可檢測樣品中內毒素的方法。此外，本發明的目的是提供可用來從水溶液中去除內毒素的方法。
這些目的通過權利要求中定義的主題實現。
以下圖解釋了本發明。
圖1顯示了來自大腸桿菌O111B4的內毒素的化學結構總體圖示。Hep＝L-甘油-D-甘露庚糖；Gal＝半乳糖；Glc＝葡萄糖；KDO＝2-酮-3-脫氧辛酸鹽；NGa＝N-乙酰半乳糖胺；NGc＝N-乙酰葡糖胺.
圖2顯示了利用攜帶通過巰基固定的NStrepS3Cp12的層析柱進行檢測的結果。(A)從蛋白溶液中去除內毒素牛血清白蛋白(BSA)，碳酸酐酶(CA)和溶菌酶(Lys)在柱上溫育1小時，并隨后使用緩沖液洗脫。過柱前和過柱后的內毒素濃度用LAL實驗測定，并且由此計算去除百分比。(B)蛋白回收起始溶液的蛋白濃度和過柱后的片段通過在280nm測定吸收而確定，并且由此確定蛋白回收的百分比。
圖3顯示用“非定向的(undirected)”(1)和“定向的(directed)”(2)固定p12通過層析柱從溶菌酶溶液中去除內毒素。在兩種情況下，p12S3C都與NHS活化的柱結合。“非定向的”固定通過p12S3C的伯胺基實現(其通過與NHS基團反應產生帶有載體物質的共價化合物)。通過N末端半胱氨酸的“定向”p12S3C交聯是通過乙二胺和SIA(N-琥珀酰亞胺-碘乙酸)實現的。(A)內毒素去除百分比。(B)蛋白回收。
圖4顯示使用生物素化的p12(其通過鏈霉抗生物素與磁性珠結合)進行檢測的結果。(A)從緩沖液(20mM hepes，150mM NaCl，pH7.5)和蛋白溶液中去除內毒素可通過LAL實驗測定。(B)通過吸收值測定從蛋白溶液中回收的蛋白。從溶液中分離磁性珠通過磁鐵分離器進行。BSA牛血清白蛋白。CA碳酸酐酶.Lys溶菌酶。
圖5顯示了使用通過生物素-鏈霉抗生物素的相互作用而固定在瓊脂糖上的p12進行的內毒素去除的結果。固定的p12的分離通過離心實現。從緩沖液(20mM tris，150mM NaCl，pH8.0)和BSA溶液中去除內毒素通過起始溶液以及殘余物的內毒素濃度確定。
圖6顯示表面-胞質團-共振(surface-plasmon-resonance)測定。(A)根據對不同(分別為μg/ml100；25；6.25；4；1.56；0.4)的p12濃度(＿＿)的反應測定的共振曲線。結合在來自大腸桿菌D21f1的內毒素(其固定在疏水HPA芯片上)上實現。p12和EDTA(5mM)的注入用曲線上的柱標記。緩沖液20mMtris，150mM NaCl，pH8.0.(B)p12與固定內毒素結合的平衡共振值在開始注入p12后大約600秒測定，并對結合p12的濃度作圖。連續曲線顯示Langmuir吸收等溫線(RU＝RUmax*[p12]/[p12]+Kd))適合所述數據。(C)大腸桿菌和固定在鏈霉抗生物素芯片上的生物素化的p12的結合。大腸桿菌D21e8(＿＿)(其內部核心區完整)與p12結合。反之，核心區大大縮短的大腸桿菌D21f2(----)不與p12結合。所述測定在PBS中完成。
圖7圖示了各種大腸桿菌突變體的內毒素核心區結構。
圖8圖示了通過層析柱通流(throughflow)法消減內毒素的結果。E代表平衡緩沖液(20mM hepes，150mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH7.5)，A代表洗滌緩沖液A(20mM hepes，150mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH7.5)，B代表洗脫緩沖液B(20mM hepes，150mM NaCl，2mM EDTA，pH7.5)，C指再生緩沖液C(20mM hepes，150mM NaCl，2mM EDTA，0.005％NaDOC，pH7.5)，S指起始溶液中的蛋白和內毒素濃度。BSA指牛血清白蛋白。EU指內毒素單位。注入(I)4ml起始溶液后(S)，再用15ml洗滌緩沖液洗，并對流出物進行分級(加樣時各2.5ml，洗滌時各2ml)。隨后，用緩沖液B和C使柱再生，并同樣地以級分的形式收集洗出液(分別為2ml)。如圖所示，BSA可在注射后最早的3-5個級分中發現。這些級分中內毒素的含量比起始溶液低100倍。與柱結合的內毒素隨后用緩沖液B和C從柱上洗滌出來。
圖9圖示了用通流法從輕微污染的緩沖溶液(5EU/ml)中去除內毒素的結果。固定p12(8mg p12/1ml瓊脂糖)，其不針對NHS活化的瓊脂糖4FastFlow(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，并分別用2ml柱體積充滿3個柱。所述實驗在3個平行的柱上進行。在加樣前，分別收集1ml平衡緩沖液(20mM hepes，150mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH7.5)，然后將樣品(S來自大腸桿菌O55B5的內毒素，在平衡緩沖液中，4.6EU/ml)注入(I)，并收集5ml和2ml的級分。柱的再生通過加入4ml再生緩沖液(B20mMhepes，150mM NaCl，2mM EDTA，0.005％NaDOC，pH7.5)實現。內毒素濃度通過LAL實驗的方法測定(動力學發色(kinetically chromogenic)LAL實驗，Charles-River Inc.)。內毒素雜質能在所有三個實驗中完全去除，即在通流中的內毒素濃度在檢測極限以下(＜0.005EU/ml)。
本文術語“內毒素去除”用于完全或部分地從樣品物質中去除內毒素。
本文術語“內毒素”描述了作為革蘭氏陰性細菌的外膜成分的細菌脂多糖。
本文術語“噬菌體尾蛋白”指出現在噬菌體中并可結合細胞膜成分的那些蛋白。通常，這些蛋白位于噬菌體尾中，但也可位于噬菌體頭部，或位于沒有尾部的噬菌體的正常細菌殼上。噬菌體尾蛋白結合的細胞成分尤其可檢測內毒素。
本文術語“非特異性固定”或“非定向固定”指將蛋白偶聯到基質是通過分布在整個蛋白表面各處的蛋白基團(伯胺)實現的。用于偶聯單獨的蛋白分子的基團的選擇是隨機的。
本文術語“定向固定”指偶聯是通過氨基酸基團或其它基團(例如蛋白糖基化)實現的，其中所述基團在蛋白中的位置(例如N端或C端)是已知的。選來用于偶聯的這些基團是通過選擇與這些基團很好地相互作用的適宜反應配偶體/接頭實現的(例如將巰基和碘乙酸基團偶聯；碘乙酸與巰基反應的速率比其與氨基基團反應的速率快1000倍)。
本發明涉及檢測內毒素的方法，包括以下步驟a)將樣品與噬菌體尾蛋白一同溫育，b)檢測與噬菌體尾蛋白結合的內毒素。
本發明優選涉及一種方法，其中所述檢測通過光譜法來實現，例如熒光發射，熒光偏振，吸收或循環二色性，或者通過電容測量的方法，例如電信號來實現，或者間接通過競爭檢測法實現。
如必要，在步驟a)后和步驟b)前，可引入額外的步驟a′)，即從樣品中分離噬菌體尾蛋白-內毒素復合物。
本發明還涉及從樣品中去除內毒素的方法，包括以下步驟a)以非特異的方式或定向方式(directed manner)，將樣品與固定在固定載體上的噬菌體尾蛋白共溫育或使其接觸，b)從所述樣品中分離噬菌體尾蛋白-內毒素復合物。
優選，二價離子的離子組合物，例如Ca2+，Mg2+和/或pH值在溫育前進行調整，以獲得最佳內毒素-噬菌體尾蛋白結合。此外，在溫育期間和以后，通過加入清潔劑和/或鹽，例如Tween，triton NaCl或硫酸銨或其它物質，例如殼聚糖，蔗糖或脂類，“暴露(demasking)”結合的內毒素是優選的，其中上述物質能加速內毒素從例如蛋白或核酸的解離。
噬菌體尾蛋白可天然存在或經過分子生物或生物化學修飾。由于多種原因，所述噬菌體尾蛋白可通過遺傳改造和/或生化方法進行改造。對于本發明的方法，不僅天然存在的噬菌體尾蛋白可使用，且其變體也可使用。在本發明中，變體指具有改變的氨基酸序列的噬菌體尾蛋白。這些可通過篩選天然存在的變體或者隨機誘變或靶誘變，以及化學修飾獲得。用于本發明方法的噬菌體尾蛋白可通過在其特異性或其與載體結構的結合性質中進行靶誘變或隨機誘變而進行改造。對載體的結合可以是永久的，例如共價結合或者通過特異性或非特異性生物素化，但也可以是可逆的，例如通過可還原的二硫橋。此外，還可通過修飾增加穩定性。通過分子生物或化學誘變，可導入的突變可以是氨基酸添加，缺失，取代或化學修飾。這些突變可導致噬菌體尾蛋白結合區中的氨基酸序列發生變化，目的是使特異性和結合親合力符合實驗要求，例如增加內毒素與噬菌體尾蛋白的結合，或者使它們可逆從而改善檢測或去除。此外，可對噬菌體蛋白進行遺傳改造或生化修飾以封閉可能存在的酶活性從而改善結合或使其可逆。此外，可對噬菌體蛋白進行遺傳改造或化學修飾，從而使蛋白的物理性質，例如溶解性，熱穩定性等適應本發明的方法的需要。
解釋T4 p12的三維結構的工作顯示，在增加溫度時，可產生33kDa和45kDa的蛋白水解片段，其中N和C末端(33kDa)或僅N末端(45kDa)被縮短。與33kDa的片段相反，45kDa的片段仍能和細菌結合。因此，C末端參與細胞結合。
所述修飾還尤其能夠實現直接檢測，例如通過測定色氨酸熒光。例如p12具有5個色氨酸基團。天然蛋白的熒光色譜表明，溶劑通常不能接近這些基團。從多項科學研究可知，芳香氨基酸幾乎總參與糖基團的結合，內毒素中也如此。糖基團與蛋白質的結合可通過色氨酸熒光的猝滅追蹤，或者必要時還可改變熒光最大強度。可從一些工作中推定，天然p12的熒光團的不利分布阻止對p12用于結合測定的熒光性質的開發。p12的熒光性質主要由五個色氨酸基團控制，其熒光通過以不可測定的方式加入內毒素而改變。從這些數據預期，優選酪氨酸基團像色氨酸基團一樣參與結合，其信號改變在高色氨酸背景下不能顯示。基于蛋白水解結果，p12的C末端的6個酪氨酸對內毒素檢測試劑盒而言是可能檢測到的，它們可產生相應的“可見性”。將5個色氨酸殘基通過選擇性分子生物交換為酪氨酸，色譜性質在第一步中特異性改變，使得通過單個色氨酸基團的熒光信號改變可測定內毒素結合。因此，通過分別特異性交換C末端區的6個酪氨酸之一為色氨酸基團，可檢測信號的強度明顯增強從而獲得有吸引力的信號差異來發展內毒素檢測試劑盒。
使用的噬菌體尾蛋白依賴與內毒素意圖被檢測或去除。即使是現在，大量已知噬菌體可用于大部分前述的細菌，并用于本發明的方法。所述噬菌體和相應的宿主細菌可獲自以下菌株保藏單位ATCC(美國)，DSMZ(德國)，UKNCC(英國)，NCCB(荷蘭)和MAFF(日本)。
優選，本發明的方法中的噬菌體尾蛋白來自噬菌體，即與醫藥和生物技術有關的宿主細菌，例如用于制備用于基因治療的重組蛋白或核酸的大腸桿菌。與內毒素高度保守區(例如核心區，或脂質A)結合的噬菌體尾蛋白是尤其優選的。具體優選p12和與p12相似的噬菌體尾蛋白。在來自各種宿主細菌的內毒素雜質組合物中，可使用相應的內毒素檢測噬菌體尾蛋白的組合物。
檢驗或去除樣品中或來自樣品的內毒素通過內毒素與噬菌體尾蛋白的結合實現。所述結合可通過例如通過光譜法直接測定，例如通過熒光發射，熒光偏振，吸收，或循環二色性。此外，所述結合可以通過電信號，例如電容測量顯示。此外，內毒素與噬菌體尾蛋白的結合可通過置換實驗間接測定。
對于根據本發明進行的檢測，所述噬菌體尾蛋白(如果需要從樣品中分離噬菌體尾蛋白-內毒素復合物)可以和適宜的載體結構偶聯，例如磁性顆粒，瓊脂糖顆粒，微量滴定板，過濾物質或流通細胞室(間接測定)。所述載體結構可包括例如聚苯乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯，PMMA，醋酸纖維素，硝化纖維，玻璃，硅或瓊脂糖。所述偶聯可通過例如吸收或共價結合實現。
本發明的去除方法中，所述噬菌體尾蛋白與永久載體偶聯。所述永久載體可以是層析柱物質(例如瓊脂糖物質)，過濾介質，玻璃顆粒，離心或沉淀物質(例如瓊脂糖顆粒)。
功能偶聯在此是重要的，即盡管與載體物質相結合，所述噬菌體尾蛋白具有可接近內毒素的結構。噬菌體尾蛋白的偶聯可非特異性和優選定向地，通過例如選擇性生物素化或偶聯或通過間隔物或接頭實現。
為此，所述噬菌體尾蛋白可以和低分子物質，例如生物素交聯以通過這些的分子物質與多肽如鏈霉抗生物素結合，所述多肽固定于載體上。除了生物素外，還可使用所謂Strep-標記(Skerra，A.& Schmidt，T.G.M.Biomolecular Engineering 16(1999)，79-86)，其是短氨基酸序列，并與鏈霉抗生物素結合。此外，可使用His-標記，其通過二價離子(鋅或鎳)或其特異性抗體(Qiagen GmbH，Hilden)，與載體物質結合。該Strep-標記和His-標記優選通過DNA重組技術與重組產生的噬菌體蛋白結合。所述偶聯可以是定向的，例如在N末端或C末端，也可以是非定向的。定向偶聯可通過適宜的反應性氨基酸，例如半胱氨酸實現，其顯然不經常暴露于噬菌體蛋白表面，而被特異性導入適宜的位置。由于噬菌體尾蛋白在細胞質中合成，不需要考慮二硫橋。優選，偶聯可通過其它氨基酸直接或通過“間隔物”或“交聯物”(單功能或雙功能)間接進行。
對于半胱氨酸偶聯，所有具有NH和SH反應性基團的雙功能交聯物都是可能的(其具有或不具有中間間隔物)，例如11-馬來酰亞胺十一烷酸(maleimidoundecanoic acid)硫代-NHS或琥珀酰亞胺-4-[N-馬來酰亞胺甲基(maleimidomethyl)]-環己胺-1-羧基-[6-氨基]己酸酯。如果沒有間隔物，可插入具有末端NH基團的8-12個C原子的間隔物。優選所述半胱氨酸偶聯通過半胱氨酸的特異性生物素化實現，該過程使用例如EZ-link-PEO-馬來酰亞胺活化的生物素(Pierce)來進行。
二價例子，例如Ca2+或Mg2+對內毒素與噬菌體蛋白例如gp12的結合很重要。通過加入適宜的螯合劑，例如EDTA或EGTA，所述結合可以被破壞。為進行結合，Ca2+濃度優選在大約0.1μM到大約100mM的范圍內，尤其優選在大約0.1μM到大約10mM的范圍內，特別優選大約0.1μM到大約1mM的范圍，且更尤其優選大約10μM到1mM的范圍。如果二價離子的濃度通過加入1mM EDTA降低到100nM以下，隨后內毒素與p12的結合被破壞。10mM以上的Mg2+濃度使得內毒素與p12的結合更糟，這從解離常數的升高可注意到。不加入Mg2+時，產生50nM的Kd值且，在10mM Mg2+中時，測定的Kd值為1μM。鋅顯示更高的抑制效果。1mM Zn將Kd值增加到10μM。調整二價離子或其它離子(e.g.Cu2+，Al3+，Zn2+，Fe2+，Ca2+，Ba2+，Mg2+，Cd2+)的濃度到結合的最佳范圍，可通過例如HEDTA，NTA或常見螯合劑/緩沖液(ADAN-[2-acet氨基]-2-亞氨基二乙酸(iminodiacetic acid)；5-AMP腺苷酸-5′-單磷酸；ADP腺苷酸-5′-二磷酸；ATP腺苷酸-5′-三磷酸；Bapta1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′，-四乙酸；citrate檸檬酸；EDTA乙二胺四醋酸；EGTA乙二醇-雙(β-氨乙酸乙醚(aminoethyl ether))N，N，N′，N′-四乙酸；HEDTAN-羥乙基乙二胺三醋酸(hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid)；NTA三甘胺酸(nitrilotriacetic acid)；SO4硫酸鹽)實現，其用作二價離子的緩沖物。
因此本發明的方法可進一步包含洗滌步驟。根據直接或間接檢測或去除是否需要分離樣品和噬菌體尾蛋白，可包含洗滌步驟。由于Ca2+或其它金屬離子(例如Mg2+)對結合很重要，內毒素與例如p12的結合可以通過適宜的洗滌步驟破壞。根據內毒素是否意圖保持和噬菌體尾蛋白例如p12的結合，可用不含EDTA的緩沖液洗滌，如意圖破壞結合可用含EDTA緩沖液，所述EDTA濃度在至少0.05mM到大于10mM的范圍內，優選在2mM-5mM范圍內。
所述分離在將樣品與載體物質溫育大約5-60分鐘或大約30-180分鐘，或者需要時保溫過夜后進行，所述載體與相應的噬菌體尾蛋白偶聯。為此，所述樣品從例如層析柱上洗脫或者過濾，或通過離心或沉淀除去相應顆粒，或通過使用磁場利用磁性分離。本文所述批次法(batch method)中的分離，例如通過預保溫樣品和載體物質(與相應的噬菌體尾蛋白偶聯)，可尤其對非常低濃度的內毒素敏感。
通過層析柱去除內毒素也可在純通流法中實現。樣品可加于用于此目的的柱上，所述柱含有偶聯了噬菌體尾蛋白的載體物質。流速有賴于柱的體積和幾何結構。流速可進一步有賴于樣品的體積和內毒素含量，以通過盡可能長的柱和內毒素的接觸時間(甚至在低內毒素濃度的情況下)而獲得有效的去除。由此可見，接觸時間是從將樣品加樣到柱上到其流出所需的時間。
分離步驟可以用于例如去除方法中以使與永久性載體偶聯的噬菌體尾蛋白再生。結果，所述永久性載體，例如基質可在層析柱中再循環。再生通過適宜的含EDTA或者相應的螯合劑的再生緩沖液來去除結合的內毒素來實現。對于EDTA，優選大于2mM的濃度，尤其是大于10mM的EDTA。
由于離子相互作用可基本上總是通過離子強度變化實現，溶液中其它鹽例如NaCl或KCl的增加或降低，也可實現內毒素與噬菌體尾蛋白的結合。
為使檢測法中的結合直接或間接可見，所述蛋白也可通過分子生物學或生物化學方法改變，以進行或改進測定。為使內毒素與例如p12的結合直接可見，用酪氨酸基團交換了色氨酸。因此，減弱信號背景需要以用最初含有的色氨酸交換酪氨酸。為能在含蛋白的溶液中進行測定，色氨酸誘導后，還可對p12進行化學修飾。由此可根據它們的光譜學性質，通過Koshland試劑(2-羥基-5-硝基芐基溴化物(nitrobenzylbromide))改變色氨酸基團。對于置換實驗，標記的，例如熒光標記的內毒素(例如Sigma)可用內毒素例如由p12置換，其位于樣品中且游離熒光內毒素的濃度可測定。
根據本發明的方法，內毒素可在所有水溶液中檢測并從中去除。這些溶液含有蛋白質，質粒-DNA，基因組DNA，RNA，蛋白質-核酸復合物，例如噬菌體或病毒，糖，疫苗，藥物，透析緩沖液(藥品)，鹽或其它由內毒素結合污染的物質。
本發明另一方面涉及噬菌體蛋白，其中所謂的標記，例如Strep-或His-標記，與所述蛋白偶聯，優選與該蛋白的N末端或C末端偶聯，尤其優選C末端。優選所述標記與噬菌體蛋白通過DNA重組技術偶聯或交聯。所述核酸(其包含噬菌體蛋白的序列)，和所述標記的產生，以及表達產物的產生是本領域已知的，并不需要單獨說明。本發明另一方面涉及編碼具有Strep-或His-標記Strep-或His-標記的噬菌體蛋白的核酸序列。噬菌體T4的p12蛋白是尤其優選的噬菌體蛋白，其由Strep-或His-標記修飾，但所有其它參與檢測和細菌結合或與此有關的噬菌體蛋白也同樣優選。
本發明的另一方面是具有表面暴露的半胱氨酸的標記(用于特異性定向生物素化)的噬菌體蛋白，所述標記例如根據SEQ ID NO5，6和7的標記。具有標記的p12的實例是SEQ ID NO8中所述的氨基酸序列。優選具有標記的p12，尤其優選具有表面暴露的半胱氨酸的標記的p12，尤其是具有SEQID NO6和7的標記的p12。該定向生物素化可通過適宜的間隔物或接頭適宜地形成。此外，本發明涉及具有SEQ ID NO5，6和7的序列的氨基酸。此外，本發明涉及編碼SEQ ID NO5，6和7的氨基酸序列的核酸。
本發明涉及檢測和純化內毒素的方法，有利于相應應用的進行。此外，LPS核心寡糖抗體的產生非常困難，使得基于抗體的相應方法非常昂貴。
以下實施例揭示了本發明并不應理解為限制性的。如果沒有特別指出，使用分子生物標準方法，例如Sambrook等，1989，Molecular cloningALaboratory Manual 2ndedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York所述。
1.玻璃容器，塑料容器和緩沖液對于內毒素的去除，所有玻璃容器通過在200℃(4h)加熱除去病原，并使用專用的無病原體塑料物質(例如吸液管，微量滴定板)。其它不耐熱的器具或容器使用3％的過氧化氫處理或者用1％脫氧膽酸鈉洗滌。隨后，使用不含內毒素的水洗滌它們。緩沖液由大量不含內毒素的緩沖物質制備(Sigma)，并與不含內毒素的水混合。加熱鹽，(例如NaCl，可加熱到200℃)，(200℃，4h)。用于層析純化的緩沖液被脫氣并過濾。
2.通過LAL檢測法檢測內毒素內毒素對照實驗通過生色LAL實驗(Limulus-Amoebocyte-Lysate test，Charles-River Endosafe，Charleston，USA)，根據生產說明進行。為測定濃度，使用濃度范圍0.005-50或0.02-50EU/ml的內毒素標準品(Charles-RiverEndosafe，Charleston，USA)。在溫度控制的微量滴定板讀數儀(Genios，TecanGmbH)上測定405nm的吸收。
3.p12檢測的Western印跡在用小珠處理的樣品殘留物或親合層析級分中檢測p12通過Western印跡進行。部分蛋白首先通過NaDOC/TCA沉淀(去氧膽酸鈉/四氯乙酸)濃縮。所述樣品在12％的SDS凝膠上通過電泳分離，并轉移到PVDF膜上(Immobilon，Millipore)。所述膜用PBS洗滌30分鐘，由5％奶粉封閉(1小時)，并隨后和多克隆抗p12抗體(1小時，稀釋度1∶1000)溫育。與偶聯于堿性磷酸酶的第二抗體(山羊抗兔IgG)溫育后，樣品進一步用BCIP/NBT(5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽(chloroindolylphosphate)/硝基藍(nitroblue)四唑鹽)處理。
4.內毒素純化內毒素的純化根據Galanos，C.，Lüderitz，O.& Westphal，O.1969，Europ.
J.Biochem.9，245-249的說明進行。
實施例5p12與固定的碘乙酸基團的特異性偶聯為獲得p12與表面的定向結合，位于SEQ ID NO5的Strep-標記的位置3的氨基酸絲氨酸由半胱氨酸取代(如實施例12所述)，并且通過碘乙酸基團(其優選結合游離的巰基基團)將所述蛋白固定。生成的p12稱為p12S3C。
傾出1ml Sulfolink偶聯凝膠(Pierce)，用6ml 1％去氧膽酸鈉洗滌，并用6ml偶聯緩沖液平衡(50mM tris，150mM NaCl，5mM EDTA，pH8.5)。隨后，注入1ml p12S3C(＝N-strepS3Cp12)(1-1.5mg/ml，偶聯緩沖液中)，輕輕搖動柱子15分鐘，并在室溫不搖動下再保溫30min，且再次將1mlp12S3C注入，并重復保溫步驟。所述p12S3C的偶聯共重復4此，且隨后用6ml偶聯緩沖液洗柱。收集流出物，并通過測定280nm的吸收分別測定各p12S3C濃度。每毫升凝膠結合2.2-2.8mg p12S3C。隨后，多余的碘乙酸基團通過與1ml半胱氨酸(50mM，50mM tris，5mM EDTA中，pH8.5)保溫(45min)而封閉。用16ml 1M NaCl和16ml 20mM hepes，150mM NaCl pH7.5洗滌柱后，將柱備用。
該凝膠從蛋白溶液中去除內毒素的能力通過BSA(2-4mg/ml)，碳酸酐酶(1-2mg/ml)和溶菌酶(3-4mg/ml)檢測。BSA和溶菌酶溶液摻入來自大腸桿菌O55B5(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)或大腸桿菌HMS174(100-1000EU/ml)的內毒素，而碳酸酐酶不和額外的內毒素混合。分別將0.5ml蛋白溶液導入柱，在室溫溫育1小時，并隨后用緩沖液洗滌柱。所述蛋白收集在級分中，并通過生色LAL實驗(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)在上柱前后測定內毒素含量。此外，蛋白回收物還可通過280nm的吸收測定。內毒素能從所有3個蛋白溶液中完全去除(93-99％)，如圖2A所示。此外，所述蛋白能從柱上大量洗脫(80-99％，圖2B)。最后用5mM EDTA，20mM hepes，150mM NaCl，pH7.5使柱再生。為在因分離p12而過柱以后去除蛋白級分中的雜質，通過Western印跡技術檢測所述級分中的p12。所述級分中不能檢測到p12。
實施例6p12與NHS-活化的載體物質的非特異性偶聯N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)通過伯胺基團從化合物中置換出來，并由此用于將蛋白偶聯在表面。NHS-活化的瓊脂糖柱(HiTrap NHS-活化的HP，1ml，Amersham-Pharmacia-Biotech)首先用6ml冰冷的1mM鹽酸中。隨后，將10-15ml p12S3C(1.0-3.5mg/ml)(0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3中)循環(in a circle)在室溫加于柱上(流速0.8ml/min)。60分鐘后，將流出物收集在級分中，并使用6ml緩沖液洗滌柱。從這些級分中通過HiTrap-脫鹽柱(5ml，Amersham-Pharmacia-Biotech)對溶液進行脫鹽從而分離NHS，并隨后通過測定280nm的吸收測定p12的量。20-25mg的p12S3C與柱結合。所述柱在偶聯后根據產品說明分別用6ml封閉緩沖液(0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH8.3)和洗滌緩沖液(0.1M乙酸，0.5M NaCl，pH4.0)進行重復潤洗。然后，用6ml可用緩沖液(usable buffer)(20mM hepes，150mM NaCl，pH7.5或20mM tris，150mM NaCl，pH8.5)平衡柱子。
通過該柱去除內毒素通過溶菌酶溶液(3-4mg/ml，20mM hepes，150mMNaCl，pH7.5 or 20mM tris，150mM NaCl，pH8.5中)檢測。所述溶菌酶溶液與來自大腸桿菌HMS174(～500EU/ml)的內毒素混合。0.5ml蛋白溶液加于柱上，在室溫保溫1小時，并隨后用緩沖液洗滌柱子。將溶菌酶收集在級分中，并通過生色LAL實驗(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)在過柱前后測定內毒素含量。此外，蛋白回收通過測定280nm的吸收確定。內毒素從溶液中去除達85-90％，如圖3A所示，且可將85-90％的溶菌酶通過用可用緩沖液進行洗滌而從柱上再洗脫(圖3B)。隨后用6ml 5mM EDTA，20mM hepes，150mM NaCl，pH7.5和6ml 1M NaCl洗滌柱。為在因分離p12而過柱以后去除蛋白級分中的雜質，通過Western印跡技術檢測所述級分中的p12。所述級分中不能檢測到p12。
實施例7p12與NHS-活化的載體物質柱通過以二氨基乙烷和N-琥珀酰亞胺-碘乙酸(SIA)作為間隔物進行定向偶聯為獲得與層析載體物質的定向結合，將雙功能接頭連接于NHS活化的表面，所述接頭通過其游離半胱氨酸以及雙功能接頭的碘乙酸基團實現p12S3C的偶聯。
NHS-活化的瓊脂糖柱(HiTrap NHS-活化的HP，1mlAmersham-Pharmacia-Biotech)首先用6ml冰冷的1mM鹽酸洗滌，然后將1ml乙二胺(10mg/ml，0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3中)注入，并在室溫保溫柱子30分鐘。用乙醇胺(0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH8.3)封閉多余的NHS基團后，洗滌(0.1M乙酸，0.5M NaCl，pH4.0)柱子，并用6ml硼酸鹽緩沖液(50mM硼酸鈉，150mM NaCl，5mM EDTA，pH8.3)平衡柱子。隨后，10ml N-琥珀酰亞胺-碘乙酸(SIA，Pierce，200μl SIA母液在10ml硼酸鹽緩沖液中；SIA母液1.4mg SIA在1ml DMSO中)循環洗柱30分鐘。該柱隨后用6ml硼酸鹽緩沖液和p12S3C(1mg/ml，50ml，硼酸鹽緩沖液中)洗柱1小時。多余的碘乙酰基團用1ml半胱氨酸溶液(5mM半胱氨酸在硼酸鹽緩沖液中于室溫保溫15分鐘)，然后用可用緩沖液(20mM hepes，150mM NaCl，pH7.5 or 50mM tris，150mM NaCl，ph8.5)平衡柱。用SIA進行的偶聯反應在黑暗中完成。
通過該柱去除內毒素用溶菌酶溶液(3-4mg/ml，20mM hepes，150mMNaCl，pH7.5 or 20mM tris，150mM NaCl，ph8.5中)檢測。所述溶菌酶溶液與來自大腸桿菌HMS174(～500EU/ml)的內毒素混合。0.5ml蛋白溶液加于柱上，在室溫保溫1小時，并隨后用緩沖液洗滌柱子。將溶菌酶收集在級分中，并在通過生色LAL實驗(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)在過柱前后測定內毒素含量。此外，蛋白回收通過測定280nm的吸收確定。內毒素從溶液中去除達90％，如圖3A所示，且可將75-85％的溶菌酶通過用可用緩沖液進行洗滌而從柱上再洗脫(圖3B)。隨后用6ml 5mM EDTA，20mMhepes，150mM NaCl，pH7.5和6ml 1M NaCl洗滌柱。為在因分離p12而過柱以后去除蛋白級分中的雜質，通過Western印跡技術檢測所述級分中的p12。所述級分中不能檢測到p12。
實施例8在通流方法中從BSA溶液去除內毒素HiTrap-NHS活化的瓊脂糖(Amersham Biosciences，Uppsala Sweden)根據產品說明通過伯胺基團與p12非特異性偶聯。由此共價固定了8mg p12/ml凝膠物質。由此獲得的1ml層析柱以1ml/min的流速用10ml緩沖液A(20mM hepes，pH7.5，150mM NaCl，0.1mM CaCl2)平衡。隨后，將4ml BSA溶液(11.5mg BSA(Carl Roth GmbH，Germany)/ml緩沖液A)加在柱上(injectionI)并將流出物(E)收集在2.5ml的級分中。隨后用15ml緩沖液A洗柱，并用7ml緩沖液B(20mM hepes，pH7.5，150mM NaCl，2mM EDTA)洗脫與柱結合的內毒素。在洗滌和洗脫過程中，分別收集2ml級分。每次實驗后，用20ml緩沖液C(20mM hepes，pH7.5，150mM NaCl，2mM EDTA，0.1％去氧膽酸鈉)再生柱。內毒素濃度通過生色鱟變形細胞溶解試驗(Chromogenic Limulus Amoebocyte Lysate)(LAL)(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)根據產品說明測定。通過測定UV吸收確定蛋白濃度。內毒素去除效率是95-99％且蛋白丟失為大約6-10％。
實施例9通過非特異偶聯的p12從緩沖液中去除小量內毒素20ml NHS-活化的瓊脂糖4FastFlow(Amersham Biosciences)首先用冰冷的鹽酸洗滌，然后和292mg p12(7mg/ml in 25mM citrate pH7.0)在室溫在攪動同時保溫4小時。隨后，使用7×80ml 5mM檸檬酸pH2.0洗滌瓊脂糖，并用5mM檸檬酸pH2.0透析1ml的各洗滌級分。通過測定這些透析物在280nm的吸收而定量洗滌級分中多余的p12。測定的流出物密度(charge density)為8.7mg p12每1ml瓊脂糖。非反應性NHS基團通過將瓊脂糖與1M tris pH8.0保溫12小時中和。體積為2ml的柱用這種柱物質填滿，并在4℃儲存在20％乙醇中備用。
在3次平行試驗中，分別將4ml內毒素溶液(S)加于柱上(見圖9)。所述內毒素溶液包含來自大腸桿菌O55B5(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)的內毒素(在平衡緩沖液(20mM hepes，150mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH7.5中)。該溶液的內毒素濃度是4.6EU/ml。
該柱首先用12ml再生緩沖液(20mM hepes，150mM NaCl，2mM EDTA，pH7.5)潤洗，然后用12ml平衡緩沖液潤洗。隨后，將平衡緩沖液再次導入柱中，并對1ml進行分級分離。
所述內毒素溶液加于柱(I)并收集5ml和2ml的級分。隨后，該柱用4ml再生緩沖液(B)再生。在流出級分中，沒有檢測到內毒素，即內毒素雜質能夠在所有三個實驗中完全去除。
實施例10生物素化p12與磁性鏈霉抗生物素珠的非特異性偶聯p12(3mg/ml，在PBS，0.05％Tween20中)和硫代-NHS-LC-LC-生物素(Pierce)，以1∶10-1∶20的比例在RT保溫1小時，并隨后用緩沖液(例如PBS或20mM hepes，150mM NaCl，5mM EDTA，pH7.5)透析。NHS-活化的生物素與p12的伯胺基團結合。隨后將50μl生物素化的p12(1mg/ml)加入1ml鏈霉抗生物素珠(MagPrep鏈霉抗生物素珠，Merck)，在室溫攪動2小時，并隨后通過用1.5ml 20mM tris，10mM EDTA，pH7.5洗滌四次去除多余的p12。
所述內毒素去除用緩沖液(20mM hepes，150mM NaCl，pH7.5)和蛋白溶液(0.1mg/ml BSA，0.1mg/ml溶菌酶，0.1mg/ml碳酸酐酶。20mM hepes，150mM NaCl中，pH7.5)檢測。向所述緩沖液和BSA以及溶菌酶溶液中摻入5EU/ml(內毒素，來自大腸桿菌O55B5，Charles-River Endosafe，Charleston，USA)。碳酸酐酶溶液含有大約1EU/ml。固定有p12的25μl磁性珠加入200μl緩沖液或蛋白溶液中，通過吸液管抽吸而混合，并在室溫保溫30分鐘。所述珠通過磁鐵從溶液中去除，并吸出殘余物。未經處理的樣品的內毒素含量以及與珠一同保溫的樣品的內毒素含量隨后通過LAL實驗測定，且通過測定280nm的吸收確定蛋白回收率。內毒素實際上可從緩沖液中完全去除(99.9％的內毒素被去除，圖4A)且內毒素也可從蛋白溶液去除70-92％(圖4B)。蛋白回收率為57％-99％(BSA87％，碳酸酐酶99％，溶菌酶57％；圖4B)。
實施例11生物素化的p12與固定的鏈霉抗生物素的非特異性偶聯p12(3mg/ml，PBS，0.05％Tween20中)與硫代-NHS-LC-LC-生物素(Pierce)，以1∶10-1∶20的比例在RT保溫1小時，并隨后用緩沖液(例如PBS或20mM hepes，150mM NaCl，5mM EDTA，pH7.5)透析。NHS-活化的生物素與p12的伯胺基團結合。隨后將生物素化的p12與帶有鏈霉抗生物素(ImmunoPure固定鏈霉抗生物素6％交聯瓊脂糖珠)的層析物質在室溫保溫1小時，并通過用PBS洗滌去除多余的p12。
所述內毒素去除用緩沖液(20mM hepes，150mM NaCl，pH7.5)和BSA(0.5mg/mlin 20mM tris，150mM NaCl，pH8.0)檢測。分別向1ml緩沖液或BSA溶液中摻入10EU/ml，并加入50μl p12瓊脂糖，并在室溫攪動1小時。隨后離心去除p12瓊脂糖，并測定殘余物中的內毒素和蛋白濃度。99％的內毒素可從緩沖液中去除，且86％的內毒素可從BSA溶液中去除(圖5)。BSA回收率達90％。
實施例12利用表面胞質團共振測定通過p12內毒素結合進行實驗。
p12與內毒素或與細菌通過細胞外膜的脂多糖的結合通過表面胞質團共振測定(Biacore J)。為測定解離常數(Kd)，來自大腸桿菌O55B5(Sigma)的內毒素根據產品說明固定在疏水HPA芯片上，并將p12以各種濃度注入(圖6A)。以相對“應答單位”(RU)測定結合，并將平衡值對結合的p12濃度作圖(圖6B)。將Langmuir吸收等溫線(RU＝(RUmax*[p12])/([p12]+Kd))用于這些數據，測定Kd值(表1)。無內毒素緩沖液用于測定。在pH值6-10之間測定的Kd值的范圍是10-7-10-9M(表1)。所述結合通過注入1mM或5mMEDTA破壞結合，并再生所述芯片。
表1p12上的內毒素的解離常數依賴溶液pH值
為檢測細菌與p12的結合，將生物素化的p12固定在鏈霉抗生物素芯片，并注入各種大腸桿菌菌株。所述細菌吸收在PBS中用于測定。使用具有不同多糖成分的脂多糖的大腸桿菌菌株。多糖部分包含與脂質A和所謂的“O”抗原交聯的“核心”區。所述“O”抗原在不同類型的細菌和不同菌株之間的差異很大，而“核心”區則高度保守。具有“核心”區和O抗原的菌株(例如大腸桿菌)，和具有完整“核心”區的菌株(例如大腸桿菌D21)與p12結合，而具有極大縮短的“核心”區的菌株(例如大腸桿菌D21f2)不能由p12檢測到(圖6C)。所述結合可以通過EDTA(5mM)破壞，且所述芯片可再生。
實施例13重組p12構建體1.構建具有N末端Strep-標記的p12(N-strep-p12)通過PCR，將用于Strep-標記(美國專利5,506,121)的核苷酸序列導入T4p12基因的5’末端。為此構建位于p12基因5’末端的引物(5′-GAA GGA ACT AGTCAT ATGGCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AATAAT ACA TAT CAA CAC GTT-3′(SEQ ID NO1)，其5’末端包含Strep-標記的核苷酸序列(序列中的斜體)，并具有限制性界面(NdeI，序列中加下劃線部分)，使得右手閱讀格(right-hand reading grid)中的基因可插入表達質粒。對于p12基因的3’末端，構建一種引物其可將BamHI限制性界面(序列中的斜體)導入p12基因之后(5′-ACG CGC AAA GCT TGT CGA CGG ATC CTATCA TTC TTT TAC CTT AAT TAT GTA GTT-3′)，(SEQ ID NO2)。PCR進行40個循環(1分鐘95℃，1分鐘45℃和1分鐘72℃)。PCR批次(batch)用限制性核內切酶NdeI和BamHI切斷，并且需要的片段通過瓊脂糖凝膠進行體積分級分離并從所述凝膠洗脫后，被插入表達質粒pET21a的NdeI和BamHI位點。通過DNA測序檢測N-strep-p12基因的序列的正確性。對質粒pNS-T4p12p57進一步的處理如Burda，M.R.& Miller，S.(Eur JBiochem.1999 265(2)，771-778)所述的對T4p12p57的處理進行。質粒pNS-T4p12p57隨后被轉化到表達菌株BL21(DE3)中。
2.將N-末端半胱氨酸基團插入N-strep-p12(N-strep-S3C-p12和N-strep-S14C-p12)N-末端半胱氨酸基團的插入如1所述進行，并為此構建兩種新的5’末端引物、用于N-strep-S3C-p12的引物是5′-GAA GGA ACTAGTCAT ATGGCT TGT TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGCGCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3′(SEQ ID NO3)，用于N-strep-S14C-p12的引物是5′-GAA GGA ACT AGTCAT ATGGCT AGC TGGAGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC TGT AAT AAT ACA TATCAA CAC GTT-3′(SEQ ID NO4)。
3.純化N-strep-p12蛋白在37℃，從2升的搖瓶培養物(LB培養基，添加氨芐西林100μg/ml)中取出OD600達0.5-0.7的具有質粒pNS-T4p12p57的大腸桿菌菌株BL21(DE3)，并通過加入1mM IPTG(異丙基-β-硫代-吡喃半乳糖)誘導N-strep-p12-蛋白的表達。在37℃保溫4h后，收集細胞。從10升培養物收集的細胞在50ml磷酸鈉，20mM pH7.2，2mM MgSO4，0.1MNaCl中被吸收，通過French press處理(20,000psi)三次進行破壞，隨后在15,000rpm離心30分鐘(SS34)。在相同的緩沖液中洗滌2次后，N-strep-p12蛋白從沉淀中提取，通過在40mM trisHCl pH8.0，10mM EDTA中攪動30分鐘提取沉淀，并以15,000rpm(SS34)離心該批次(batch)30分鐘，溶解的NS-p12于4℃保存在殘余物中。提取重復兩次，并將結合的殘余物(IBAGmbH Gttingen)加樣到StrepTactin親合柱上(15ml)，用緩沖液“W”(100mM trisHCl pH8，1mM EDTA，150mM NaCl)平衡。用5倍柱體積的緩沖液“W”，洗滌后，用三倍體積的緩沖液“W”(緩沖液“W”含2.5mM的去硫生物素)進行洗脫。多次用緩沖液“W”透析和濃縮后，N-strep-T4p12的濃度和純度通過SDS-PAGE和UV光譜(Burda等1999)測定。從10升培養物中，可純化大約100mg N-strep-T4p12。
序列表<110>普羅福斯股份公司(PROFOS AG)<120>檢測和去除內毒素的方法<130>PRO-008 PCT/nat.
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<223>引物<400>1gaaggaacta gtcatatggc tagctggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgccagtaat60aatacatatc aacacgtt 78<210>2<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>靶向生物素化的標簽<400>7Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Cys Asn Asn1 5 10 15Thr Tyr Gln<210>8<211>539
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>攜帶靶向生物素化的標簽的P12<400>8Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn1 5 10 15Thr Tyr Gln His Val Ser Asn Glu Ser Arg Tyr Val Lys Phe Asp Pro20 25 30Thr Asp Thr Asn Phe Pro Pro Glu Ile Thr Asp Val Gln Ala Ala Ile35 40 45Ala Ala Ile Ser Pro Ala Gly Val Asn Gly Val Pro Asp Ala Ser Ser50 55 60Thr Thr Lys Gly Ile Leu Phe Leu Ala Thr Glu Gln Glu Val Ile Asp65 70 75 80Gly Thr Asn Asn Thr Lys Ala Val Thr Pro Ala Thr Leu Ala Thr Arg85 90 95Leu Ser Tyr Pro Asn Ala Thr Glu Ala Val Tyr Gly Leu Thr Arg Tyr100 105 110Ser Thr Asp Asp Glu Ala Ile Ala Gly Val Asn Asn Glu Ser Ser Ile115 120 125Thr Pro Ala Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Asn Val Phe Glu Thr Arg130 135 140Val Ser Thr Glu Ser Ser Ash Gly Val Ile Lys Ile Ser Ser Leu Pro145 150 155 160Gln Ala Leu Ala Gly Ala Asp Asp Thr Thr Ala Met Thr Pro Leu Lys165 170 175Thr Gln Gln Leu Ala Val Lys Leu Ile Ala Gln Ile Ala Pro Ser Lys180 185 190Asn Ala Ala Thr Glu Ser Glu Gln Gly Val Ile Gln Leu Ala Thr Val195 200 205Ala Gln Ala Arg Gln Gly Thr Leu Arg Glu Gly Tyr Ala Ile Ser Pro210 215 220Tyr Thr Phe Met Asn Ser Thr Ala Thr Glu Glu Tyr Lys Gly Val Ile225 230 235 240Lys Leu Gly Thr Gln Ser Glu Val Asn Ser Asn Asn Ala Ser Val Ala245 250 255Val Thr Gly Ala Thr Leu Asn Gly Arg Gly Ser Thr Thr Ser Met Arg260 265 270Gly Val Val Lys Leu Thr Thr Thr Ala Gly Ser Gln Ser Gly Gly Asp275 280 285Ala Ser Ser Ala Leu Ala Trp Asn Ala Asp Val Ile Hi s Gln Arg Gly290 295 300
Gly Gln Thr Ile Asn Gly Thr Leu Arg Ile Asn Asn Thr Leu Thr Ile305 310 315 320Ala Ser Gly Gly Ala Asn Ile Thr Gly Thr Val Asn Met Thr Gly Gly325 330 335Tyr Ile Gln Gly Lys Arg Val Val Thr Gln Asn Glu Ile Asp Arg Thr340 345 350Ile Pro Val Gly Ala Ile Met Met Trp Ala Ala Asp Ser Leu Pro Ser355 360 365Asp Ala Trp Arg Phe Cys His Gly Gly Thr Val Ser Ala Ser Asp Cys370 375 380Pro Leu Tyr Ala Ser Arg Ile Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ser Ser Ser385 390 395 400Asn Pro Gly Leu Pro Asp Met Arg Gly Leu Phe Val Arg Gly Ser Gly405 410 415Arg Gly Ser His Leu Thr Asn Pro Asn Val Asn Gly Asn Asp Gln Phe420 425 430Gly Lys Pro Arg Leu Gly Val Gly Cys Thr Gly Gly Tyr Val Gly Glu435 440 445Val Gln Lys Gln Gln Met Ser Tyr His Lys His Ala Gly Gly Phe Gly450 455 460Glu Tyr Asp Asp Ser Gly Ala Phe Gly Asn Thr Arg Arg Ser Asn Phe465 470 475 480Val Gly Thr Arg Lys Gly Leu Asp Trp Asp Asn Arg Ser Tyr Phe Thr485 490 495Asn Asp Gly Tyr Glu Ile Asp Pro Ala Ser Gln Arg Asn Ser Arg Tyr500 505 510Thr Leu Asn Arg Pro Glu Leu Ile Gly Asn Glu Thr Arg Pro Trp Asn515 520 525Ile Ser Leu Asn Tyr Ile Ile Lys Val Lys Glu530 53權利要求
1.檢測內毒素的方法，包括以下步驟a)用噬菌體尾蛋白與樣品溫育，b)檢測與噬菌體尾蛋白結合的內毒素。
2.權利要求1的方法，如必要在a)后和步驟b)前還包含額外的步驟a′)從樣品中分離噬菌體尾蛋白-內毒素復合物。
3.權利要求1-3之一的方法，其中所述檢測通過光譜方法實現。
4.從樣品中去除內毒素的方法，包括以下步驟a)將樣品與非特異性或定向地固定在永久載體上的噬菌體尾蛋白共同溫育或使二者接觸，b)從樣品中分離噬菌體尾蛋白-內毒素復合物。
5.權利要求4的方法，其中步驟a)和b)在層析柱通流法中實現。
6.權利要求4的方法，其中所述永久載體是過濾介質，玻璃顆粒，磁性顆粒，離心物質，沉淀物質，或用于層析柱的填充物質。
7.權利要求4-6之一的方法，其中所述噬菌體尾蛋白通過偶聯基團固定在永久載體上。
8.權利要求7的方法，所述偶聯基團是凝集素，受體或anticalin。
9.權利要求7的方法，所述偶聯基團是鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白且所述噬菌體尾蛋白與生物素或Strep-標記偶聯。
10.權利要求4-6之一的方法，其中所述噬菌體尾蛋白通過共價化學鍵固定在永久載體上。
11.權利要求1-10之一的方法，其中所述噬菌體尾蛋白具有Strep-標記或His-標記。
12.權利要求11的方法，其中所述標記具有SEQ ID NO.5，6或7所示的氨基酸序列。
13.要求11或12的方法，其中噬菌體T4的p12蛋白用作噬菌體尾蛋白。
14.權利要求1-13之一的方法，其中所述溫育中的Ca2+濃度為0.1μM-10mM且Mg2+濃度為0.1μM-10mM。
15.權利要求1-3之一的方法，其中所述標記的內毒素從與噬菌體尾蛋白的結合中置換出來，且隨后檢測所述標記的內毒素。
全文摘要
本發明涉及檢測內毒素的方法，包括用噬菌體尾蛋白與樣品溫育，檢測與噬菌體尾蛋白結合的內毒素，其中所述檢測通過光譜方法實現。本發明還涉及從樣品中去除內毒素的方法，包括將樣品與非特異性或定向固定在永久載體上的噬菌體尾蛋白共同溫育或使其接觸，從樣品中分離噬菌體尾蛋白－內毒素復合物。
文檔編號B01J20/24GK1662816SQ03814573
公開日2005年8月31日 申請日期2003年6月24日 優先權日2002年6月24日
發明者邁克爾·許茨, 羅曼·邁耶, 霍爾格·格拉勒特, 斯蒂芬·米勒 申請人:普羅福斯股份公司