通過分子解構的拉曼監測實施的核酸測序的制作方法

專利名稱：通過分子解構的拉曼監測實施的核酸測序的制作方法
技術領域：
本方法、組合物和裝置涉及分子生物學和基因組學領域。更具體地，該方法、組合物和裝置涉及核酸測序。
背景技術：
人類基因組計劃的出現要求開發出用于核酸，例如DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)測序的改善的方法。遺傳信息以組織為染色體的非常長的DNA分子的形式儲存。人類基因組的23對染色體含有大約30億個堿基組成的DNA序列。該DNA序列信息決定了每個個體的多種特征，例如身高、眼睛顏色和種族。許多常見的疾病，例如癌癥、纖維囊泡癥、鐮狀細胞性貧血和肌肉萎縮癥都至少部分地基于DNA序列中的變異。
人類基因組整個序列的測定已經為判定這些疾病的遺傳基礎提供了一個基礎。然而，為了確定與每一種疾病相聯系的遺傳變異，仍有大量的工作需要去做。為了確定在DNA序列中促發疾病的特定變化，就要求對表現有每一種這樣的疾病的個體或家族的染色體相應部分進行DNA測序。RNA是一種加工遺傳信息時所需要的中間分子，在一些情況下RNA也能被測序以確定各種疾病的遺傳基礎。
核酸測序的已有方法基于按大小分離開的熒光標記核酸的檢測，它受到了所能測定的核酸長度的限制。一般來說，一次只能測定500到1000個堿基的核酸序列。這比DNA的功能單位，即基因的長度短得多，后者可能有上萬個，甚至十萬個堿基長。使用目前的方法來測定一個完整基因的序列，就需要制得該基因的若干拷貝，把它們切為相互重疊的片段然后再測序，之后再把相互重疊的DNA序列組合為完整的基因序列。這個過程費力、昂貴、低效而且耗時。
附圖簡述下面的附圖構成了本說明書的一部分，它們被引入是為了進一步說明公開的實施方案的某些方面。通過參考這些附圖中的一個或者多個，并結合在這里提出的特定實施方案的詳細描述，可以更好的理解這些實施方案。


圖1顯示了用于DNA測序的一個典型的設備(未按比例作圖)和方法，其中，被釋放的核苷酸與將被測序的核酸分子在空間上是分離的。
圖2顯示了用于DNA測序的一個典型的設備(未按比例作圖)和方法，其中，被釋放的核苷酸與核酸分子在空間上不是分離的。檢測器對溶液中的核苷酸進行定量。
示例性的實施方案的描述被公開的方法、組合物和裝置用于核酸的快速、自動的測序。在特定的實施方案中，本方法、組合物和裝置適用于獲得非常長的核酸13分子的序列，大于1000、大于2000、大于5000、大于10000、大于20000、大于50000、大于100000或者甚至有更多堿基的也可以。在各種實施方案中，這樣的序列信息在一次單獨的測序操作過程中使用模板核酸13，102的一個分子便可以獲得。在其他實施方案中，該模板核酸分子13，102的多個拷貝可以平行或順序地被測序，從而確證核酸的序列或獲得完整的序列數據。在可選擇的實施方案中，核酸分子13，102和它的互補鏈可以被測序以確證序列信息的精確性。與核酸測序的已有方法相比，優點包括在一次單獨的測序操作中讀出長核酸的序列，獲得序列數據的速度更快，并且，就產生每單位的序列數據所需要的操作時間而言，測序的花費降低，效率提高。
在某些實施方案中，待測序的核酸13，102是DNA，盡管其他核酸13，102，包括RNA或合成的核酸同型物也被認為可以被測序。下面的詳細描述包含了大量特定細節以提供對公開的實施方案的更全面的理解。然而，對于本領域技術人員來說，沒有這些特定的細節，也能夠實施這些實施方案。在其他方面，那些在本領域廣為人知的裝置、方法、步驟和個別的組分沒有在這里詳細描述。
一些實施方案如圖1和圖2所示，這些方法涉及單個單鏈核酸分子13，102的測序，這些核酸分子連接到一個反應室11，101中的一個固定化表面14，103，并且在解構(deconstruction)反應中分解。在這些實施方案中，反應室11，101含有一種或多種解構試劑15，106，它們能次序地每一次從核酸分子13，102的未連接端17，105移去一個核苷酸16，104。這些解構試劑15，106的非限定性的例子包括本領域已知的任何外切核酸酶。在一些實施方案中，當核苷酸16，104被釋放進入溶液時，通過拉曼光譜被確定。
圖1顯示了某些實施方案。圖1顯示了一個用于核酸測序的裝置10，該裝置包含連接著一個流動通路12的一個反應室11。該反應室11包括連接到一個固定化表面14的一個核酸分子13和一種解構試劑15，如外切核酸酶。該外切核酸酶15催化各個核苷酸16從核酸分子13的自由末端17按次序地釋放。當各個核苷酸16通過解構反應被釋放并進入溶液時，它們沿流動通路12流動并通過一個檢測單元18。該檢測單元18含有一個激發源19如一個激光器，它發出激發光束20。該激發光束20和釋放的核苷酸16反應，致使電子被激發到更高能態。電子返回低能態時產生的拉曼發射光譜由一個拉曼光譜檢測器21如一個光度計或一個單色儀檢測。
在圖1顯示的實施方案中，被釋放的核苷酸16在接受檢測單元18的檢測之前與核酸分子13在空間上是分離的。空間上的分離可以通過隔離各個核苷酸16來提高拉曼檢測器21的信噪比。
在圖1顯示的實施方案中，一個反應室11里含有一個核酸分子13。在可選擇的實施例中，將每一個核酸分子13分別置于一個獨立的反應室11里，可以對多個核酸分子13同時測序。在這種情況里，各個反應室11中的核酸模板13可能是相同的或者不同的。在其他可以選擇的實施方案中，兩個或者更多的模板核酸分子13可以放在同一個反應室11里。在這樣的實施方案中，核酸分子13的序列相同。當多于一個的核酸分子13存在于反應室11中時，拉曼發射信號將代表反應室11中由所有核酸分子13同時釋放的核苷酸16的平均值。熟練的技術人員能夠使用已知的數據分析技術，校正在解構反應的任何給定時間獲得的信號，這些信號或者落后于反應的主體(majority)，或者先于反應的主體。在某些實施方案中，技術人員可以通過一些步驟使單個反應室11中的多個核酸分子13的解構同步化，如在加入一團解構試劑15時作快速混合。
在某些可選擇的實施方案中，可以將一個標記分子加入到檢測單元18上游的反應室11或流動通路12。當自由核苷酸16從核酸分子13上釋放時，標記分子連接到它們上面，并對其加以標記。這種釋放后標記避免了在核酸分子13的核苷酸16進入溶液前被標記時會出現的問題。例如，如果摻入核酸分子13的每一個核苷酸16是在解構之前被標記，那么使用大體積熒光探針分子會產生明顯的空間位阻，這將會降低測序反應的效率并增加測序用的時間。
在涉及核苷酸16的釋放后標記的實施方案中，可以期望使用別的檢測方法，例如熒光光譜法或發光(luminescene)光譜法。許多可以選擇的溶液中自由核苷酸16的檢測方法是已知的并可加以利用。對于這些方法，拉曼光譜檢測單元18可以用被設計成用于檢測熒光、發光或其他類型信號的檢測單元18替代。
標記分子具有獨特且明顯可見的光學信號，這些信號能夠區分每種常用核苷酸16。在某些實施方案中，該標記能夠增加拉曼發射信號的強度，或者以其他方式提高拉曼檢測器21檢測核苷酸16的靈敏度或特異性。對于涉及拉曼光譜的實施例來說，能夠使用的標記分子的非限制性例子包括TRIT(四甲基若丹明異硫醇)、NBD(7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、赤蘚紅和氨基吖啶。用于特定實施方案的其他標記部分可以包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。在某些實施方案中，碳納米管也可作為拉曼標記被使用。在拉曼光譜中標記的使用在本領域是已知的(例如，美國專利號5,306,403和6,174,677)。熟練的技術人員明白，當拉曼標記結合到不同的核苷酸16時，應該能夠產生可區分的拉曼光譜，或者對于每一種核苷酸16，設計不同的標記與之相連。
在某些實施方案中，核酸分子通過與一個固定化表面14相連而被固定在原位，并浸在沿一個流體通路12流動的微流體中，該流體能運送從核酸分子13上釋放的核苷酸16，并使其通過一個檢測單元18。在一個非限制性的實例中，微流體流動可以由經過核酸分子13并沿著一個流動通路12的溶劑體流動形成，流動通路12如一個硅、玻璃或其他芯片中的一個微毛細管或一個蝕刻通道。在作為選擇的實施方案中，體介質移動很慢或者根本不移動，但是溶液中帶電荷的物質(如帶負電荷的核苷酸16)在外加電場作用下沿著含有一個通道或細管的一個流動通路12運動。
在其他作為選擇的實施方案中，通過移動與核酸分子13相連的固定化表面14，可以使核酸分子13離開釋放的核苷酸16。通過利用一個隨著核酸分子13移動的檢測單元18來掃描和確定釋放的核苷酸16。
在上面所討論的實施方案中，檢測單元18必須能夠區別從核酸分子13釋放的普通核苷酸16。至少，為了測定DNA分子13序列，檢測單元18必須能夠區分含有腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)和胸苷(T)的核苷酸16。如果對RNA 13測序，檢測單元18必須能夠區分含有A、G、C和尿苷(U)的核苷酸。對于每個反應室11只有一個核酸分子13的情況，沒有必要要求檢測單元18能夠對溶液中的每種核苷酸16進行定量，因為每一次只有一個核苷酸16通過檢測單元18。
在其他實施方案中，如圖2所示，檢測單元107有足夠的靈敏度，能夠確定存在于溶液中的自由核苷酸104的數目。因此，不需要將釋放的核苷酸104與核酸分子102分離開。如圖2所示，該裝置100包含一個反應室101，該反應室101含有一個一端連接到一個固定化表面103的核酸分子102。通過一種解構試劑106如外切核酸酶的作用，從核酸分子102的未連接端105次序地移去自由核苷酸104。
如圖2所示，在這些實施方案中自由核苷酸104與核酸分子102在空間上不是分開的。檢測單元107含有一個能發出激發光束110的激發源108和一個檢測器109。檢測單元107對含有核酸分子102和自由核苷酸104的反應室101作出分析。因為檢測器109能對溶液中每個核苷酸104進行定量，所以可以通過核苷酸104釋放進入溶液的時間順序確定核酸102序列。因為被掃描的體積更大，所以可能有必要使用覆蓋范圍更廣、強度更大的激發光束110。
在這些實施方案中，由于每個核苷酸104是連續地從核酸分子102的未連接端105釋放，所以可以通過溶液中該核苷酸104信號的增強來確定該核苷酸104。拉曼檢測器109能獨立地確定溶液中每種核苷酸104——腺苷一磷酸(AMP)、鳥苷一磷酸(GMP)、胞苷一磷酸(CMP)和尿苷一磷酸(UMP)或胸苷一磷酸(TMP)——的分子數目，并從由核酸分子102產生的基準拉曼信號中分離出那些信號。
技術人員會明白，對DNA 13，102的分析將導致脫氧核糖核苷或脫氧核糖核苷酸16，104(包括胸苷)的釋放，而對RNA 13，102的分析將導致核糖核苷或核糖核苷酸16，104(包括尿苷)的釋放。盡管由外切核酸酶15，106活性造成的釋放形式通常是核苷一磷酸16，104，但實施方案并不局限于檢測自由核苷酸或核苷16，104的某一特定形式，而是包含了利用一種解構試劑15，106的活性從一個核酸13，102上釋放出的任何單體16，104。
在進一步的實施方案中，圖1和圖2顯示的方法和裝置10，100的一些組合可以被使用。圖1的方法可以使用一個低靈敏度的檢測器21，但要求更復雜的分子運送程序。圖2顯示的方法簡化了分子運送，但要求一個高靈敏度的檢測器109。各種中間方法可以被使用。例如，可以使用沿著一個流體通路12的微流體流動將已檢測到的核苷酸16從激發光束20照射的區域移走，而拉曼檢測器21的定量功能允許在被釋放的核苷酸16之間沒有時間或空間分離的情況下進行檢測。
在某些實施方案中，來自一個檢測器21，109如分光計或單色儀陣列的數據可以傳入一個信息處理系統，該系統含有一個將特定拉曼信號與特定核苷酸16，104聯系起來的數據庫。該信息處理系統記錄下由檢測器21，109檢測到的信號，用數據庫中已知核苷酸16，104的信號校正那些信號，并保存關于核苷酸16，104顯現的一份記錄，該記錄表示了核酸分子13，102的序列。該信息處理系統也可實施標準的程序，如背景信號的扣除，并且，當檢測到的是來自多個核苷酸16，104的有重疊的時間或空間信號時，可以使用“堿基調用(base-calling)”測定。
在一些實施方案中，核酸分子13，102可以連接到一個表面14，103，例如功能化玻璃、硅、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、銀或其他金屬涂蓋的表面、石英、塑料、PTFE(聚四氟乙烯)、PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、橡膠、尼龍、硝酸纖維素、玻璃珠、磁珠或者本領域已知的能在其表面整合上氨基、羧基、硫醇、羥基或第爾斯-阿爾德(Diels-Alder)反應劑等功能性基團的其他任何材料。
在一些實施方案中，功能性基團可以共價連接到交聯劑上，以便核酸分子13，102與解構試劑15，106之間的結合反應能夠在沒有位阻的情況下發生。典型的交聯基團包括乙二醇寡聚物和二胺。連接可以是共價或非共價的結合。將核酸分子13，102連接到表面14，103的各種方法在本領域是已知的，并且可以加以利用。
定義在這里所使用的“一個(‘a’或‘an’)”可以表示某個物件(item)的一個或者多于一個。
“核酸”13，102可以是DNA或RNA，可以是單鏈的、雙鏈的或三鏈的，也可以是它們經過化學修飾的形式，盡管單鏈核酸13，102是優選的。事實上，可以考慮對核酸13，102作出任何修飾。在這里所使用的單鏈核酸13，102可以用前綴“ss”表示，雙鏈核酸13，102可以用前綴“ds”表示，三鏈核酸13，102可以用前綴“ts”表示。
“核酸”13，102幾乎可以是任何長度，它的堿基數可以是10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、75000、100000、150000、200000、500000、1000000、1500000、2000000、5000000或者甚至更多，直到全長染色體DNA分子13，102。
“核苷”16，104是含有一個堿基(A、T、G、C或U)的分子，這些堿基共價連接到戊糖如脫氧核糖、核糖、或者戊糖的衍生物或同型物(analogs)。
“核苷酸”16，104是指進一步包括至少一個磷酸基團共價連接到其戊糖上的核苷。在一些實施方案中，核苷酸16，104是核糖核苷一磷酸16，104或脫氧核糖核苷一磷酸16，104，盡管在一些實施方案中，可以預料得到的是核苷二磷酸或三磷酸16，104。在其他實施方案中，核苷16，104可從核酸分子13，102上釋放出來，并按下面討論的方法檢測。可以考慮對核苷酸16，104的結構作各種取代和修飾，只要它們仍然能夠通過解構試劑15，106從核酸13，102上釋放出來。例如，在某些實施方案中，核糖或脫氧核糖部分可以用其他的戊糖或戊糖同型物(analog)取代。在其他的實施方案中，磷酸基團可以用各種同型物取代。
核酸將被測序的核酸分子13，102可以用本領域已知的任何技術來制備。在一些實施方案中，核酸分子13，102是自然發生的DNA或RNA分子。事實上，可以使用已公開的方法來制備和序列測定任何自然發生的核酸13，102，包括但不限于染色體DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA，和核糖體RNA、轉運RNA、不均一核RNA或信使RNA。
用于制備和分離各種形式的細胞內核酸13，102的方法是已知的。(見，例如，Guide to Molecular Cloning Techniques，eds.Berger andKimmel，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular CloningALaboratory Manual，2ndEd.，eds.Sambrook，Fritsch and Maniatis，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。一般地，含有待測序的核酸13，102的細胞、組織或其他源材料首先要被勻漿化，例如在液氮中冷凍，然后在研缽里用磨棒研磨。某些組織可以用韋林氏攪切器(Waring blender)、維爾第斯勻漿器(Virtis homogenizer)、杜恩斯勻漿器(Dounce homogenizer)或其他勻漿器勻漿化。粗制的勻漿可以用去污劑提取，如十二烷基磺酸鈉(SDS)、Triton X-100、CHAPS(3-[(3-膽胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸酯)、辛基葡糖苷(octylglucoside)或本領域已知的其他去污劑。可選擇或者可作為補充的是，可以使用促溶劑如異硫氰酸胍或有機溶劑如苯酚進行提取。在一些實施例中，可以通過蛋白酶處理來降解細胞蛋白，例如使用蛋白酶K。顆粒污染物可以通過離心或超高速離心來去除(例如，大約5000到10000×g離心10到30分鐘，或者50000到100000×g離心30到60分鐘)。在低離子強度的含水緩沖液中進行透析可以除去鹽或其他可溶性污染物。在-20℃加入乙醇，或者加入醋酸鈉(pH6.5，約0.3M)和0.8倍體積的2-丙醇，可以將核酸13沉淀。沉淀的核酸13，102可以通過離心被收集，或者，對于沉淀下來的染色體DNA，可以將其纏繞在玻璃吸管或其它探頭上。
本領域技術人員會明白，上面所列的步驟僅僅是示例性的。取決于將被測序的核酸13，102的特定類型，可以作出許多變化。例如，線粒體DNA 13，102常常是通過采用不連續梯度的氯化銫密度梯度離心來制備，而mRNA 13，102則常常是用商業來源的制備柱來制備，這些商業來源例如Promega(Madison，WI)或Clontech(Palo Alto，CA)。這些變化在本領域是已知的。
技術人員會明白，取決于所制備的模板核酸13，102的類型，可以使用各種核酸酶抑制物。例如，通過用焦碳酸二乙酯(DEPC)進行處理，可以去除儲液中的核糖核酸酶(RNase)污染。商業上可獲得的核酸酶抑制物可以有標準的來源，如Promega(Madison，WI)或BRL(Gaithersburg，MD)。純化的核酸13，102可以溶解在含水緩沖液中，如TE(Tris-EDTA)(乙二胺四乙酸)，然后在使用前貯存在-20℃或液氮中。
如果要被測序的是單鏈DNA(ssDNA)13，102，可以按標準方法由雙鏈DNA(dsDNA)制備ssDNA 13，102。最簡單的是，加熱dsDNA至它的退火溫度(在該溫度，dsDNA自發分離為ssDNA 13，102)以上。典型的條件可能涉及在92到95℃加熱5分鐘或更長時間。用于確定分離dsDNA的條件的公式，例如基于GC含量和分子長度的公式，在本領域是已知的。作為選擇，單鏈DNA 13，102可以用本領域已知的標準擴增技術由雙鏈DNA制得，即使用僅結合雙鏈DNA的一條鏈的引物。制備單鏈DNA 13，102的其他方法在本領域是已知的，例如將待測序的雙鏈核酸插入復制態的噬菌體如M13中，然后讓噬菌體產生核酸13，102的單鏈拷貝。
盡管某些實施方案涉及自然發生的核酸13，102的制備，而事實上，能夠用作外切核酸酶或其他解構試劑15，106的底物的任何類型核酸13，102都可以被測序。例如，用各種擴增技術如聚合酶鏈式反應(PCRTM)擴增制得的核酸13，102可以被測序。(見美國專利號4,683,195、4,683,202和4,800,159。)作為選擇，待測序的核酸13，102可以用標準載體克隆，標準載體如質粒、粘粒、BACs(細菌人工染色體)或YACs(酵母人工染色體)。(見，例如，Berger and Kimmel，1987；Sambrook et al.，1989。)核酸插入物13，102可以從載體DNA中分離，例如，用合適的限制性內切核酸酶切割，然后進行瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色。將具有所需大小的核酸13，102片段從膠中取出，例如，使用低熔點瓊脂糖，或從膠塊中電洗脫。插入核酸13，102的分離方法在本領域是已知的。
單個核酸分子的分離在某些實施方案中，待測序的核酸分子13，102是ssDNA或ssRNA的單個分子。為了收集和操作單個ssDNA或ssRNA分子13，102，可以使用各種方法，如流體動力學聚焦(hydrodynamic focusing)、微操縱器偶聯(micro-manipulator coupling)、光捕獲、或這些方法的組合和類似的方法。(見，例如，Goodwin et al.，1996，Acc.Chem.Res.29607-619；美國專利號4,962,037；5,405,747；5,776,674；6,136,543；6,225,068。)在某些實施方案中，可以應用微流體學或超微流體學來分選和分離模板核酸13，102。可以運用流體動力學來操縱核酸13，102的運動，使其進入一個微通道、微毛細管或微孔。在一個實施方案中，可以使用液體動力來移動核酸分子13，102通過一個梳狀結構，從而分離出單個核酸分子13，102。一旦核酸分子13，102被分離開，就可以使用流力聚焦將這些分子13，102定位在反應室11，101內。熱學或電學上的勢差、一定的壓力或真空也都可用來提供操作核酸13，102所需的驅動力。在典型的實施方案中，為了測序而對模板核酸13，102進行的操作可能涉及到使用一種砌塊(channel block)設計，它整合了微構造的通道和一體化的膠質材料。這個設計公開在美國專利號5,867,266和6,214,246。
在另一個實施方案中，含有核酸分子13，102的樣品可以在偶聯到一個固定化表面14，103之前被稀釋。在典型的實施方案中，固定化表面14，103可能是磁性或非磁性微珠(beads)的形式，或是其他離散的結構單元。經過適當的稀釋，每個微珠14，103具有結合零個或一個核酸分子13，102的統計概率。連接有一個核酸分子13，102的微珠14，103可以用例如熒光染料和流式細胞儀篩選或磁性篩選的方法來判定。取決于微珠14，103和核酸13，102的相對大小和均一性，可能使用一個磁過濾器和質量分離法來分離含有一個結合核酸分子13，102的微珠14，103。在其他實施方案中，連接到單個微珠或其他固定化表面14，103的多個核酸13，102可以被測序。
在可選擇的實施方案中，可以使用一個有涂層的光纖末梢(coatedfiber tip)14，103來獲得用于測序的單個核酸分子13(例如，美國專利號6,225,068)。在其他可選擇的實施方案中，可以制備含有抗生物素蛋白或其他交聯劑的單個分子的固定化表面14，103。這樣的表面14，103能夠連接將被測序的生物素化核酸的單個分子13，102。這個實施方案不限于抗生物素蛋白-生物素結合體系，而適用于本領域已知的任何偶聯體系。
在其他可選擇的實施方案中，可以使用光捕獲來操縱用于測序的核酸的單個分子13，102。(例如，美國專利號5,776,674)。典型的光捕獲系統可以在商業上從Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)、S+LGmbH(Heidelberg，Germany)和P.A.L.M Gmbh(Wolfratshausen，Germany)獲得。
固定化的方法在各種實施方案中，待測序的核酸分子13，102可以連接(或固定)到一固體表面14，103。核酸分子13，102的固定化可以用各種方法來實現，這些方法涉及核酸分子13，102和表面14，103之間的非共價或共價連接。在一個典型的實施方案中，固定化可以通過這樣的方法完成，即用鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆一個表面14，103，接著進行生物素化核酸13，102的連接(Holmstrom et al.，Anal.Biochem.209278-283，1993)。固定化亦可這樣實現，即用聚L-Lys(賴氨酸)或聚L-Lys，Phe(苯丙氨酸)包覆硅、玻璃或其他表面14，103，接著用雙功能交聯劑共價連接氨基或巰基修飾的核酸13，102(Running et al.，Bio Techniques 8276-277，1990；Newton et al.，Nucleic Acids Res.211155-62，1993)。可以通過使用氨基硅烷將胺基引入到表面14，103上以供交聯使用。
可以將5’-磷酸化核酸13，102直接共價連接到化學修飾的表面14，103，從而實現固定化(Rasmussen et al.，Anal.Biochem.198138-142，1991)。核酸13，102與表面14，103之間的共價鍵通過與水溶性碳二亞胺的縮合而形成。這種方法方便了核酸13，102通過其5’-磷酸基團進行有效的5’-連接。
要將DNA 13，102結合到玻璃上，通常要先對玻璃表面14，103進行硅烷化，然后用碳二亞胺或戊二醛活化。在作為選擇的步驟中可以使用的試劑例如3-環氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，DNA 13，102通過整合到其3’或5’端的氨基接頭(linkers)來聯接。通過紫外輻射可以將DNA 13，102直接結合到膜表面14，103。核酸13，102固定化技術的其他非限制性實例公開在美國專利號5,610,287，5,776,674和6,225,068。
可用于核酸13，102的固定化的表面14，103類型是不受限的。在各種實施方案中，固定化表面14，103可以是磁性珠、非磁性珠、一個平表面、一個點狀表面，或其他包含幾乎任何材料的任何形狀的固體表面，只要該材料是足夠持久耐用的，并且是惰性的，能夠允許核酸13，102的測序反應發生。可以使用的表面14，103的非限制性的例子包括玻璃、硅土、硅酸鹽、聚二甲基硅烷(PDMS)、銀或其他金屬包覆的表面、硝酸纖維素、尼龍、活化的石英、活化的玻璃、聚二氟偏二乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、其他聚合物如聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或聚二甲基硅氧烷和光敏聚合物，光敏聚合物含有光反應物質如氮賓、卡賓和能與核酸分子13，102形成共價連接的羰自由基(見美國專利號5,405,766和5,986,076)。
雙功能交聯劑可以在各種實施方案中被使用，例如連接核酸分子13，102到一個表面14，103。可以根據雙功能交聯劑的功能基團的特異性將它們劃分，例如氨基、胍基、吲哚或羧基特異性基團。其中，針對自由氨基的試劑更受歡迎，因為它們在商業上可以獲得、合成簡便，而且能夠在溫和的反應條件下應用它們。用于交聯分子的典型方法公開在美國專利號5,603,872和5,401,511。交聯劑包括戊二醛(GAD)、雙功能環氧乙烷(OXR)、乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)和碳二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)。
解構試劑測序反應涉及到將解構試劑15，106結合到核酸分子13，102的自由端17，105，每一次移去一個核苷酸16，104。在某些實施方案中，反應可由酶來催化，如外切核酸酶15，106。實施方案并不限制可以使用的外切核酸酶15，106的類型。可能用到的外切核酸酶15，106的非限制性的例子包括E.coli外切核酸酶I、III、V或VII，Bal 31外切核酸酶、綠豆外切核酸酶、S1核酸酶、E.coli DNA聚合酶I全酶或Klenow片段酶、RecJ、外切核酸酶T、T4或T7 DNA聚合酶、Taq聚合酶、外切核酸酶T7基因6、蛇毒磷酸二酯酶、脾磷酸二酯酶、海濱熱球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶、熱球菌屬(Pyrococcus sp.)GB-D DNA聚合酶、λ(lambda)外切核酸酶、S.aureus微球(micrococcal)核酸酶、脫氧核糖核酸酶(DNase)I、核糖核酸酶A、T1微球核酸酶或本領域已知的其他外切核酸酶。外切核酸酶15，106可以由商業來源獲得，如New England Biolabs(Beverly，MA)、Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、Sigma Chemicals(St.Louis，MO)或Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。
技術人員會明白，具有外切核酸酶15，106活性的酶有各種各樣的性質，例如，它們能從核酸分子13，102的5’端、3’端或任意一端移去核苷酸16，104。它們可能對RNA、DNA或兩者具有特異性。它們的活性可能依賴于單鏈或雙鏈核酸13，102的使用。它們會不同程度的受到反應介質的各種因素(如鹽、溫度、pH或二價陽離子)的影響。各種外切核酸酶和聚合酶15，106的這些及其他的性質在本領域是已知的。
技術人員會明白，可以操縱外切核酸酶15，106的活力，以與檢測單元18，107對核苷酸16，104的最佳分析速率相吻合。用于調整外切核酸酶15，106的活力的各種方法是已知的，包括調整反應室11，101中的溫度、壓力、pH、鹽濃度或二價陽離子濃度。優化外切核酸酶15，106的活性的方法在本領域是已知的。
標記某些實施方案可以涉及將一標記整合進入核苷酸前體17，以方便檢測單元12對它們的測定。可以使用許多的不同標記，如拉曼標記、熒光團、生色團、放射性同位素、酶標記、抗體、化學發光劑、電發光劑、親和標記，等等。本領域技術人員會承認，這些標記及其他這里未提到的標記成分可以在該公開方法中使用。
在涉及拉曼光譜的實施方案中使用的標記如上所述。在其他實施方案中，可以使用的標記體可以是熒光團，如Alexa 350、Alexa 430、AMCA(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸)、BODIPY(5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸)630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL(熒光素)、BODIPY-R6G(6-羧基若丹明)、BODIPY-TMR(四甲基若丹明)、BODIPY-TRX(德克薩斯紅-X)、瀑布藍(CascadeBlue)、Cy2(青色素)、Cy3、Cy5，6-FAM(5-羧基熒光素)、熒光素、6-JOE(2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基熒光素)、俄勒岡綠(OregonGreen)488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、太平洋藍(Pacific Blue)、若丹明綠、若丹明紅、ROX(6-羧基-X-若丹明)、TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明)、四甲基若丹明和德克薩斯紅。熒光或發光標記可以由標準的商業來源獲得，例如Molecular Probes(Eugene，OR)。
反應室反應室11，101被設計用來盛放水溶液中的固定化表面14，103、核酸分子13，102、解構試劑15，106和核苷酸16，104。在一些實施方案中，反應室11，101被設計成可控溫的，例如整合進帕爾帖元件(Pelletierelements)或使用本領域已知的其他方法。用于控制小體積液體溫度的方法屬于已知技術。(見，例如，美國專利號5,038,853，5,919,622，6,054,263和6,180,372。)在某些實施方案中，反應室11，101和任何與之聯系的液體通道都可以用批制造工藝來制造，如同在計算機芯片制造或微毛細管芯片制造領域中已知的情況。上述液體通道如流動通路12或通道，它們可提供與一個廢物口、一個核酸13，102加載口或一個解構試劑15，106來源的連接。在一些實施方案中，反應室11，101和該裝置10，100的其他組分如流動通路12可以制造為一個集成芯片。這樣的芯片可以用本領域已知的方法制造，如使用光平板印刷和蝕刻。然而，制造方法是不受限的，本領域已知的其他方法可以被使用，如激光切割、注塑、澆鑄或印刷技術。對于某些實施方案，可以使用用于超微電機械系統制造的方法。(見，例如，Craighead，Science 2901532-36，2000.)微細加工芯片可以在商業上獲得，來源如Caliper Technologies Inc.(MountainView，CA)和ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
在一個非限制性的實施方案中，可將Borofloat玻璃片(PrecisionGlass & Opitics，Santa Ana，CA)在濃HF(氫氟酸)中預蝕刻一小段時間，然后在等離子體增強化學氣相淀積(PECVD)系統(PEII-A，TechnicsWest，San Jose，CA)中一無定形硅犧牲層沉積之前清洗。晶片可以用六甲基二硅氮烷(HMDS)涂底，然后用感光性樹脂(Shipley 1818，Marlborough，MA)旋涂并烘烤軟化。可以使用接觸掩模對準器(QuintelCorp.San Jose，CA)將感光性樹脂層曝光于一種或多種掩模圖案，然后將曝光的感光性樹脂用Microposit developer concentrate(Shipley)和水除去。開發出來的晶片可以被烘烤硬化，然后在PECVD反應器中用CF4(四氟甲烷)除去曝光的無定形硅。可以用濃HF對晶片進行化學蝕刻以制造出反應室11，101、流動通路12和任何通道。剩余的感光樹脂可被剝去，無定形硅也可除去。
可以用金剛石打孔鉆頭(Crystalite，Westerville，OH)在蝕刻的晶片上鉆打出接入孔洞。在一個可編程的真空爐(Centurion VPM，J.M.Ney，Yucaipa，CA)中，將蝕刻和鉆孔的平板熱鍵到同樣尺寸的平晶片上，便可得到一個完成了的芯片。在某些實施方案中，芯片可以通過將兩塊蝕刻平板結合在一起而制得。整合有一個反應室11，101和流動通路12的芯片的可以選擇的典型加工方法公開在美國專利號5,867,266和6,214,246。
為了便于檢測單元18，107對核苷酸16，104進行檢測，反應室11，101和/或流動通路12的材料對于檢測單元18，107使用的激發和發射頻率處的電磁輻射而言，可以是可透過的。玻璃、硅以及在被拉曼光譜、熒光光譜、發光光譜或其他形式的光譜使用的頻率范圍內通常是具有可透性的其他任何材料都可以被使用。在一些實施方案中，與檢測單元18，107相背的反應室11，101和/或流動通路12表面可以用銀、金、鉑、銅、鋁或對于檢測單元18，107相對不透光的其他材料覆蓋。在那種情況下，不透光材料可以用來增強拉曼或其他信號，例如使用表面增強拉曼光譜，而且不會干擾檢測單元18，107的功能。可選擇的是，包含有銀、金、鉑、銅或鋁的網格可以放置在反應室11，101和/或流動通路12內。技術人員會意識到，在涉及流動通路12的實施方案中，核苷酸16通常是在它們處于流動通路12中時被檢測。在沒有流動通路12的實施方案中，核苷酸104是在反應室101中被檢測。
在各種實施方案中，反應室11，101的內部體積可以是約1皮升、約2皮升、約5皮升、約10皮升、約20皮升、約50皮升、約100皮升、約250皮升、約500皮升、約1納升、約2納升、約5納升、約10納升、約20納升、約50納升、約100納升、約250納升、約500納升、約1微升、約2微升、約5微升、約10微升、約20微升、約50微升、約100微升、約250微升、約500微升或約1毫升。
流動通路在某些實施方案中，自由核苷酸16沿著一個流動通路12移動并通過檢測單元18。用于運送自由核苷酸16的技術的非限制性實例包括微流體技術。流動通路12可包含一個微毛細管(例如，從ACLARABioSciences Inc.，Mountain View，CA獲得)或一個液相集成電路(例如，Caliper Technologies Inc.，Mountain View，CA)。這樣的微流體平臺只需要幾納升的樣品。
在某些實施方案中，將被檢測的自由核苷酸16通過溶劑的整體流動沿著流動通路12運動。在其他實施方案中，可以使用微毛細管電泳運送自由核苷酸16，使它們沿著流動通路12運動并通過檢測單元18。微毛細管電泳通常涉及使用很細的毛細管或通道，其中可以充有或不充有特定的分離介質。帶有適當電荷的物質可以在施加的電場作用下發生電泳，例如當裝置的反應室11一側和檢測單元18一側分別加上負電和正電時，帶負電的核苷酸16便會發生電泳。盡管電泳常常是用來對同時加到微毛細管中的混合組分進行大小分離，但是它也可以用來運送先后加入到流動通路12的大小類似的核苷酸16。因為嘌呤核苷酸(A、G)16比嘧啶核苷酸(C、T、U)16大，所以前者遷移得更慢，這樣的話，流動通路12的長度和對應的通過檢測單元18的時間應該盡量小，以防止有差異的遷移將核酸13上核苷酸16的釋放次序混淆起來。作為選擇，可以對填充在微毛細管中的分離介質進行選擇，由此使嘌呤和嘧啶核苷酸16以相近或相同的遷移速率沿著流動通路12運動。微毛細管電泳方法已經被公開，例如Woolley and Mathies(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111348-352，1994)。
包括微毛細管電泳器件在內的微流體器件的微加工已經被討論，例如，Jacobsen等(Anal.Biochem，209278-283，1994)；Effenhauser等(Anal.Chem.662949-2953，1994)；Harrison等(Science261895-897，1993)和美國專利號5,904,824。典型地，這些方法包括在石英、硅或其他晶體襯底或基片上用照相平版印刷法蝕刻出微米級通道，這些方法很具有適用性。在一些實施方案中，微毛細管可以用制造反應室11，101時所用的同種聚合材料來加工，其中使用注塑或本領域已知的其他技術。
檢測單元涉及拉曼光譜的實施方案在一些實施方案中，檢測單元18，107被設計成利用拉曼光譜學對核苷酸16，104進行檢測和定量。利用拉曼光譜學檢測核苷酸16，104的各種方法在本領域是已知的。(見，例如，美國專利號5,306,403；6,002,471；6,174,677)。關于表面增強拉曼光譜(SERS)或表面增強共振拉曼光譜(SERRS)的變化已經公開。在SERS和SERRS中，對于吸附在粗糙金屬表面如銀、金、鉑、銅或鋁表面上的分子，拉曼檢測的靈敏度可提高106或更多倍數。
拉曼檢測單元18，107的一個非限制性的實施方案公開在美國專利號6,002,471。在這個實施方案中，激發光束20，110由釹:釔鋁石榴石(Nd:YAG)激光器19，108產生，波長為532nm；或者由鈦:藍寶石(Ti:sapphire)激光器19，108產生，波長為365nm。可以使用脈沖激光束20，110或連續激光束20，110。激發光束20，110經過共聚焦光學元件和顯微物鏡，然后聚焦在流動通路12或反應室101上。來自核苷酸16，104的拉曼發射光由顯微物鏡和共聚焦光學元件收集，然后偶聯到單色儀上進行光譜分離。共聚焦光學元件用作降低背景信號，包括雙色濾片、二次濾片、共聚焦孔、透鏡和平面鏡。標準的全視場光學元件可以同共聚焦光學元件一起使用。拉曼發射信號由拉曼檢測器21，109檢測。該檢測器21，109包括與一臺用于信號計數和數字化的計算機相連接的雪崩光電二極管。在某些實施方案中，在流動通路12或反應室101中放置了包含有銀、金、鉑、銅或鋁的網格，這樣便會因表面增強拉曼或表面增強拉曼共振而得到增強的信號。
已公開的可供選擇的檢測單元18，107的實施方案如美國專利號5,306,403，其中包括了Spex Model 1403雙柵分光光度計21，109，并配有砷化鎵光電倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries ModelC3103402)，它以單光子計數模式運作。激發源19，108是來自SpectraPhysics的514.5nm線氬離子激光器19，108，Model 166，和氪離子激光器19，108(Innova 70，Coherent)的647.1nm線。
作為選擇的激發源19，108包括337nm的氮激光器19，108(LaserScience Inc.)和325nm的氦-鎘激光器19，108(Liconox)(美國專利號6,174,677)。激發光束20，110經過帶通濾波器(Corion)處理成為單色光，然后該光束可以用6×接物透鏡(Newport，Model L6×)聚焦到流動通路12或反應室101上。可以用接物透鏡來激發核苷酸16，104和收集拉曼信號，其中使用到全息光束分離器(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)，以對激發光束20，110和發射的拉曼信號進行直角解析。可以使用全息階式濾波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)來減少瑞利散射。作為選擇的拉曼檢測器21，109包括ISA HR-320光譜攝制儀，配有紅增強放大電荷耦合器件(RE-ICCD)檢測系統(Princeton Instruments)。可以使用其他類型的檢測器21，109，如電荷注入元件、光電二極管陣列或光電晶體管陣列。
本領域已知的任何具有適當形式或結構的拉曼光譜或相關技術都可以用來檢測核苷酸16，104，包括但不限于常規拉曼散射、共振拉曼散射、表面增強拉曼散射、表面增強共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)、受激拉曼散射、反拉曼光譜、受激獲得拉曼光譜、超拉曼散射、分子光學激光檢測器(MOLE)或拉曼顯微探針或拉曼顯微鏡或共聚焦拉曼微光譜測定法、三維或掃描拉曼、拉曼飽和光譜學、時間分辨共振拉曼、拉曼退耦光譜學或紫外-拉曼顯微鏡。
涉及FRET的實施方案在某些作為選擇的實施例中，核苷酸16，104可以用熒光共振能量轉移(FRET)來確定和定量。FRET是一種可用來檢測檢測一個供體分子(donor molecule)和一個受體分子(acceptor molecule)之間距離的光譜學現象。所選擇的供體和受體對應該滿足供體的熒光發射與受體的激發光譜有重疊。在兩個分子結合在一起時(距離少于100埃)，供體的激發態能量非輻射地轉移給受體，同時供體的發射淬滅。假如受體分子是一個熒光團，那么它的發射會增強。用于關于寡聚核苷酸的FRET的組合物和方法在本領域是已知的(例如，美國專利號5,866,366)。
常被用作FRET的標記的分子包括熒光素、5-羧基熒光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、若丹明、6-羧基若丹明(R6G)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、4-(4’-二甲基氨基苯氮)安息香酸(DABCYL)和5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酰酸(EDANS)。其他可能的FRET供體和受體分子在本領域是已知的(見美國專利號5,866,336，表1)。技術人員能熟悉地選擇用于FRET的成對標記分子(美國專利號5,866,336)。
在涉及FRET的實施方案中，供體和受體分子可以共價或非共價地連接到測序裝置10，100的各種組分上。在某些實施方案中，供體和受體分子可以連接到核苷酸16，104、外切核酸酶15，106或流動通路12。
在一些實施方案中，供體分子可以連接到外切核酸酶15，106或流動通路12的表面，而受體分子連接到核苷酸16，104上。在這種情況下，每種核苷酸16，104應該連接到具有可區分的發射光譜的一種受體分子上，而選擇的供體分子應該具有寬范圍的發射光譜，該光譜范圍能夠覆蓋所有四種受體分子的激發光譜。在外切核酸酶15，106或流動通路12上可以存在多個供體分子，盡管在其他實施例中可以只有一個供體分子。
一受到激發，供體分子將把它們的能量轉移給連接在核苷酸16，104上的受體標記分子，并由此得到來自受體分子的增強的發射信號。因為信號增強的程度會隨距離增大迅速降低，所以對于距離供體分子非常近的核苷酸16，204，會有最大的信號增強出現。如果一個供體分子連接到外切核酸酶15，106的催化位點，或靠近催化位點，那么具有最強發射信號的核苷酸16，104將是那些位于外切核酸酶15，106的催化位點的核苷酸16，104。供體分子的連接位置應該靠近催化位點，但是在這個位置它不能干擾解構試劑15，106的外切核酸酶活性。在某些實施方案中，供體分子連接到流動通路12的表面，并且連接位置是激發光束20的聚焦處，這樣，只有那些位于激發光束20的焦點內的核苷酸16能夠給出可檢測的熒光信號。可以選擇激發光束20，110的波長來最大程度的激發供體分子，而較弱地激發受體分子。當每個核苷酸16，104從核酸分子13，102上移去時，就可檢測到來自供體標記的信號。
在某些實施方案中，可以使用本領域已知的方法將待測序的核酸分子13，102放置在一個熒光顯微鏡的視場內，例如通過使用光捕獲(例如，美國專利號6,136,543)。可以使用的熒光顯微鏡的非限制性的例子是反式相襯和入射光熒光顯微鏡(IMT2-RFC，Olympus Co.，Ltd.)，其中使用了100倍油鏡(Plan.Multidot.Apochromat.Times.100，1.40 NA，Olympus Co.，Ltd.)。如上所述，激發光束20，110可由激光器19，108發出。熒光發射可以通過接物透鏡并使用合適的濾片來收集，然后由靈敏的熒光檢測器21，109檢測，例如CCD器件、光電二極管、光電倍增管或等效物。
信息處理和控制系統及數據分析在某些實施方案中，核酸測序裝置10，100可以包含一個信息處理系統。實施方案并不限制所使用的信息處理系統的類型。一個典型的信息處理系統可以整合一臺含有用于信息交流的總線的計算機和一個用于信息處理的處理器。在一個實施方案中，處理器可以選自Pentium系列處理器，包括但不局限于Pentium II系列、Pentium III系列和Pentium 4系列處理器，它們可以Intel Corp.(Santa Clara，CA)獲得。在作為選擇的實施方案中，處理器可以是Celeron、Itanium或Pentium Xeon 處理器(Santa Clara，CA)。在各種其他實施例中，處理器可以基于Intel 結構，如Intel IA-32或Intel IA-64結構。作為選擇，可以使用其他處理器。
該計算機可以進一步包含一個隨機存儲器(RAM)或其他動態存儲器件、一個只讀存儲器(ROM)和/或其他靜態存儲器，以及一個數據存儲器件如磁盤或光盤和它們對應的驅動。該信息處理和控制系統也可包含本領域已知的其他外圍設備，如一個顯示器(如陰極射線管或液晶顯示器)、一個文字輸入設備(如鍵盤)、一個光標控制設備(如鼠標、跟蹤球或光標方向鍵)和一個通訊設備(如調制解調器、網絡接口卡或用于連接以太網、令牌網或其他類型網絡的接口設備)。
在特定的實施方案中，檢測單元18，107在操作上也可與信息處理系統連接。來自檢測單元18，107的數據可由處理器處理，然后數據儲存在主存儲器。關于標準核苷酸16，104的發射剖圖的數據也可儲存在主存儲器或ROM中。處理器可以比較反應室101或流動通路12中核苷酸16，104的發射光譜，以確定從核酸分子13，102上釋放的核苷酸16，104的類型。主存儲器也可以儲存從核酸分子13，102上釋放的核苷酸16，104的順序。處理器可以分析這些來自檢測單元18，107的數據，以確定核酸13，102的序列。可以考慮在某些實施過程中使用一個不同配置的信息處理系統。所以，在不同的實施方案中系統的結構可以不同。
應該注意到，在作為選擇的實施方案中，當這里所述的處理過程在一個程序控制的處理器的控制下進行時，該處理可以完全或部分的由可編程或硬編碼邏輯來實施，例如現場可編程門陣列(FPGAs)、TTL邏輯或專用集成電路(ASICs)。另外，可以通過程序控制的通用計算機組分和/或客戶硬件組分的任意組合來實施被公開的方法。
在數據收集操作之后，數據通常會被報告給一個數據分析操作。為了方便分析操作，由檢測單元18，109獲得的數據通常是使用一臺數字計算機來分析，如上所述。典型地，計算機被恰當地編程以接受和存儲由檢測單元18，109獲得的數據，以及分析和報告收集到的數據。
在某些實施方案中，可以使用客戶定制軟件包來分析由檢測單元18，109獲得的數據。在作為選擇的實施方案中，可以使用信息處理系統及可公開利用的軟件包來實施數據分析。可用于DNA序列分析的軟件的非限制性的例子包括PRISMTMDNA測序分析軟件(AppliedBiosystems，Foster City，CA)、SequencherTM軟件包(Gene Codes，AnnArbor，MI)和通過國家生物技術信息機構獲得的各種軟件包，網址為www.nbif.org/links/1.4.1.php。
權利要求
1.一種裝置，包括a)含有固定化表面的反應室，該固定化表面連接著單個核酸分子；b)與反應室相連的流動通路；和c)檢測單元，含括激發源和拉曼光譜檢測器。
2.權利要求1的裝置，其中激發源是激光器。
3.權利要求1的裝置，其中拉曼檢測器是分光計或單色儀。
4.權利要求1的裝置，進一步包括(i)信息處理系統；和(ii)數據庫。
5.權利要求1的裝置，其中固定化表面是磁珠、非磁性珠、圓錐形表面、平表面或曲表面。
6.權利要求1的裝置，其中流動通路包括微毛細管或芯片中的一個或多個微通道。
7.權利要求1的裝置，其中流動通路的一部分被銀、金、鉑、銅或鋁包覆。
8.權利要求1的裝置，其中流動通路含有銀、金、鉑、銅或鋁網格。
9.權利要求1的裝置，進一步包括解構試劑。
10.一種裝置，包括a)含有固定化表面的反應室，該固定化表面連接著單個核酸分子；和b)檢測單元，包括激發源和拉曼光譜檢測器。
11.權利要求10的裝置，進一步包括(i)信息處理系統；和(ii)數據庫。
12.權利要求10的裝置，其中激發源是激光器。
13.權利要求10的裝置，其中拉曼檢測器是分光計或單色儀。
14.權利要求10的裝置，其中固定化表面是磁珠、非磁性珠、圓錐形表面、平表面或曲表面。
15.權利要求10的裝置，反應室中進一步含有銀、金、鉑、銅或鋁網格。
16.權利要求10的裝置，進一步包括解構試劑。
17.一種測定核酸序列的方法，包括a)制備單個模板分子，在反應室中該核酸分子的一端連接到固定化表面；b)從核酸分子的未連接端按順序地移去核苷酸；c)將核苷酸與核酸分子分離開；和d)利用拉曼光譜學檢測核苷酸。
18.權利要求17的方法，其中利用外切核酸酶活性從核酸分子的未連接端移去核苷酸。
19.權利要求17的方法，其中在核苷酸從核酸分子上移走之后，每個核苷酸被連接上一個標記分子。
20.權利要求17的方法，其中利用表面增強拉曼散射、表面增強共振拉曼散射、受激拉曼散射、反拉曼、受激獲得拉曼光譜學、超拉曼散射或相干反斯托克斯拉曼散射來檢測核苷酸。
21.一種測定核酸序列的方法，包括a)制備單個模板分子，在反應室中該核酸分子的一端連接到固定化表面；b)從核酸分子的未連接端按順序地移去核苷酸；c)利用拉曼光譜學對反應室中的核苷酸進行定量。
22.權利要求21的方法，其中利用外切核酸酶活性從核酸分子的未連接端移去核苷酸。
23.權利要求21的方法，其中在核苷酸從核酸分子上移走之后，每個核苷酸被連接上一個標記分子。
24.權利要求21的方法，其中利用表面增強拉曼散射、表面增強共振拉曼散射、受激拉曼散射、反拉曼、受激獲得拉曼光譜學、超拉曼散射或相干反斯托克斯拉曼散射來檢測核苷酸。
25.一種測定核酸序列的方法，包括a)制備單個模板分子，在反應室中該核酸分子的一端連接到固定化表面；b)從核酸分子的未連接端按順序地移去核苷酸；和c)利用熒光共振能量轉移(FRET)光譜學檢測核苷酸。
26.權利要求25的方法，其中在核苷酸從核酸分子上移走之后，這些核苷酸被連接到受體分子上。
27.權利要求26的方法，其中利用外切核酸酶移去這些核苷酸。
28.權利要求27的方法，其中一個或多個供體分子連接到外切核酸酶上。
全文摘要
這里公開的方法、裝置和組合物是用于核酸序列測定。更具體地說，該方法和裝置涉及通過以下方法對單鏈DNA或RNA的單個分子進行測序，即將該分子暴露于外切核酸酶活性，每一次從核酸的一端移去一個自由核苷酸，然后利用拉曼光譜學或熒光共振能量轉移(FRET)確定被釋放的核苷酸。
文檔編號B01L3/00GK1556861SQ02818650
公開日2004年12月22日 申請日期2002年8月30日 優先權日2001年9月24日
發明者V·拉奧, G·紐鮑爾, S·柯奇, M·山川, A·伯林, V 拉奧 申請人:英特爾公司