從很少活動的顆粒中分選出活動顆粒的方法以及適合該方法的裝置的制作方法

專利名稱：從很少活動的顆粒中分選出活動顆粒的方法以及適合該方法的裝置的制作方法
相關申請的交叉引用本申請要求2002年2月27日提出的美國臨時申請順序號60/359844的權利。
背景技術：
1、發明領域本發明涉及從很少活動的顆粒，特別是生物來源的活動和不活動顆粒中分選出活動顆粒的方法，并涉及適合于此的裝置。
2、背景技術從很少活動和/或不活動的顆粒中分離或“分選”出活動顆粒有許多應用，但迄今仍存在技術上的困難。例如，在水供應品的分析中，也許希望將活動的細菌和其他微生物，包括真菌、藻類等從不活動的細菌和微生物中分離出來。從而可對不同物種進行識別和計數。活動的有機體的實例包括諸如C.elegans的有鞭毛的和有纖毛的細菌，以及諸如草履蟲和活動的浮游生物的其他微生物。富含活動物種的試樣或缺乏活動物種的試樣，或這兩種試樣，都可以獨立地進行分析、培養等。
一種特別明顯的應用是精子細胞的分選。例如，在玻璃試管內受精的情況下，如果供體的精子數少，特別是如果被不活動的精子、活動性比要求的活精子差的變形精子，以及其他細胞和精液碎片污染，當基本上用活精子進行受精嘗試時，成功率將明顯提高。例如，特別理想的是避免anueploid精子或DNA斷裂的精子。在許多努力中，理想的是能引導后代的性別，例如當希望出生奶牛時。在這種情況下，能基于含有X染色體和Y染色體的精子公知的活動性差異對它們進行分選將是有益的。
來自精子缺乏(低精子數)的供體的精子細胞已預先濃縮，并在某種程度上通過離心分離從具有不同尺寸和/或密度的細胞和碎片中分離。然而，這項技術允許將非配子摻入富精子試樣中。然而這些非配子盡管非常少，但它們釋放的氧自由基會有害于延續的精子生命力。而且離心分離是一項強力技術，會損壞大部分精子數，特別是在中部和尾部區域。
所謂的“飄浮”技術也是公知的，但分離大部分活精子是富有挑戰性的。S.Smith等，FERTIL.STERIL.1995，63，591-97。因此醫生頻繁地藉助從死精子和碎片中手工分選，以發現活動的和具有特殊形態的精子，這是一種非常耗時的方法。
在生物遺傳學(生物技術)中的應用也頻繁要求基于顆粒的活動性來分離顆粒。在非生物學應用中，將工作的微型機器人(它們是活動的)從不工作的微型機器人中分離是一種可能的應用。
發明概述活動和不活動或很少活動的顆粒的分選通過這樣的方法實現，即建立含有待分選的活動和不活動或很少活動的顆粒的非湍流和優選的層流物流(“分選物流”)，并使該分選物流與第二非湍流和優選的共層流介質物流(“介質物流”)接觸，為至少部分富活動顆粒的介質物流提供一個出口物流，并為乏活動顆粒的分選物流提供一個出口物流。活動顆粒的可流動性使它們沿介質與分選物流間的界面進入介質物流中，而不活動或很少活動的顆粒基本上保留在分選物流中。適合用于該方法的裝置提供至少一個分選物流入口、至少一個介質物流入口、至少一個分選通道、至少一個乏活動顆粒的分選物流出口，和至少一個富活動顆粒的介質物流出口。該裝置優選的是通過微細加工或聚合物注模技術制備的較小裝置，并優選包含集成在單個“芯片”上的所有需要的功能。
附圖簡述

圖1表示本發明的活動顆粒分選裝置的一個簡單實施方式；圖2表示在圖1裝置的分選通道中將活動顆粒與不活動顆粒分選；圖3表示串連分選裝置的一個實施方式；圖4表示具有多個介質入口的分選裝置的又一個實施方式；
圖5表示根據本發明分選裝置的又一個實施方式的示意圖；圖6表示根據本發明分選裝置的又一個實施方式的示意圖；圖7表示類似圖1的裝置的透視圖；和圖8表示類似圖1的裝置在精子分選上的分選效率。
優選實施方式詳細描述本發明的描述可通過參照圖1和圖2進行，圖1代表了可用于實現本發明目的的裝置的一個相對簡單的實施方式，圖2表示從不活動顆粒分選出活動顆粒。在這些描述后面，將更具體地解釋該裝置、其幾何形狀、流體和流體流動的特性等的其他詳細功能。
圖1的裝置以平面示意圖，即頂視圖形式表示。裝置1實施方式由一個活動顆粒分選物流入口2(或起入口作用的活動顆粒供給庫)、一個介質物流入口3(或介質庫)、一個乏活動顆粒分選物流出口(或庫)4，以及一個富活動顆粒物流出口(或庫)5組成。在入口2和3與出口4和5之間設置了分選通道6。連接分選通道6和相應入口和出口的是分選物流入口通道7、介質物流入口通道8、乏活動顆粒分選物流出口通道9和富活動顆粒介質物流出口通道10。分選物流通道的寬度必須足夠大，使感興趣的顆粒毫無阻擋地有效通過，兩個出口物流也是如此。入口物流和出口物流通常將具有小于分選通道的截面積。相對截面將取決于不同物流的流量和流速。線性流速優選地相似，盡管相對流速僅受到分選物流與介質物流之間發生的混和限制。根據諸如介質和分選物流的粘度、顆粒的活動性，以及存在或不存在與希望的待分選顆粒不同尺寸的顆粒或碎片的許多因素，介質物流的體積可在分選通道的任何截面上小于、基本上等于或大于分選物流的體積。
以下說明書的大部分都是關于精子分選的描述，但同樣的原理可應用在其他活動和不活動的顆粒來源上。
在操作中，將精子源引入分選物流入口2中，并使其流向乏活動顆粒分選物流出口9，先通過通道7，然后通過分選通道6，最后到出口通道9。將與待分選精子相容的(即沒有危害的)介質供應物流引入介質物流入口3，并使其流過通道8，進入分選通道6，通過通道10，進入富活動顆粒介質出口5。在通道7和8的匯流處，產生了不混和的，優選層流的流動，使得分選物流和介質物流平行通過分選通道。不活動(或很少活動)顆粒往往保留在分選物流中，而活動顆粒無規地運動并進入介質物流。這種無規運動的結果使分選物流變得缺乏活動精子，而介質物流中的活動精子變得日益富足。
本發明可進一步參考圖2a、2b和2c大致地描述，它們圖解說明了在圖1裝置的分選通道中，活動精子與不活動精子和其它不活動顆粒分開。在圖2a中，示出了分選通道6，從分選物流11和介質物流12的匯流點開始。分選物流11含有活動精子13和不活動精子14，以及其他不活動顆粒，此處稱為“圓顆粒”15。注意介質物流的平面尺寸，因此其容積比分選物流大得多。由于精子(以及類似地，其他活動顆粒)在短時間內，在總的液體中假定基本上是無規分布，將需要較大的介質物流容積來包含較大部分的總活動精子13。
在圖2b中，活動精子開始在兩股物流間無規化，并繼續到實現希望的無規化程度。這種無規化程度優選的是使單位容積介質相中活動精子的濃度等于或大于單位容積分選物流中的濃度。注意分選物流和介質物流仍保持為分開的物流，每股物流優選表現出層流，并具有共同邊界或界面16。在介質物流中超過由純無規化確定的量的活動顆粒的較大濃度可通過采用其中活動顆粒的活動性已提高的介質物流，即通過選擇粘度低于分選物流的介質物流，或通過包括提高活動精子相對于不活動或很很少活動的精子的活動性的添加劑來實現。
在圖2c中，富活動精子的介質物流通過使其轉向流入富活動顆粒的通道10中收集，而現在缺乏活動顆粒的分選物流仍繼續通過通道9進入出口4。
將乏活動顆粒分選物流從富活動顆粒物流分開的轉向接合點17可以是避免流體在該點處實質混和的任何幾何形狀。接合點17可以定位成例如在該點處提供基本上相同的分選物流入口的出口通道構造(即高度、寬度)。為了使不活動精子對介質物流的污染降至最低，接合點17也可以構造成使小部分介質物流也朝向乏活動顆粒分選物流出口9。在這種情況下，會發生活動精子的適度損失，然而，作為結果也降低了不活動精子進入富活動精子介質物流的可能性。
分選物流的性質并不關鍵。該分選物流可以是諸如精液的生物學派生流體，或可以清洗、稀釋，可以用添加劑、著色劑或熒光染料、粘度改性劑處理，可以緩沖等，只要這種處理不破壞所需出口物流(乏活動顆粒或富活動顆粒)的生命力。如果目的是分離而不是生命力，例如對于細菌試樣，對分選物流的潛在改性數就增加。分選物流也可以是預先的乏活動顆粒分選物流或富活動顆粒介質物流。對于微型機器人裝置，分選物流液體可以是不破壞該裝置功能的任何液體，例如水、醇、酮、二元醇、酯、烴等。對于生物試樣，常用水基分選物流。
介質物流可根據應用在分選物流的選擇或改性上的相同考慮來選擇。在某些情況下，分選物流可以是水，但對于生物體系典型的是采用保持或增強生物活性的物流，例如生理鹽水、緩沖鹽水、營養肉湯等。在人類精子情況下，優選的介質是HEPES緩沖的人類輸卵管流體。
如果可能的話，可選擇介質流體和分選流體的性質，以避免由于滲透效應產生的界面混和。例如當分選和介質物流二者的基礎流體(例如水)具有基本上相同數量的諸如鹽、酸、堿、緩沖液、溶解的有機材料等的可溶性成分時就是這種情況。如果有可能，也可以這樣選擇流體，以避免由擴散引起的界面混和。然而，完全不存在任何擴散在這方面并不是好事。
相對流體容積可根據活動顆粒在介質相中期望的摻入程度來選擇。對于最高的摻入程度，介質容積應比分選流體容積大。然而，也可以采用按比例縮小的介質容積，特別是當進行相繼的(系列的)分選時。所用介質流體與分選流體的比例優選為1∶1000-1000∶1，更優選1∶100-100∶1，最優選在1∶10-10∶1范圍內。對于典型的應用，介質容積與分選流體容積的比例在1∶1-3∶1范圍內。最優選的是介質流體容積大于分選流體容積。
此處所稱容積是在分選通道的給定截面處的容積。例如，尺寸為100μm×200μm的長方形分選通道將具有2×104μm2的“橫向容積”。該“橫向容積”，實際上是截面積，可通過乘以通道長度或其增量轉化成真實的容積。這樣，前文描述的具有2×104μm2的橫向容積的同樣的長方形通道在100μm長度上將具有2×106μm3的真實容積。
分選流體和介質流體的層流流速優選大致相同，即在1.5∶1-1∶1.5的流速范圍內。如果介質流體的層流流速大于分選流體，對于相同的活動顆粒摻和程度，可采用相應小的橫向容積的介質流體。流動優選是并流，盡管逆流流動也可以，條件是界面混和不會因此加重而超過有助于期望的分選和介質流體的貧乏/富余程度的程度。
分選流體與介質流體之間的界面優選是基本上不混和的界面。“不混和”指不存在由于兩股流體之間過度擾動發生的混和。例如，最理想的是發生平行流、并流、層流流動，以便獲得基本上好像“靜態”的界面，與表現出波動、流動、渦旋等的界面相反。湍流通常導致物流的部分至全部混和，使活動顆粒的貧乏/富余更低效或甚至完全不可能。當在僅由于分散和滲透作用發生界面混和的地方產生靜止狀界面或“流線”時，才會發生理論上最佳的活動顆粒的分離。然而，允許沿界面有某些湍流也不會超出本發明的范圍。當不能獲得期望的分離程度時，湍流就過度了，即使對于多級裝置也如此。用雷諾數表達的湍流度在任何情況下都應小于2000，更優選小于100，還更優選小于10，最優選為1或更小。諸如由本說明書實施例描述的高性能裝置表現出約0.1的雷諾數。
界面的特性，即其湍流度，可通過分離度評價。然而，湍流也可用許多其他方式評價。例如，在下文描述的PDMS裝置中，該裝置的透光性使界面本身可例如通過對一種或兩種流體著色，并通過界面處顏色的變化觀察界面，從而用顯微鏡觀察。通過傳統的光學技術，也很容易觀察折射率不同的介質之間的界面。分離物流與介質物流的混和程度也可以通過將標記劑(taggant)，即放射性可溶解化合物或不活動顆粒、可視染料或熒光染料等引入一股物流但不引入另一股物流中來監測。開始不含標記劑的物流的出口物流中標記劑的外觀提供了湍流類型的，或由擴散或滲透引起的界面混和的證據。希望由于后兩種作用而產生某些摻和，但也希望這種摻和相當小。標記劑在未標記的流體中有50％的摻和就基本上構成了完全混和。希望標記劑在未標記物流中的混和小于20％，優選的小于10％，更優選的小于5％，最優選的小于1％。只要雷諾數保持合理的低，湍流度就是滿意的。滿足以上準則的流動在這里稱為“基本上非湍流的流動”。注意并流物流表現出比逆流物流更少的湍流，從而界面混和也更少。
假定流體的流速滿足剛才描述的非湍流要求，流速本身可大大變化。分離裝置內壁也會產生湍流的可能性，因為它們相對于流體流動是靜止的。內壁的作用在采用窄通道時將是最重要的，尤其是緊鄰分離物流或介質物流最窄處的內壁。由于感興趣的裝置很小并具有很小的通道，因此優選的線性流速小于10cm/s，優選小于10mm/s。尤其優選的是0.1mm/s-10mm/s之間的流速。線性流速的下限值由不活動顆粒通過布朗運動從分選物流進入介質物流的混和決定。例如，當流速為0時，對于相同的基本流體組分(例如緩沖鹽水)，不活動顆粒在介質相中的分配將經過使它們的濃度變成一樣所需的時間才能最終完成。流速越高，不活動顆粒的布朗再分配將發生得越少。當界面流動變成湍流時，達到流速的上限，就像高混和程度所表現的那樣。
本領域普通技術人員通過對分離進行簡單的計算和/或測量，例如通過改變相應的流速和流量，并測定分選物流和介質物流之間顆粒的相對富足和貧乏，可常規地完成對任何給定物流的相對流量、相對流速和絕對流速的確定。
該裝置的幾何形狀可以不同。例如分選通道長度通常是活動顆粒本身在兩相之間無規化的速度與流速的函數。例如，在給定流速下，具有有限的活動性的活動顆粒需要較長的分選通道，而在給定分選通道長度下，較少的活動顆粒需要較低的流速。界面表面積也影響該裝置的幾何形狀。例如，一股流體與較大尺寸的通道面緊鄰并平行設置，并與其他流體相鄰的平坦矩形分選通道將表現出比第一股流體與較小尺寸通道面緊鄰并平行設置時的相同通道更快的無規化，因此需要的分選通道長度更短。在后一種情況下，界面面積與前者比較要小得多。
盡管理論上有可能構建宏觀尺度的，長度甚至大于10cm的裝置，但對于大部分用途而言，分選通道都相當短，在幾乎所有情況下都小于2-5cm，對于大部分裝置均在100μm-1cm范圍內。例如對于精子分選，已證明分選通道長度為5000μm(5mm)就相當滿意。在多級裝置中，理想的是較短的分選通道長度。
分選通道的截面形狀并不關鍵。可采用方形、矩形、橢圓形、圓形、梯形、三角形或其他截面。為了容易制造，優選的是諸如方形、矩形、三角形、梯形和半圓形或半橢圓形截面的非下切通道。例如當采用平滑鑄造或溶液鑄造的構造方法時，這些形狀是優選的。在通過立體平版印刷技術(“SLA”)構建的情況下，更復雜的形狀都很容易建造。當該裝置以連續多層鑄造，然后通過例如粘合附著在一起時，也可以通過鑄造技術提供具有下切通道的復雜形狀。然而，通道寬度必須使介質物流和分選物流都能摻入顆粒。例如對于人類精子分選，高度50μm、寬度500μm的大致矩形的通道以證明是滿意的。為了對照，人類精子具有直徑約2.5μm和長約5μm的頭，和約60μm的總長度。
進料通道和出料通道的截面積及尺寸通常都小于分選通道。分選物流入口通道的最小尺寸由分選物流中存在的顆粒尺寸決定。優選的是分選物流通道提供其中預計包含的顆粒尺寸的3到10倍的自由通道。同樣的考慮用于介質物流出口通道的尺寸，但介質物流入口通道不必這樣考慮。優選的是分選物流入口和出口通道具有類似的尺寸，盡管在某些例子中，例如前文描述的，理想的是出口通道大于入口，從而使部分介質物流摻入分選物流中。對于精子分選，50μm高、100μm寬和5000μm長的矩形分選物流入口通道已證明是滿意的。
不同入口和出口通道的長度并不關鍵。優選的是至少入口通道具有一定的基本長度，以促使在分選物流和介質物流通道的匯合點之前形成層流物流。一般而言，高粘度流體所需通道長度不象低粘度流體那么長。在某些情況下，入口通道可以完全省去，即分選物流入口(或儲罐)和/或介質物流入口(或儲罐)可直接指向分選通道。然而對于大部分用途而言，為了利用分選裝置的結構，優選的是采用入口通道。對于例如下文描述的精子分選裝置，約3mm長的入口通道已證明是滿意的。
分選和介質物流的匯合的接點18(圖1)優選地構建成能促使流體物流的光滑融合但不過分混和。因此該接點一般是較小的銳角。分選物流入口通道與分選通道間的夾角和介質物流入口通道與分選通道間的夾角可以相同或不同，即該裝置不必對稱。同樣的考慮用于分選物流與介質物流分離，或相互“轉換”處的接點17。然而優選的是分選物流入口通道、分選通道和分選物流出口通道基本上是直線，以提供分選物流中不活動顆粒的盡可能小的擾動。
分選裝置結構的材料可以是任何合適的材料，且該裝置的制造可涉及任何制造方法。例如，該裝置可通過玻璃、二氧化硅、硅、金屬的蝕刻，或通過聚合物的溶液蝕刻等進行化學微細加工。該裝置也可通過公知的立體平版印刷技術單獨制造。該裝置可通過可注模聚合物，例如硅橡膠、熱塑性聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙稀、聚偏二氯乙稀、聚酰胺、聚酯等的注模獲得。
目前優選的是通過提供一種負性的“靠模”，并用該靠模鑄造可澆鑄材料來鑄造該分選裝置。優選的可澆鑄材料是聚合物，包括環氧樹脂、可固化聚氨酯彈性體、聚合物溶液，即丙烯酸酯聚合物在二氯甲烷或其他溶劑中的溶液，和由于成本原因，優選可固化聚有機硅氧烷，最優選主要帶有甲基的聚有機硅氧烷，例如聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)。可固化PDMS聚合物是公知的，可從許多途徑獲得。可采用可加成固化和可縮合固化的體系，還有過氧化物固化的體系。所有這些PDMS聚合物都帶有少部分的反應性基團，這些基團在固化期間反應形成交聯和/或引起鏈伸長。單部(RTV-1)和雙部(RTV-2)體系都可利用。當主要是生物顆粒活動性時，優選的是可加成固化體系。
在許多例子中，理想的是透明的裝置。這種裝置可由玻璃或透明聚合物制成。PDMS聚合物很適合于透明裝置。采用略具彈性的聚合物的一個好處是它很容易與模具脫開，并有提供下切通道的潛力，而這對于硬而脆的材料一般是不可能的。通過模壓硅聚合物制造微觀流體裝置的方法是公知的。參見例如D.C.Duffy等的“Rapid Prototyping ofMicrofluidic Systems in Poly(dimethisiloxane)”，ANALYTICAL，CHEMISTRY70，4974-4984(1998)。還參見J.R.Anderson等的ANALYTICAL，CHEMISTRY72，3158-64(2000)；和M.A.Under等的SCIENCE 288，113-16(2000)。
該裝置的通道和儲罐內壁的性質可根據該裝置的應用和其中想用的流體選擇。例如，內壁可以是疏水或親水的，或某部分裝置可以是疏水的，而其他部分是親水的。此外，可用生物相容的或生物活性的涂料處理或衍生內壁，對內壁表面改性，或提供化學官能度。對于精子分選，用牛血清白蛋白(BSA)涂覆通道在改善通道中液體的流動，并使通道內壁對細胞的非特定吸收最小方面已證明是有益的。
流體可通過任何合適的方法送入裝置的入口或入口通道。流體可從例如注射器中，從與入口通道連接或粘連的微管等供給。在優選的裝置中，分選物流入口和介質物流入口是能保持和供應必要量的液體的“on-chip”儲罐形式。這些儲罐可通過注射器、移液管等充注。
流體流動可通過任何合適方法建立。例如，可利用適于抽吸少量液體的外部微型泵。微型泵也可在裝置本身中提供，由熱梯度、磁場和/或電場、施加壓力等驅動。所有這些裝置都是本領域普通技術人員公知的。被動驅動抽吸系統和微觀流體通道的整合已由B.H.Weigl等在PROCEEDINGS OF MICROTAS 2000，Enshede，荷蘭，pp.299-302(2000)中提出。
然而優選的流體流動通過重力流泵、通過毛細管作用或通過這些方法的結合建立。簡單的重力流泵由對于該裝置是外部的或內部的流體儲罐組成，這些儲罐含有比對應的裝置出口更高液位(在引力方面)的流體。這種重力泵有一個缺點，就是靜壓頭隨著儲罐中液體的高度降低而變化，從而使流速變化。對于許多裝置，希望有相對恒定和不脈動的流速。
為了獲得恒定流速，可采用已公布的PCT申請No.WO03/008102 A1(2002年1月18日)中公開的重力驅動泵，此處參考引用該文件。在這種裝置中，采用水平的儲罐，其中的流體水平流動，通過表面張力和液體與儲罐壁間的毛細力，避免儲罐中的垂直塌陷。由于液面高度保持恒定，靜壓頭就不會改變。
也可通過毛細力誘導流動。在這種情況下，與相關的入口通道或儲罐中的毛細力比較，在對應的出口通道或儲罐中的液體將表現出更高的對于其通道或儲罐壁的毛細力。這種毛細力差異可通過多種方法產生。例如，出口和入口通道或儲罐的內壁可具有不同的疏水性或親水性。作為選擇和優選的是使出口通道或儲罐的截面積更小，從而表現出更大的毛細力。
最優選的是采用起到恒定流速重力驅動泵作用，也表現出入口與出口間毛細力的差異的集成的機載(on-board)儲罐。這種裝置中的流動可在該裝置充滿液體時，或當截止閥或塞子打開時馬上開始，或可以最初由入口與出口間的壓差，例如通過向出口短暫施加吸力輔助開始。
可用許多方式連接多級裝置進行復雜的分離，以增強生產率，提高分離率(分選效率)或它們的任何結合。此外，可采用多級分選物流和/或介質物流。當采用多級分選或介質物流時，分選物流可以相同或不同，介質物流也可以相同或不同。
為了提高效率，例如諸如圖1中表示的一個裝置的乏活動顆粒分選物流出口可與第二裝置的分選入口連接，該第二裝置也具有介質供應。作為這種與兩股介質物流順次接觸的結果，分選物流將進一步缺乏活動顆粒。可將來自兩個裝置的富活動顆粒流結合。以這種方式采用幾個連續級能實際上回收100％的活動顆粒。優選的是當采用多級裝置時，它們在具有集中連接通道的同一結構上制成。這種裝置的一種示意性地示于圖3中。
在圖3中，串連構造的兩級活動顆粒分選器由通過分選物流通道21與第一分選通道22連接的單個分選流體儲罐20構成。第一級還由第一介質供應儲罐23、介質物流通道24、富活動顆粒第一介質通道25和富活動顆粒第一介質儲罐26組成。乏活動顆粒分選出口物流從第一級流過連接通道27，作為第二級分選通道28的分選物流入口。第二介質儲罐29通過介質入口通道30向第二級分選通道提供介質。進一步缺乏活動顆粒的分選流體離開該裝置，通過通道31進入乏活動顆粒分選物流儲罐32中，同時富活動顆粒介質流體的第二股流體離開分選通道，通過介質出口通道33進入儲罐34。兩個富活動顆粒介質儲罐26、34可非必須地通過帶閥門的通道連接到公共的出口通道或儲罐，或可以人工排空，例如用注射器或移液管，如果需要，可將它們的內容物混和。
另外的裝置示于圖4、5和6。在圖4的裝置中，兩個介質供應儲罐41向裝置40提供介質流體，富活動顆粒介質收集在兩個介質出口儲罐42中。單個分選流體儲罐提供來自分選流體儲罐43的含有活動和不活動顆粒的流體，而乏活動顆粒分選流體在穿過分選通道44后收集在分選流體出口儲罐45中。在這種情況下，中心分選物流46的兩側與介質物流47相接。
圖5和6是依靠改變不同流動路徑的連接來改善分選方法的一個或幾個方面的多級裝置的示意圖。在這兩個附圖中，雙線代表分選通道。圖5的裝置不僅能從不活動顆粒分選出活動顆粒，還能分選成不同活動性的部分，并具有三個分選通道。圖6的裝置將單個分選通道的出口分裂成幾部分，離分選物流最遠的出口包含更高比例的最高活動性的顆粒。可見本裝置能簡單地或很復雜地構造。裝置也可以按平行、串連平行或其他模式運行。平行方法對于分選較大的試樣，或測量與不同介質流體比較的分選效率等是理想的。當在單個裝置中進行測量時，這種比較在統計學上更準確。
盡管此處的大部分描述均指活動顆粒從不活動顆粒的分離，本發明的方法和裝置也適于分離不同活動性的活動顆粒。最活動的顆粒將以高于很少活動性顆粒的速度進入介質物流。在分選通道中的停留時間的選擇優選地應使大部分活動顆粒在總流體中呈現出無規的或近乎無規的分布。然而與從完全不活動顆粒分離出活動顆粒的情況相反，此時可忍受多余的分選通道長度，且不活動顆粒在介質物流中的分布基本上僅僅是由于布朗運動和湍流等的影響，當分離活動顆粒和很少活動顆粒時，很少活動顆粒在足夠時間后也能呈現出不規則分布。分選通道長度必須向下調節到使這種現象不會發生。介質物流將富含活動顆粒和很少活動顆粒，但應相應地更多富含較大活動性的顆粒。第一介質物流(起到下一級的分選物流的作用)的多級連續處理將導致不同活動顆粒間更高的分解度。分選物流的第二級和又一級分選以及它們以類似方式進行的隨后處理將提高產率。
實施例1用前文提及的D.C.Duffy等描述的柔軟平版印刷技術，由DowCorning SYLGARD184可固化硅樹脂制備微觀流體精子分選裝置。將可固化的PDMS在具有要求的作為突起的儲罐和通道特征的靠模上鑄造。將該鑄件PDMS分選裝置進行等離子體氧化，用玻璃蓋板密封該鑄件的開口通道側。用來自Sigma的、溶解在來自InvitrogenCorporation的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的1％牛血清白蛋白餾分V涂覆通道和儲罐。整個裝置約6mm厚，不包括蓋板，比美國便士硬幣略厚。該裝置的透視圖示于圖7。
在圖7中，PDMS鑄件是透明的，僅示出儲罐和通道。蓋板與裝置的底面粘結。標記號與圖1相同。通道截面為矩形，通道高度為50μm，而儲罐為大致半圓形。入口儲罐2和3均約3mm高，而出口儲罐約2mm高。入口和出口通道7、8、9、10約5000μm長。精子入口通道7和乏活動精子出口通道9的寬度為100μm，而介質入口通道8和出口通道10的寬度約300μm。分選通道6具有500μm的寬度和5000μm的長度。
精液試樣根據Review Board學會的批準從受到不育性評價的男性獲得。分選測試用洗凈的精液試樣進行。按所列順序將60μL處理介質加入介質入口儲罐中，將50μL洗凈的精液試樣加入試樣入口儲罐，將2μL介質加入每個出口儲罐中。在計算精子分選產率時要考慮這些稀釋因素。活動精子數由Makler Counting Chamber(Sefi-MedicalInstruments，海法，以色列)確定。為了目測一般相當于不活動精子的膜損壞的精子，將3μL propidium iodide(Molecular Probes，www.probes.com，60mM溶解在處理介質中)在分選前加入精子試樣中。用Texas Red過濾器組件(577nm激發，620nm發射)觀察來自染色細胞的紅熒光。用帶有CCD照相機(Hamamatsu 0RCA-100，www.hamamatsu.com)的倒裝顯微鏡(NIKON TE 300，www.nikon-usa.com)捕獲圖像并記錄運動。
該分選裝置使用這樣一種分選體系，其中不活動精子沿其初始流線流動，并從一個出口流出，而活動精子能偏離其初始流線，并通過不同的出口流出。該分選機理涉及用于“H過濾器”中的“過濾”機理，其中快速擴散的小分子通過與擴散得更慢的較大分子和顆粒不同的出口流出。這兩種裝置的差別在于本發明的分選裝置利用了細胞的主動運動，而H過濾器則利用顆粒的被動擴散。這種分選是可能的，因為在小通道中，多股層流物流可相互平行流動，而在物流間的界面處沒有湍流混和。該分選裝置中的精子試樣和介質流動的典型雷諾數在0.1的量級。約60μm長的不活動人類精子和相同量級放大尺寸的不活動顆粒緩慢擴散(D＝1.5×10-13m2/s；690秒擴散10μm)，并保持在其初始流線中。相反，活動的人類精子在20℃下以大于20μm/s的速度漂浮。這種快速活動性使活動精子本身，而不是不活動精子在數秒內無規地分布在寬度500μm的通道中。該分選裝置特別設計成使精子在主分離通道中有20秒的停留時間。位于該分離通道端部的分叉能有效地僅收集偏離其初始入口物流的活動精子。
所描述的分選裝置在為實際制造和使用而設計的單個芯片上集中了精子分選必須的所有功能，例如入口/出口、流體儲罐、泵、動力源、分選通道等。本實施方式的一個關鍵設計特征是一組四個水平定向的流體儲罐，它們也起到試樣入口/出口和流體抽取體系的作用。這些儲罐的方向、幾何形狀和尺寸設計成能平衡重力和表面張力，并提供能在長時間內產生穩定的流速的抽取體系，而與儲罐中流體的容積無關。這與流速隨著入口儲罐中流體容積的減少而隨時間降低的傳統重力驅動抽取體系形成了對比。儲罐直徑應選擇成足夠小，使表面張力能避免液體溢出水平方向的儲罐，但大到足以承載足夠量的試樣(幾十到幾百微升)，并能方便試樣引入和回收。這種力平衡使儲罐水平排列而不會使其中的液體溢出。水平儲罐的依次排列保持入口和出口儲罐中流體之間的高度差相同(入口和出口儲罐頂之間1.0mm的高度差)，而與儲罐中存在的流體容積無關，即使儲罐中流體的量變化也保持恒定的水壓。
這里描述的被動驅動抽取體系的獨特之處在于，它用水平方向的儲罐克服了傳統重力驅動抽取中壓力隨著儲罐中液體量的減少而降低的問題。此外，該泵的結構比其他機械或非機械抽取體系簡單的多，使得很容易制造并將泵集成在一個小的、集中的裝置中。最后，用重力和表面張力作為驅動力消除了對諸如電池的供電的需要，提供了總體上小尺寸的分選裝置。考慮到重力、表面張力和通道阻力，將分選裝置設計成在主分選通道中提供穩定的精子流速和約20秒的停留時間。更具體地，該裝置設計成使流體儲罐的流動阻力比微觀流體通道的阻力低10倍以上，從而可以忽略。這樣，通道的阻力，計算值為2.8×1012kg/(s/m4)，就約等于體系的總阻力。由于要求0.008μL/s的體觀流速來實現希望的20秒停留時間，且總阻力為2.8×1017kg/(s/m4)，驅動流體所需凈壓降為23N/m2。為了實現這種希望的壓降，我們這樣設計儲罐的尺寸，使毛細力(3.0mm直徑的入口儲罐對2.0mm直徑的出口儲罐)為13N/m2，由于靜壓(1.0mm高差)產生的該分選裝置的微觀流體通道的壓降為9.8N/m2。為了計算毛細力，假設接觸角為0度(水在BSA涂覆的PDMS上的接觸角很小)，洗凈的精液試樣的表面張力假定為約0.040N/m(小于水由于諸如蛋白質的“雜質”而產生的表面張力)，且洗凈的精液試樣的粘度與水的粘度接近。對于1％BSA溶液中稀釋顆粒懸浮液觀察到的0.008μL/s的體觀流速約等于計算流速。實際精子試樣有時由于較大的表觀粘度而具有較低的流速。精子試樣物流較低的流速將導致產率的輕微降低，但并不影響分選的精子出口處回收精子的純度。
該分選裝置的精子分選效率通過三種方法評價(i)通過相襯顯微術跟蹤通道中活動精子的運動，(ii)通過熒光顯微術跟蹤通道中propidium iodide(PI)染色細胞的運動，(iii)用Makler CountingChamber(一種基于網格的精子計數裝置)測定入口和出口儲罐中活動精子與不活動精子的數量(圖8)。精子跟蹤試驗表明活動精子如何能游出其初始流線的過程。PI將諸如死細胞的膜損壞細胞染色，從而使不活動精子對紅色熒光表現出高亮和可視，而活動精子保持未染色。圖8中的棒圖比較了分選前后活動精子的百分數。無陰影的棒代表初始精子試樣，而實心棒代表富活動顆粒介質物流。分選后活動精子的純度接近100％，與分選前活動精子純度無關。定義為活動精子出口儲罐中的活動精子數與精子試樣入口儲罐中活動精子總數之比的產率(39％、42％、43％)相當于或大于用諸如直接漂浮、從離心精子片漂浮或密度梯度分離的傳統分選方法處理的精子的回收率(0.8-50％)。還觀察到精子形態(與成功受孕相關的另一個重要的特征)在用該裝置分選后也得到改善(Strict Sperm Morphology分選前9.5±1.1％正常，分選后22.4±3.3％正常)。Kruger Strict Sperm Morphology是一組準則或標準，從而使精子必須在特定測量范圍內(頭部寬度和長度、尾部長度、精蟲頭粒形成一定比例的精子頭部)和缺乏異常性(例如尖頭、圓頭、卷曲的尾部)。
從以上可見，該活動顆粒分選裝置很小、容易制造、操作簡單且高效。在以下權利要求中，除非另外指出，術語“a”和“an”指“一個或一個以上”。
盡管已說明和描述了本發明的實施方式，但這些實施方式并沒有說明和描述本發明所有可能的形式。而且說明書中使用的詞匯是描述性而非限定性詞匯，當然可以作出各種變化而不脫離本發明的精神和范圍。
權利要求
1.從很少活動和/或不活動顆粒分選活動顆粒的方法，包括a)提供包含活動顆粒和至少一種很少活動顆粒或不活動顆粒的分選流體；b)提供將富含活動顆粒的介質流體；c)使分選裝置的分選通道中的所述分選流體的物流與所述介質流體的物流接觸，所述分選流體物流與所述介質流體物流之間在所述分選通道中有非湍流界面，從而使活動顆粒離開分選流體物流并進入介質流體物流，形成乏活動顆粒分選流體物流和富活動顆粒介質流體物流，和d)將乏活動顆粒分選流體出口物流與富活動顆粒介質流體出口物流分開。
2.權利要求1的方法，其中所述活動顆粒包含活動精子，且所述很少活動和不活動顆粒包含比所述活動性的精子或無活動性的精子的活動性差的精子。
3.權利要求1的方法，其中所述分選流體在分選流體儲罐中提供，而所述介質流體在介質流體儲罐中提供。
4.權利要求1的方法，其中所述介質流體和所述分選流體按相同的方向并以基本上相同的流速流動。
5.權利要求1的方法，其中所述分選流體物流和所述介質流體物流在所述分選通道中表現出層流流動。
6.權利要求1的方法，其中所述分選通道中所述介質流體物流的橫向容積大于所述分選流體物流的橫向容積。
7.權利要求1的方法，其中所述乏活動顆粒分選流體出口物流包含指向具有分選通道的第二裝置的分選流體入口物流，并重復步驟a)至d)，從而使活動顆粒進一步進入所述第二裝置的介質物流，并進一步減少所述分選流體中的活動顆粒。
8.權利要求1的方法，其中所述活動的、很少活動的和不活動的顆粒是精子顆粒，且所述富活動顆粒介質出口物流中活動顆粒的純度高于分選流體中活動精子的純度，而且至少為80％，所述百分數基于所述富活動顆粒介質出口物流中活動精子數與所述富活動顆粒出口物流中的總精子數的比較。
9.權利要求1的方法，其中所述活動顆粒包含活動的微生物，而所述不活動顆粒包含不活動的微生物。
10.適合在權利要求1的方法中使用的活動顆粒分選裝置，包括a)具有第一端和第二端的分選通道；b)與所述分選通道的所述第一端流體連通的分選流體入口；c)與所述分選通道的所述第一端連通的介質流體入口；d)與所述分選通道的所述第二端流體連通的乏活動顆粒分選流體出口；和e)與所述分選通道的所述第二端流體連通的富活動顆粒介質流體出口。
11.權利要求10的分選裝置，其中所述分選通道的所述第一端由分選物流入口和介質物流入口匯合形成，所述分選通道的所述第二端終止于乏活動顆粒分選物流出口與富活動顆粒介質物流出口的分叉處。
12.權利要求10的分選裝置，其中所述分選流體入口包含分選流體入口通道，所述介質流體入口包含介質流體入口通道，所述乏活動顆粒分選流體出口包含乏活動顆粒分選流體出口通道，且所述富活動顆粒出口包含富活動顆粒出口通道。
13.權利要求12的分選裝置，其中每個所述入口通道和所述出口通道分別與所述裝置內部的流體儲罐連通。
14.一種活動顆粒分選裝置，包含權利要求10的裝置，其中所述乏活動顆粒分選物流出口起到權利要求10的第二分選裝置的分選物流入口的作用，或其中所述富活動顆粒介質物流出口起到權利要求10的第二分選裝置的分選物流入口的作用。
15.在單一集成結構中構建的一組權利要求10的分選裝置。
16.權利要求15的一組分選裝置，其中至少兩個所述分選裝置是串連連接的。
17.權利要求10的分選裝置，其由聚合物鑄成。
18.權利要求13的分選裝置，其中所述裝置包含含有分選流體儲罐、分選流體入口通道、分選通道、乏活動顆粒分選流體出口和乏活動顆粒分選流體儲罐的第一泵抽系統，從而使分選流體由于至少一種重力或毛細力而從所述分選流體儲罐流向所述乏活動顆粒分選流體儲罐。
19.權利要求13的分選裝置，其中所述裝置包含含有介質流體儲罐、介質流體入口通道、介質通道、富活動顆粒介質流體出口和富活動顆粒介質流體儲罐的第二泵抽系統，從而使介質流體由于至少一種重力或毛細力而從所述介質流體儲罐流向所述富活動顆粒介質流體儲罐。
20.權利要求19的分選裝置，其中流體既由于重力也由于毛細力而流動。
21.權利要求10的裝置，其中所述分選通道基本上是矩形，具有約60-150μm的高度和約100-800μm的寬度，長度約500-10000μm，其中所述分選入口包含基本上與所述分選通道的高度相同、寬度較窄為50-500μm的分選入口通道，且其中所述介質入口包含一個或多個高度與所述分選通道基本相同、總寬度大于所述分選入口通道寬度并小于所述分選通道寬度的介質入口通道，其中總寬度是當有一個以上入口通道時每個介質入口通道寬度之和。
全文摘要
在微觀流體分選裝置(10)中從不活動顆粒中分選出活動顆粒，其中使來自分選物流通道(7)的含有活動和不活動顆粒的分選流體物流以非湍流的方式緊鄰來自介質物流通道(8)的介質物流流過分選通道(6)，期間流動的活動顆粒跨過相鄰流動物流間的界面，進入介質物流中，并在乏活動顆粒分選通道(9)中形成乏活動顆粒分選物流。該分選裝置很容易廉價制造并具有許多用途，特別是從不活動精子中分選出活動精子。
文檔編號B01L3/00GK1646682SQ03808206
公開日2005年7月27日 申請日期2003年2月24日 優先權日2002年2月27日
發明者S·塔卡亞馬, G·D·史密斯, T·G·舒斯特, B·S·丘 申請人:密執安大學評議會