專利名稱：薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱的制作方法
技術領域：
本發明主題名稱為″薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱″。它在生化研究、基因工程技術中，可用作酶、蛋白質，核酸等生物大分子分離提純的核心裝備。學術上應屬于色譜分析技術領域的分離材料或分離工具范疇。
二
背景技術：
層析柱作為色譜技術家族的最重要成員，具備該家族共有的三項標志分離有效物質的場所---固定相和在固定相里運動的液體或氣體---流動相，以及后者必須能平穩的攜帶著被分離的有效物質并使其在固定相里經過千百次的固，液相反復分配過程，最終達到分離純化目的。
沒有色譜分離技術就不會有今日的生命科學；分離材料科技一直在其母學科---生命科學的帶領下飛速發展。所有的色譜材料的開發和應用技術的改進，都集中在固定相和流動相質材品質改良和兩者間相互最佳匹配狀態選擇上。理想狀態的層析柱按數學公式推導的要求，須要操作者把將近二十項相互關聯的變量參數調整到最佳協同狀態。與數學模型完全吻合的柱層析技術是可接近而不可企及的。它像所有科學技術一樣，將永遠向勤奮的科學家開放一方可開墾的處女地。層析柱作為一類重要的研究和生產工具，緊密伴隨生命科學蓬勃發展的要求而不斷更新換代。現代生命科學發展要求分離材料技術不斷創新，令諸多分離材料專門家折腰。
本專利發明《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》(簡稱片層柱)即是在這樣大技術背景下補缺而生。它的設計思想和實物結構與傳統理念有很大差異。
近些年來，市場上有多種予裝柱供應，性能堪佳，使用方便；缺憾之處是回收再生依然費時費工，比起散裝柱并無改觀。究其根源，這似乎與設計者腦子里一直存在的″要求有一個臻于完美的固定相和一個幾乎不受干擾的流動相″理念不無關系。
中國專利92111328.5《工業生產用固定化陰(陽)離子交換纖維素柱》是本文作者早年工作。實施過程中發現有明顯缺陷，盡管采取多種措施，柱體間參數離散性大的弊病仍是長期困擾人心的難題。長期摸索過后，意識到一味追求柱芯的細密，均勻和連續性來保證能有一個″幾乎不受干擾的流動相″可能不是最佳的選擇。或許徹底打破這種″細密，均勻，連續性″傳統格局，采取″于最紛亂之中求均勻，最斷續中求連續″的做法可能是另一個出口。這種設想指導下的具體實踐是改革傳統的柱芯結構，沿柱芯縱軸方向垂直對柱芯做結構上的等份分割，分割間距為1或數毫米。使這種柱芯由數百乃至上千層毫米級厚度的薄片疊加而成。
這就要對柱體內流動相的流體力學特性作出新的解釋在此新的分離系統中，流動相除受重力或泵壓的驅動之外，還隨時受到沿途各薄層片內部毛細效應的浸潤和片層間隙的阻滯。由于每片薄層都與柱芯的中心線垂直，使這種浸潤和阻滯效應可隨時隨地對流動相的擴散起到矯正和限制作用。這樣，流動相就可以攜帶著被分離溶質沿經向以狹窄的區帶循序漸進。狹窄的區帶意味著良好的分離效果。
疊層柱柱體以模塊為單位任意拆裝、重組會帶來獨到的應用特點。另外，通過特制的清洗片可實現對整個柱芯從內部進行同步分段回收和再生。
數年實驗下來，實踐證明了上述構想不謬。有今日中國發明專利《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》的申報。
三
發明內容
本發明的核心是改革傳統柱芯的固定相，使它由均一的連續結構改為疏密相間、層層疊加的片層。要點如下1)從結構上看，保持柱芯橫切面方向的物質分布盡可能均勻，細密和連續性。沿縱軸方向對柱芯做結構上垂直的等份分割，分割間距為1或數毫米。由此制成的″薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱″是一種新的固定床色譜柱，它的柱芯是由數百乃至上千層毫米級厚度的薄片疊加而成。2)這一種有勃于傳統的色譜柱芯柱芯，裝填物質沿徑向是非均一的，不連續的固定相。柱體橫向剖面裝填物質保持傳統理論所強調的細致，均一和連續性；但縱向剖面在物質占位上是疏密相間和有規律的循環重復。3)柱身的基本構件是模包組件，它是由若干層上述柱芯薄片疊加后，固定在塑料或有機玻璃預制的封套里。若干模包組件再疊加，機械固定組成完整的《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》。4)整個柱體可以以模包為單位隨意拆散和組裝，同等尺寸規格的模包組件可任意替換和重組。5)專用的可插入式清洗模片可多位點的從橫向切入待回收柱芯內，使得片層柱被分割為若干柱節。清洗模片在垂直柱芯的軸向設有隔膜，同時可以從橫向往上，下方向輸入或輸出液體的預制件。清洗劑由清洗片導入柱芯，從內部同時進行清洗回收。既省時又省工，從而可獲得最大限度的利用效率。6)組成柱芯的片層材料由環氧樹脂，丙稀酸樹脂，硅橡膠等共聚物與陰(陽)離子交換材料膠合，固化成型。7)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》可以勝任兩種常規裝填柱不可能具備的工作方式A足夠長度的片層柱，充分展層后，將整個柱芯視為一個″部分收集器″找出攜帶欲分離物質集中的模包單獨回收。
B多根柱床平行操作，按上法收集分離物質集中的模包重新組裝成柱，集中回收或進一步分離純化。
四說明書
(圖1)300*1毫米*30毫米陰離子交換纖維素片層柱。PH7.5，磷酸緩沖液，0---500毫摩氯化鈉直線梯度，雞卵清分離圖譜。該柱可將雞卵清分離為三個獨立的蛋白峰。
(圖2)300*1毫米*30毫米陰離子交換纖維素疊層柱。PH7.5，磷酸緩沖液，500毫摩氯化鈉對卵清蛋白洗脫圖譜。
(圖3)300*1毫米*30毫米陰離子交換纖維素疊層柱。PH7.5，磷酸緩沖液300毫摩爾氯化鈉分離雞卵清蛋白圖譜。
(圖4)300*1毫米*30毫米陰離子交換纖維素疊層柱。PH7.5，磷酸緩沖液，蚯蚓抽提液分離圖譜峰1為流出雜蛋白，峰2為0-300毫摩爾氯化鈉線性洗脫圖譜。可以看出線性洗脫不能對蚯蚓漿組分進行有效分離，只是顯4有4-5個組分混合在一起。
(圖5)300*1毫米*30毫米陰離子交換纖維素疊層柱。PH7.5，磷酸緩沖液，蚯蚓抽提液分離圖譜峰1為流出雜蛋白，-------為予設的洗脫液離子強度變化曲線，依次遞增的氯化鈉濃度為50、90、130、140、200、250、300、350、410毫摩爾，在每個濃度間隔里插入一個柱體積的5毫摩爾氯化鈉作為過度。
從圖中可以看出(圖4)里的峰2在(圖5)條件下被分解為8個獨立的蛋白峰。
(圖6)實驗用《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》(A2工作柱 B2加裝清洗片的回收柱)①進料管 ②緊固螺栓 ③模包組件 ④清洗片 ⑤封頭 ⑥出料管(圖7)生產用《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》(A1工作柱 B1加裝清洗片的回收柱)①緊固螺杠 ②把手 ③壓板 ④清洗片 ⑤模包組件 ⑥封頭 ⑦基座 ⑧龍門架五
具體實施例方式(一)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》的制作方法。
陰離子交換柱芯芯料配方1二乙氨基乙基離子交換纖維素 55.25％2環氧樹脂 7％3丙稀酸甲脂 8.5％4偶氮2異庚氰0.3％5硅橡膠予聚體 3.5％6鄰苯2甲酸2甲脂 1％7去離子水 4％8氯化鈉 21％芯料制備；按配方要求將物料2，3，4，6依次投入反應釜中，升溫至75攝氏度，保溫90分鐘，待物料黏度變稠至可扯起絲時立即降溫至15攝氏度以下，使反應暫時停止。將物料5，8依序加進上述反應釜中，攪拌均勻。物料1與7預先拌勻后一并加進反應釜。始終保持釜內15攝氏度，直至全部物料被下步工序用完。
軋輥間隙1毫米，將反應釜中物料扎制成薄板，隨即切割成規定尺寸的圓片。
105攝氏度固化12小時后，冷卻到室溫，包裝備用。模包組件裝配模包組件的外皮是塑料預制件，將上述的柱芯薄片疊層安裝在中心孔中，膠料粘接即成。整柱的裝配模包組件疊加，配上，下封頭，(或清洗片)螺栓緊固。
(二)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》實用舉例1---流動相的抗干擾性能。
對片層柱而言，最嚴重的隱患莫過于因柱芯被切割和片層疊加給流動相可能造成的層層″渦流″。沿途存在渦流必然使行進中的流動相倍受攪擾，如果是這種情況，樣品分離工作將無法進行。如果疊層層析柱抗逆性能強，可避免出現上述不良情況。
如下做法可考驗疊層層析柱抗逆性能。
一種慣常的生化現象是成分復雜的蛋白質樣品，單憑一根層析柱很難獲得單純分離產物。每個洗脫峰里包含的只能是一組電性相近的蛋白質，這些蛋白質會隨洗脫液離子強度改變而發生組分遷移現象。組分遷移意味樣品在流動相里進行了重新分配。介質顆粒阻滯會造成流動相形成“渦流”，被擾動的流動相將會使這一分配過程變得亂無章法。
依據上述原理，比較疊層柱對雞卵清蛋白的三次分離實踐過程，從分離圖譜的分辨率、主峰區帶寬度、實驗塔板數就可判斷柱芯內形成“渦流”對流動相的干擾情況。
(圖1)、(圖2)、(圖3)為三次分離卵清蛋白實踐過程的紫外監測儀記錄圖譜，分離條件見各圖的文字說明。
結果見下表(圖1)，(圖2)，(圖3)各圖譜相關分離參數變化對照表
從上表可以看出1)洗脫條件不同，分辨率無明顯劣化改變。各洗脫峰的位置，寬度變化不大。主峰的高度有明顯差異，存在主峰間塔板數轉移的現象。這意味著樣品在流動相里進行了重新分配。2)每組實驗圖譜的主峰都仍保持了很高的實驗塔板數。可以看出，由于離子強度等實驗條件的影響，在各組實驗的流動相內，被分離組分濃度變化很大；盡管流動相內部各組分間存在明顯的交叉混合，但都保持著一個十分銳利的主峰；以上現象意味著在柱芯已經被分割為300片*1毫米/片的不連續的固定相里，流動相并不因此被擾動。這樣就驗證了“利用片層內部的毛細浸潤和片層間隙的阻滯作用，持續不斷的抑制和矯正頑固的區帶擴散傾向”″于最紛亂之中求均勻，最斷續中求連續″的總體設想的合理性。這些實驗表明，對于《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》而言″渦流″現象不足為患。(三)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》實用舉例2----解析能力。
對一組線性梯度不能分開的混合蛋白質(見圖4，峰2)，按照予先設定的洗脫液離子強度變化曲線進行階段洗脫。可操作性良好的層析柱應對原本難以分離的復雜樣品有令人滿意的進一步解析能力。(圖4)，(圖5)為實際操作過程的紫外檢測圖譜，工作條件見各圖說明。對照(圖4)，(圖5)可以看出兩圖的峰1是未被吸附的蛋白峰，在兩次實驗中保持著相同的形狀和位置。而(圖4)里的峰2是一組線性梯度不能分開的混合蛋白質。但在(圖5)的實驗條件下，這組蛋白質已被分割成8個互相獨立的蛋白峰。顯示了″薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱″的解析能力良好。(四)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》實用舉例3----再生效率。
使用后的層析柱必須回收、再生才能再次使用，尤其是工業生產用柱，幾乎一半的工時都耗費在回收車間里。片層柱有獨特的清洗和回收方法，清洗模片可多位點的從橫向切入待回收柱芯內，使得片層柱被分割為若干柱節。清洗劑由清洗片導入柱芯，從內部同時進行清洗回收。
利用專用的清洗片對《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》進行回收再生處理。從下邊的耗時統計表里可以看到，不加裝清洗片時，回收時間沒有改進。一旦加裝了清洗片后，回收再生所消耗的時間就大大縮短。它的再生效率比傳統的填充柱可提高數倍，實際效果與當時使用清洗片的數量成正比。
不同條件下回收、清洗層析柱的耗時統計表(小時)
從上表可看出由于清洗劑由清洗片導入柱芯，從內部同時進行清洗回收，使回收時間縮短了4---8倍。使用的清洗片越多越節省時間。
由此看來，《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》用于工業生產可節省很多時間。
權利要求
1)本發明《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》的核心在于改革傳統層析柱的柱芯結構。徹底打破了那種旨在保持“細密，均勻，連續性”固定相的傳統設計格局。創造出一種新理念的實驗或工業生產用柱。其特征是對柱芯沿橫斷面最大限度的進行機械性等份分割，把柱芯制作成薄層疊加，疏密相間的結構。分割間距為1或數毫米。使這種柱芯由數百乃至上千層毫米級厚度的薄片疊加而成。
2)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》柱身的基本構件為模包組件，該模包組件是由若干層上述柱芯薄片疊加后，固定在塑料或有機玻璃預制的封套里。若干模包組件再疊加，機械固定組成完整的柱體。
3)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》整個柱體可以以模包為單位隨意拆散和組裝。同等尺寸規格的模包組件可任意替換和重組。
4)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》，借助可插入式清洗模片使片層柱再生。清洗模片的垂直柱芯的軸向設有隔膜和輸液管道。清洗劑由清洗片導入柱芯，同時可以從橫向往上，下方向輸入或輸出液體，構成片層柱獨特的清洗和回收方法。其特點是清洗模片可多位點的從橫向切入待回收柱芯內，使得片層柱被分割為若干柱節。清洗劑由清洗片導入柱芯，從內部對各柱節同時進行清洗回收。省工省時，插入的清洗片越多越省回收時間。
5)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》可以勝任的兩種常規裝填柱不可能具備的工作方式A足夠長度的片層柱，充分展層后，將整個柱芯視為一個″部分收集器″找到并抽出攜帶欲分離物質集中的模包單獨回收。B多根柱床平行操作，按上法收集分離物質集中的模包重新組裝成柱，集中回收或進一步分離純化。
6)組成柱芯的片層材料的化學原料組成。由環氧樹脂，丙稀酸樹脂，硅橡膠予聚物為固化成型原料。凡不與這些原料在本專利說明書限定條件下起化學反應的分離介質如離子交換樹脂，離子交換纖維素，分子篩及各種生化親和試劑均可依本專利闡明的原理和工藝制作出各種薄層疊加式層析柱。
7)適合工業生產的大型《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》借助螺栓和龍門架式的機械裝置固定。其特點是拆卸方便，清洗回收節省工時，比傳統柱利用率高。
全文摘要
本發明主題名稱為“薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱”，可在生物工程技術中用作酶、蛋白質等生物大分子分離、提純的核心裝備。它的特征是柱芯是由數百乃至上千層毫米級厚度的薄片疊加而成。柱體橫剖面裝填物質在占位上保持傳統理論所強調的細致、均一和連續性；但從縱剖面看卻是層層重疊、疏密相間、循環重復的分離介質。獨特的柱體結構使柱體沿橫斷面可任意拆裝，重新組合；有著比傳統層析柱更多的可變通性。專用的可插入式清洗模片，可多位點的從橫向切入待回收柱芯內，使片層柱被分割為若干柱節；清洗劑由清洗片導入柱芯，可從內部同時對各柱節進行清洗回收，既省時又省工，可使層析柱獲得最大限度的利用效率。
文檔編號B01D15/08GK1481919SQ03149949
公開日2004年3月17日 申請日期2003年7月31日 優先權日2003年7月31日
發明者倪寶謙 申請人:倪寶謙