專利名稱：一種果膠酶親和吸附劑的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物化工領域。
果膠酶是一種工業用酶制劑，它的主要性質是降解果膠物質。果膠酶這一性質主要應用于果汁加工和果酒釀造。此外，果膠酶在茶和咖啡的發酵、桔子脫囊衣、麻料脫膠、廢水處理、造紙、榨油等領域也有應用。作者最近申請的一項發明專利成功地將其應用于誘導植物抗病。
果膠酶的生產主要是用微生物發酵得到。由于微生物發酵過程中代謝產物比較復雜，培養基成為也很復雜，因此微生物發酵所得到的果膠酶粗提物中雜質含量非常高，純化果膠酶相當困難。果膠酶的純化方法主要有有機溶劑沉淀、鹽析、離子交換柱層析、凝膠過濾柱層析、親和層析、凝膠電泳等。其中，以親和層析效率最高。目前文獻報道的果膠酶親和吸附劑的制備方法是以高分子量的果膠酸鈉或海藻酸鈉為配基，用表氯醇將其交聯制得。但是，高分子量的果膠酸鈉和海藻酸鈉的價格比較昂貴，并且用其制備的親和吸附劑容易在流動相條件改變時大幅度地膨脹或收縮，造成流速不穩定，影響分離效果。
本發明采用果膠含量較高的生物質作為配基和載體，用表氯醇將配基交聯制得果膠酶親和吸附劑。許多農業廢棄物以及農副產品產品加工廢棄物中果膠含量較高，都可以作為該親和吸附劑的配基和載體，因此該類配基和載體廉價易得。這些生物質的組成成分主要是果膠、纖維素、半纖維素、木質素等，果膠可作為親和吸附劑配基，纖維素、半纖維素、木質素等可作為配體的載體，因此由生物質制備的親和吸附劑不僅具有對果膠酶良好的親和能力，而且在流動相條件改變時不易膨脹或收縮，流速穩定，便于操作。
本發明所述的果膠酶親和吸附劑制備方法內容如下1、生物質粉碎將果膠含量較高的生物質(如甜菜渣、葵花盤、橘皮、水果渣等)烘干、粉碎、過篩，將60目以下部分收集，備用。
2、配基制備將生物質粉末用水浸泡1小時，抽濾，如此反復清洗3次。再用95％乙醇洗一次，于4℃下加入10倍體積95％乙醇-水(3∶1)溶液，攪拌。攪拌過程中，每隔1h加入2.5倍體積的2M NaOH的乙醇-水(3∶1)溶液，共加四次。最后一次加入后攪拌3小時。用G3砂芯漏斗過濾，然后再溶于20倍體積的0.5M NaOH的乙醇-水(3∶1)溶液，于4℃下攪拌過夜。用乙醇-水(3∶1)洗至中性，再用95％乙醇洗，空氣中干燥恒重。
3、交聯將第2步驟所得產物溶于0.5倍體積表氯醇和5倍體積95％乙醇混和液，加1倍體積5M NaOH，懸濁液倒入錐形瓶中，加蓋，搖床上150轉/分鐘，45℃，震搖6小時。從搖床取出，用1M乙酸中和至pH7，中止反應。G3砂芯漏斗抽濾。用乙醇-水(3∶1)洗滌，再用95％乙醇洗滌。空氣中干燥恒重。產品懸濁于蒸餾水中，攪拌，靜置。傾去上清液，G3砂芯漏斗過濾，95％乙醇洗滌。空氣中干燥恒重，得到均一粉末，即果膠酶親和吸附劑。
實施例1以甜菜渣為原料制備果膠酶親和吸附劑將甜菜渣在65℃烘干、粉碎、過篩，將60目以下部分收集，備用。
取10g過篩的甜菜渣用水浸泡、清洗，乙醇洗后，于4℃下加入100ml95％乙醇-水(3∶1)溶液，攪拌過程中，每隔1h分四次加入共100ml 2M NaOH的乙醇-水(3∶1)溶液，每次25ml，最后一次加入后攪拌3小時。用G3砂芯漏斗過濾，然后再溶于200ml 0.5M NaOH的乙醇-水(3∶1)溶液，于4℃下攪拌過夜。用乙醇-水(3∶1)洗至中性，再用95％乙醇洗，空氣中干燥恒重。
將上述步驟得到的產物溶于5ml表氯醇和50ml 95％乙醇混和液，加10ml 5M NaOH，懸濁液倒入250ml有蓋錐形瓶中，搖床上搖6h，45℃。從搖床取出，用1M乙酸中和至pH7，中止反應。G3砂芯漏斗抽濾。60ml乙醇-水(3∶1)洗滌，再40ml 95％乙醇洗。空氣中干燥恒重。產品懸濁于150ml蒸餾水中，攪拌，靜置1min。傾去上清液，G3砂芯漏斗過濾，60ml 95％乙醇洗滌。空氣中干燥恒重，及得果膠酶親和吸附劑。
實施例2用果膠酶親和吸附劑對果膠酶進行親和層析純化將制備好的果膠酶親和吸附劑裝層析柱(直徑16mm，長300mm)，先用0.02M pH4.3乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡，將微生物發酵得到的粗酶液10毫升上柱，流速30ml/h，繼續用平衡緩沖液洗脫。洗脫液經紫外檢測儀在280nm波長下檢測。出一個峰后，改用0.1M pH5.6乙酸-乙酸鈉含1M NaCl的緩沖液洗脫。收集各組分，測定其果膠酶活性。
對親和柱層析所得到的各吸收峰樣品進行聚半乳糖醛酸酶(果膠酶的主要成分)活性測定后，可知第一個較大的吸收峰沒有該酶活性；這表明第一個峰是雜質，果膠酶吸附在親和吸附劑上。緩沖液加入較高濃度NaCl后，洗脫出來的峰果膠酶活性較高，可以回收到上柱前的全部酶活；這表明果膠酶在親和吸附劑上的解離也比較容易。
經親和層析純化的果膠酶比酶活都有很大的提高(見下表)。果膠酶生產菌種 粗酶液的比酶活(u/ml) 親和層析后比酶活(u/ml)純化倍數草酸青霉 3818 9490 2.5黑曲霉 118 2174 18.權利要求
1.一種果膠酶親和吸附劑的制備方法，其特征在于，以果膠質含量較高的生物質作為配基和載體，去甲酯后用表氯醇交聯制得。
2.權利要求書1所述的果膠酶親和吸附劑的制備方法，其特征在于，所用原料為果膠質含量較高的各種生物質，如甜菜渣、葵花盤、水果渣等。
3.權利要求書1所述的果膠酶親和吸附劑的制備方法，其特征在于，其制備步驟是生物質→粉碎→去甲酯→表氯醇交聯→干燥
4.如權利要求書1所述果膠酶親和吸附劑的制備方法，其特征在于，經以上步驟所得果膠酶親和吸附劑可用于純化各種來源的果膠酶。
全文摘要
本發明為一種以果膠質含量較高的生物質為原料用表氯醇交聯制備果膠酶親和吸附劑的方法，屬于生物化工領域。發明以甜菜廢渣、葵花盤、水果渣等果膠質含量較高的生物質作為配基和載體，去甲酯后用表氯醇交聯，制得果膠酶親和吸附劑。用該方法制備的果膠酶親和吸附劑對不同微生物發酵所得果膠酶粗酶液進行親和層析，都有較高的純化效率。
文檔編號B01J20/22GK1475566SQ03149599
公開日2004年2月18日 申請日期2003年7月18日 優先權日2003年7月18日
發明者張洪勛, 白志輝, 賈月 申請人:中國科學院生態環境研究中心