專利名稱：用于毛細管電泳的高速高分辨率組合物、方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于由毛細管電泳分離分析物的組合物、毛細管電泳元件和方法。也提供用于由毛細管電泳分離分析物的試劑盒。
背景技術：
由于如下幾項技術優點，毛細管電泳已經廣泛用作分析技術(i)毛細管具有高表面積對體積比，它允許更有效的熱耗散，該熱耗散因此允許使用高電場用于更快速的分離；(ii)該技術要求最小的樣品體積；(iii)可獲得大多數分析物的優異分辨率；和(iv)該技術易于自動化，參見，如Camilleri，編輯，毛細管電泳理論和實踐(CRC Press，BocaRaton，1993)；和Grossman等人，編輯，毛細管電泳(Academic Press，圣地亞哥，1992)。由于這些優點，因此，人們的極大興趣在于應用毛細管電泳以分離生物分子，特別是核酸。核酸，特別是脫氧核糖核酸(DNA)的快速和精確分離的需要引起聚合酶鏈反應(PCR)產物的分析和DNA測序，參見，如Williams，方法酶學方法中的陪伴，4227-232(1992)；Drossman等人，Anal.Chem.，62900-903(1990)；Huang等人，Anal.Chem.642149-2154(1992)；和Swerdlow等人，核酸研究，181415-1419(1990)。
由于在游離溶液中，對于不同大小的多核苷酸，電荷對摩擦拖動比相同，因此多核苷酸的電泳分離典型地包括篩分介質。初始選擇的篩分介質典型地是交聯的凝膠，但在一些情況下穩定性和制造性的問題導致如下非凝膠液體聚合物篩分介質的檢驗如線性聚丙烯酰胺、羥烷基纖維素、瓊脂糖、和乙酸纖維素等，如Bode，Anal.Biochem.，83204-210(1977)；Bode，Anal.Biochem.，83364-371(1977)；Bode，Anal.Biochem.，9299-110(1979)；Hjerten等人，J.LiquidChromatography，122471-2477(1989)；Grossman，U.S.專利5,126,021；Zhu等人，U.S.專利5,089,111；Tietz等人，電泳，13614-616(1992)。
可使由毛細管電泳的分離復雜化的另一種因素是電內滲現象。此現象，有時稱為電滲透或電滲流(EOF)，是在毛細管中由電場誘導的流體流動。此現象阻礙毛細管電泳對如下狀態的應用其中典型地追求高分辨率分離，如在DNA測序片段的分析中。當毛細管內壁包含固定電荷時，該現象可引起毛細管電泳。這樣的電荷可引起反荷離子移動層的形成，該移動層的形成依次，在電場存在下移動以產生液體的總體流動。令人遺憾的是，EOF的數量可依賴于多種因素的主體而變化，包括電荷分布的變化、分析物組分和/或分離介質的選擇性吸附、分離介質的pH等。由于可變性可降低人們接近地解析間隔分析物譜帶的能力，已經進行許多嘗試以直接或間接控制這樣的流動。這些嘗試包括毛細管內壁的共價涂敷或改性以抑制帶電基團，高粘度聚合物的使用，緩沖劑pH和/或濃度的調節，用于共價涂敷毛細管壁的凝膠分離介質的使用，和對向毛細管軸為徑向的電場的施加。
目前，通常使用預涂敷的毛細管進行核酸片段的毛細管電泳。預涂敷的毛細管一般制造昂貴，具有有限的壽命，并有可經受再生性的問題。對于采用大規模毛細管電泳使用并聯運行的多個毛細管，這些問題是特別重要的。
發明內容
本發明提供用于分離樣品中分析物的組合物。例如，DNA測序片段或其它多核苷酸片段的單堿基分辨。提供的所述組合物含有包括至少一種低粘度、高分子量、非交聯的丙烯酰胺聚合物的篩分組分；和非必要地，包括至少一種非交聯的聚合物的表面相互作用組分。在優選的實施方案中，組合物并不包括交聯的聚合物凝膠。
另一方面，本發明包括毛細管電泳元件。毛細管電泳元件包括向其中插入用于分離分析物的組合物的未涂敷毛細管。位于毛細管中的組合物含有篩分組分和表面相互作用組分。
在另一方面，提供一種方法，其中本發明的組合物用于由毛細管電泳分離分析物。在某些實施方案中，本發明的方法使用多個未涂敷的毛細管或包含在此公開的新穎組合物的毛細管電泳元件并聯進行。
在另一方面，本發明提供含有低粘度、高分子量、非交聯的丙烯酰胺聚合物篩分組分而沒有與其使用的相互作用組分的組合物，和此外的預涂敷毛細管。預涂敷的毛細管，例如購自BioRad Life Sciences(BiocapXL毛細管，目錄no.148-3081)。毛細管也可以使用本領域公知的方法預涂敷。這樣的程序，例如，描述于Cobb等人，Anal.Chem.622478(1990)，和Grossman，U.S.專利No.5,347,527。
本發明也提供由毛細管電泳分離分析物的試劑盒。在某些實施方案中，試劑盒包括在此提供的一種組合物。也提供包括與一種或多種這些組合物或方法一起使用的未涂敷的毛細管的試劑盒。
圖1說明使用50℃的運行溫度和含有平均分子量大約為744,000道爾頓(Da)(0.75M)；1,376,000Da(1.4M)；2,015,000Da(2.0M)；2,517,000Da(2.5M)；或6,377,000Da(6.4M)的非交聯的丙烯酰胺聚合物篩分組分的組合物，由標記的多核苷酸分子量梯度物的毛細管電泳收集的單堿基分辨率數據。圖1A(上部)顯示單堿基分辨率對在核苷酸堿基中測量的片段大小的圖。圖示1B顯示以分鐘計的片段遷移時間對在核苷酸堿基中測量的片段大小的圖。
圖2說明使用圖1所述的相同五種組合物，但在60℃的運行溫度下由標記的多核苷酸梯度物的毛細管電泳收集的單堿基分辨率數據。圖2A(上部)顯示單堿基分辨率對在核苷酸堿基中測量的片段大小的圖。圖示2B顯示以分鐘計的片段遷移時間對在核苷酸堿基中測量的片段大小的圖。
圖3說明使用圖1所述的相同五種組合物，但在70℃的運行溫度下由標記的多核苷酸梯度物的毛細管電泳收集的單堿基分辨率數據。圖3A(上部)顯示單堿基分辨率對在核苷酸堿基中測量的片段大小的圖。圖示3B顯示以分鐘計的片段遷移時間對在核苷酸堿基中測量的片段大小的圖。
圖4說明使用含有在圖1中所述五種篩分組分的組合物，在50℃，60℃或70℃的運行溫度下觀察到的單堿基分辨率極限。此單堿基分辨率極限由圖1，2和3中所示的單堿基分辨率數據的目測觀察而預測。
具體實施例方式
定義“丙烯酰胺”和“丙烯酰胺單體”表示具有通式H2C＝CR-C(＝O)NR1R2的結構，其中R可以是-H或-CH3，R1和R2可以獨立地是-H、-CH3、-(CH2)xOH、-CH2CH(OH)(CH2)yOR3、-CH(CH2OH)CH(OH)CH3、-CH2CH2(OCH2CH2)p-OR3、-CH2CONH2、 或 R3可以獨立地是-H、-CH3或-CH2CH3。x和y的數值為1-3和p的數值為1-200。
“平均分子量”表示由具有分子量多重性的聚合物種組成的樣品種群的重均分子量(Mw)。此數量由如下公式定義Mw=(Σi=1ni×(Mi)2)/Σi=1ni×Mi]]>其中ni表示物種i分子的數目和Mi是第i物種的分子量。除非另外說明，在此使用的術語“分子量”表示重均分子量。
在此使用的術語“毛細管”表示用于進行電泳，即能夠支撐分離介質的體積，如在此公開的分離分析物的組合物的體積，管子或溝槽或其它結構。毛細管的幾何尺寸可以較寬地變化并包括，但不限于，具有圓形、矩形或正方形橫截面的管子、溝槽、凹槽、板等，和可以由寬范圍的技術制造。用于與本發明某些實施方案一起使用的毛細管的重要特征是與分離介質體積接觸的表面的表面積對體積比。此比例的高數值典型地允許在電泳期間從分離介質的更好傳熱。優選，在某些實施方案中，采用約0.8-0.02μm-1的數值。這些數值相應于內徑為約5μm-約200μm的圓形橫截面的管狀毛細管的表面積對體積比。術語“未涂敷的毛細管”表示毛細管在引入本發明組合物之前是未涂敷的，即在使用之前未共價涂敷。在某些實施方案中，用于本發明的毛細管由如下物質組成二氧化硅、煅燒的二氧化硅、石英、硅酸鹽基玻璃如硼硅酸鹽玻璃、磷酸鹽玻璃、含氧化鋁的玻璃等或其它二氧化硅類似材料。在某些實施方案中，使用由塑料基材形成的毛細管。塑料基材可包括，例如，聚丙烯酸酯和聚烯烴，如LUCRYL(BASF，德國)、TPXTM(Matsui Plastics，Inc.，White Plains，NY)、TOPAS(Hoechst Celanese Corp.，Summit，NJ)、和ZEONOR(ZeonChemicals，Louisville，KY)。其中，溝槽毛細管塑料基材的描述可以在U.S.專利No.5,750,015中找到。
在此使用的術語“分離分析物的組合物”含有低粘度、高分子量篩分組分和非必要地，表面相互作用組分。這樣的組合物特別用于使用毛細管電泳在游離溶液中分離多核苷酸，或具有不同大小但具有相似或相同電荷-摩擦拖動比的其它生物分子。熟練的技術人員會理解電荷攜帶組分，或電解質典型地包括在這樣的組合物中。電荷攜帶組分通常是在恒定pH下保持分離介質的緩沖劑體系的一部分。分離分析物的組合物包含一種或多種非交聯的丙烯酰胺聚合物。
術語“DNA測序片段”表示產生用于獲得關于選擇的DNA目標序列的序列信息的DNA多核苷酸。這樣的片段可以由酶方式產生，如由Sanger二脫氧方法，或化學方式，如由Maxam和Gilbert方法。片段可源自單測序反應(如在二脫氧胞啶三磷酸酯存在下進行的二脫氧測序反應)，或來自多于一種測序反應(如來自四種不同的二脫氧測序反應，它包括合適標記的5’-引物以識別每個片段的3’-末端堿基)。
“聚合物”以它的傳統意義使用，表示由共價鍵結合在一起以形成鏈的更小單體或低聚物子單元組成的大分子。“均聚物”是僅由一種單體重復單元組成的聚合物。“共聚物”表示由兩種或多種單體重復單元組成的聚合物。線性聚合物由以一個連續長度鍵合在一起以形成聚合物分子的單體重復單元組成。支化聚合物類似于線性聚合物，但含有從沿主聚合物的各種支化點伸出的側鏈。星型聚合物類似于支化聚合物，區別在于多個鍘鏈從單一支化位置放射，導致星型或車輪和輪輻外觀。
交聯的聚合物包含，例如，在不是在它們末端的各點彼此共鍵結合的聚合物分子。交聯可以在聚合工藝期間在交聯劑存在下進行。在一些交聯程度下，已知為凝膠點，凝膠化發生。在凝膠點，可見凝膠或不溶性聚合物形成，并且體系傾向于損失流動性。此交聯的聚合物凝膠，它相應于交聯以形成宏觀分子的聚合物分子網絡的形成，甚至在高溫下不溶于所有的溶劑。丙烯酰胺聚合物和聚合物凝膠的討論可以在本領域已知的參考文獻中找到，例如Odian，聚合原理，第三版(WileyInterscience，1991)。
在此使用的術語“非交聯的丙烯酰胺聚合物”表示包括丙烯酰胺單體，含有或沒有支化的聚合物分子，但排除交聯在一起的聚合物分子。因此，非交聯的聚合物并不包含在不是它們末端各點鍵合的聚合物分子，并且在聚合期間并不進行凝膠化。
在此使用的術語“多核苷酸”表示天然或改性的核苷單體，包括雙和單股脫氧核糖核苷、核糖核苷、其α-異頭物形式等的線性聚合物。典型地，核苷單體由磷酸二酯鍵或其類似物鍵合以形成多核苷酸，然而，也設想肽核酸單體。在某些實施方案中，多核苷酸的大小為幾個單體單元，如20，到幾千個單體單元。除非另外說明，每當多核苷酸由字母順序，如“ATGCCTG”表示時，應理解核苷是從左到右為5’3’順序和“A”表示脫氧腺苷酸，“C”表示脫氧胞苷，“G”表示脫氧鳥苷，和“T”表示脫氧胸苷。磷酸二酯鍵的類似物包括磷酸硫醇酯、磷酸二硫醇酯、磷酸硒酯、磷酸二硒酯、苯胺磷酸硫醇酯(Phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(Phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等。
術語“單堿基分辨率”(R單堿基)表示來自大小差別為一個核苷酸的兩個多核苷酸片段的兩個峰之間的分辨率測量。單堿基分辨率可以使用如下公式數學確定
其中tn是長度為n個核苷酸的多核苷酸片段的遷移時間；tn+1是長度為n+1個核苷酸的多核苷酸片段的遷移時間；Wn是在來自長度為n個核苷酸的多核苷酸片段的峰的堿基處的全寬度；和Wn+1是在來自長度為n+1個核苷酸的多核苷酸片段的峰的堿基處的全寬度。“遷移時間”是核苷酸片段移動毛細管或微溝槽長度，即從注入點到檢測器的時間。
術語“單堿基分辨率極限”表示多核苷酸片段的大小，其中單堿基分辨率數值在特定系統中下降小于0.58。
示例性實施方案的詳細描述在此使用的分標題僅用于組織目的和不作為所述主題的限制。在此申請中引用的所有參考文獻清楚地引入作為參考，用于到相同程度的任何目的好像每個參考文獻特定和單獨引入作為參考。
在某些實施方案中，本發明提供含有低粘度、高分子量、非交聯的丙烯酰胺聚合物篩分組分的組合物。在其它實施方案中，組合物進一步含有表面相互作用組分，如聚二甲基丙烯酰胺(pDMA)。此外，本發明的組合物并不包括交聯的聚合物凝膠。提供通過使用新穎組合物，用于分析物，特別是多核苷酸序列的高速、高分辨率毛細管電泳的方法。也提供用于采用這些方法的試劑盒。
與已知電泳組合物相比，當用于公開的方法和電泳元件時，本發明組合物的一個益處在于分子量1,000,000Da-3.000.000Da的非交聯丙烯酰胺聚合物提供不可預料的優點。分子量小于約1,000,000Da的線性丙烯酰胺聚合物比本發明的組合物提供更差的分辨率。分子量大于約3.000.000Da的線性丙烯酰胺聚合物呈現粘度問題和難以調節，如插入毛細管中和從毛細管中取出。因此，本發明的組合物在25℃下的粘度小于10,000厘泊，優選小于5,000厘泊，和最優選小于600厘泊。非交聯的丙烯酰胺聚合物可包括，例如，線性聚合物如聚丙烯酰胺(LPA)、支化聚合物，和星型聚合物。
篩分組分可包括不是聚丙烯酰胺的親水性N-取代丙烯酰胺聚合物(即取代基連接到丙烯酰胺的氮上)。示例性親水性N-取代丙烯酰胺聚合物包括如下均聚物和它們的共聚物 其中其中R3可以是-H或-CH3，R4和R5可以獨立地是-H、-CH3、-(CH2)xOH、-CH2CH(OH)(CH2)yOR6、-CH(CH2OH)CH(OH)CH3、-CH2CH2(OCH2CH2)p-OR6、-CH2CONH2、 或 和R6可以獨立地是-H、-CH3或-CH2CH3。x和y的數值為1-3和p的數值為1-200，和q與聚合物分子量直接成比例，其范圍從幾百到幾十萬。平均分子量為100,000Da-25,000,000Da，優選1,000,000Da-3,000,000Da。
適于用作公開的組合物中篩分組分的一種示例性親水性N-取代丙烯酰胺共聚合物是 其中，R3、R4、R5和共聚物的分子量，如先前所描述，和m∶n的比例為約100∶1至約1∶100。
在某些實施方案中，篩分組分包括平均分子量為約1,000,000Da-3,000,000Da的非交聯的丙烯酰胺聚合物。平均分子量為1,000,000Da或更大的非交聯的丙烯酰胺聚合物提供改進的分辨率。平均分子量為3,000,000Da或更小的非交聯的丙烯酰胺聚合物提供改進的流動性，使這樣的聚合物更易于處理和裝入未涂敷的毛細管。
在某些實施方案中，本發明組合物的表面相互作用組分包括一種或多種非交聯的聚合物。這樣的組分可屬于各種化學品類別，如在如下參考文獻中描述的那些Molyneux，水溶性合成聚合物性能和行為，卷I和II(CRC Press，Boca Raton，1982)；Davidson，編輯，水溶性樹膠和樹脂的手冊(McGraw-Hill，紐約，1980)；Franks，編輯，水廣泛的專著(PlenumPress，紐約，1973)等。
可適于作為表面相互作用組分的示例性非交聯聚合物包括聚乙烯基呲咯烷酮、N，N-二取代聚丙烯酰胺、N-單取代聚丙烯酰胺等。在某些實施方案中，表面相互作用組分包括0.05-0.5％，優選0.1-0.4％，和最優選0.2％的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(pDMA)。
N-取代聚丙烯酰胺的示例性N-取代基包括C1-C12烷基、鹵素取代的C1-C12烷基、甲氧基取代的C1-C12烷基、和羥基取代的C1-C12烷基等。優選，鹵素取代基是氟，羥基取代的C1-C12烷基是單取代的。應理解典型地選擇以上單體取代基使得獲得的聚合物是水溶性的。例如，含C12烷基的單體通常僅以共聚物的小部分組分存在。更優選，示例性取代基選自C1-C3烷基、鹵素取代的C1-C3烷基、甲氧基取代的C1-C3烷基、和羥基取代的C1-C3烷基。這樣的聚合物由常規技術，如在如下文獻中公開的技術合成Odian，聚合原理，第三版(John Wiley，紐約，1991)，Glass，編輯，水溶性聚合物美麗和性能(Adv.Chem.Ser.，#213，American Chemical Society，華盛頓，1986)，和Molyneux，水溶性聚合物性能和行為，卷I和II(CRCPress，Boca Raton，FL，1982)。
優選的表面相互作用組分是pDMA。根據某些實施方案，不是pDMA的疏水性聚合物可以用作表面相互作用組分。它們包括，但不限于，如下均聚物N-烷基-取代的丙烯酰胺和它們的共聚物， 其中R7可以是-H或-CH3，R8和R9可以獨立地是-H、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)2或-CH2CONH2，和z為約2000-50,000。平均分子量為200,000Da-5,000,000Da，優選300,000Da-2,500,000Da。酰胺基團也可以是環狀化合物如 或 可用作表面相互作用組分的共聚物的另一個例子包括如下結構 其中，R3、R4、R5和分子量如先前所描述，和j∶k的比例為約1∶9至約9∶1。
在某些實施方案中，含有分離介質的表面相互作用組分的聚合物可以在約0.001％-約10％重量∶重量(w∶w)的濃度下存在。優選，這樣的聚合物在約0.01％-約1％w∶w的濃度下存在。
在某些實施方案中，組合物可包括另外的組分如變性劑。當需要防止雙重或次級結構的形成時，這樣的變性劑可以與，例如，包括多核苷酸的分析物一起使用。示例性變性劑包括甲酰胺，如40-90％，脲，如6-8M，市售內酰胺，如吡咯烷酮、2-呲咯烷酮(Pyrollidinone)等。在某些實施方案中，變性劑包括單獨或結合的脲、甲酰胺，或2-呲咯烷酮。在電泳中使用變性劑的指導可以在公知的分子生物學參考文獻中找到，如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二版(Cold Spring HarborLaboratory，紐約，1989)。
在某些實施方案中，組合物在25℃下的粘度小于10,000厘泊(cp)。在其它實施方案中，組合物粘度在25℃下小于5,000cp，在25℃下小于1,000cp，或在25℃下小于600cp。使用Brookfield Model DV-II粘度計(Brookfield Engineering Laboratory，Inc.，Middleboro，MA)進行所有粘度測量。對于粘度小于4000cp的組合物，采用小樣品適配器使用轉軸No.18。轉軸速度對于粘度小于1000cp的樣品是3rpm，對于粘度為1000-2000cp的樣品是1.5rpm，和對于粘度為2000-4000cp的樣品是0.6rpm。對于粘度大于4000cp的樣品，更小的轉軸和不同的適配器是必須的。
用于進行毛細管電泳的設備是公知的。描述基本設備的許多參考文獻可得到，并且幾種毛細管電泳儀器可購得，如AppliedBiosystems(Foster City，CA)型號270A、310、3100或3700儀器。描述毛細管電泳設備和它們操作的示例性參考文獻包括Jorgenson，方法酶學方法中的陪伴，4179-190(1992)；Colburn等人，Applied BiosystemsResearch News，1期(1990的冬季)；Grossman等人(以上引用)等。
在某些實施方案中，采用緩沖劑體系以控制pH和作為攜帶電荷的組分。示例性緩沖劑包括有機酸，如檸檬酸、乙酸或甲酸的水溶液；兩性離子物，如TES(N-三[羥甲基]-2-氨基乙磺酸)、BICINE(N，N-雙[2-羥乙基]甘氨酸)、ACES(N-[2-乙酰氨基]-2-氨基乙磺酸)、TAPS(N-三[羥甲基]甲基-3-氨基丙磺酸)或雙甘氨肽；無機酸，如磷酸；和有機堿，如Tris(三[羥甲基]氨基甲烷)緩沖劑，如購自Sigma或Calbiochem。緩沖劑濃度可以很多寬地變化，例如為約1mM-1M。在某些實施方案中，用于本發明毛細管電泳方法的示例性緩沖劑溶液包括(i)100mM TAPS，7M脲，pH8.0；或(ii)TTE(50mM Tris-50mMTAPS)，7M脲，pH8.0。
在某些實施方案中，雙股多核苷酸，如PCR或LCR放大、酶消化物等的DNA片段由標準方案，或制造商建議的方案分離，其中采用商業毛細管電泳儀器，如型號270HT、310、3100或3700儀器(AppliedBiosystems，Foster City)。對于這樣標準或建議方案的例外在于采用本發明的組合物和/或毛細管電泳元件。在某些實施方案中，由毛細管電泳分離分析物的方法包括向含有第一和第二端的未涂敷毛細管中插入含有篩分組分和表面相互作用組分的組合物。在毛細管中裝載不同尺寸分析物的樣品和在毛細管的第一和第二端之間施加電場。樣品中的不同尺寸分析物通過毛細管中的組合物遷移，分離分析物。在其它實施方案中，使用預涂敷的毛細管。在某些實施方案中，組合物包括一種在此公開的組合物。
本發明的某些方法可用于DNA測序。在某些實施方案中，這樣的測序包括由DNA測序方案制備的單股多核苷酸的分離。DNA測序方案的詳細描述可以尤其在如下文獻中找到自動化的DNA測序化學指導(AppliedBiosystems，部分No.4305080)；Sambrook等人，分子克隆∷實驗室手冊，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory，紐約，1989)；Ausbel等人，在分子生物學中的目前方案(John Wiley & Sons，1993，包括通過2000年8月的補充)等。
某些目前可獲得的DNA測序方案的重要特征是單股多核苷酸的“嵌套系列物”或“梯度物”或DNA測序片段的產生，它們可以根據大小分離。DNA測序的鏈終止方法可包括(1)提供低聚核苷酸引物和包含要確定其序列的目標核酸的核酸模板，(2)將低聚核苷酸引物雜交到模板核酸上，(3)在包含核苷三磷酸酯前體和至少一種鏈終止核苷酸的反應混合物中，采用核酸聚合酶，如T7DNA聚合物酶、SequenaseTM、反轉錄酶等擴展引物以形成DNA片段群的嵌套系列物，使得每個更短的DNA片段是每個更長DNA片段的子序列，并使得相同大小的每個DNA片段末端具有相同的鏈終止核苷酸，(4)根據大小分離DNA片段群，和(5)識別與每個DNA片段群相關的鏈終止核苷酸。然而，熟練的技術人員會理解DNA測序方法的許多變化是可得到的。
可接受的模板包括在本領域，如ABI型號370A DNA測序器的技術手冊(Applied Biosystems，Foster，CA)中討論的那些。例如，可以將目標序列插入合適的克隆載體，如M13克隆載體的復制形式中，然后將它繁殖以擴大目標序列的復制數。將M13的單股形式分離用作模板。同樣，可以由在本領域，如以下文獻中教導的聚合酶鏈反應(PCR)提供模板Innis等人，(以上引用)；Wilson等人，Biotechniques，8卷，184-189頁(1990)；Gyllensten，Biotechniques，7卷，700-708頁(1989)等。在擴大之后，在某些實施方案中，模板可以在液相中用于聚合反應或連接到固相載體上，如由如下文獻教導的那樣Stahl等人，核酸研究，16卷，3025-3038(1988)；Hultman等人，核酸研究，17卷，4937-4946(1989)等。
一旦產生嵌套系列物DNA片段，使用本發明的組合物，毛細管電泳元件，或方法由毛細管電泳分離它們。
以上已經描述了本發明，本發明可以通過參考實施例更好地理解。如下實施例僅用于說明的目的，而不應當以任何方式限制本發明的范圍。
實施例實施例1由溶液聚合非交聯的丙烯酰胺聚合物的制備在裝配有用于機械攪拌的2”Teflon葉片，用于凈化的滲出管，和溫度計的500mL三頸圓底燒瓶中制備包含94.50g蒸餾水(18M ohm-cm)和32.02g(0.129mol)的28.57wt％丙烯酰胺溶液(Bio-Rad，Hercules，CA)的溶液。采用恒定機械攪拌，在150mL/min的流量下將超純氦(99.99％)鼓泡入溶液中120分鐘，以將溶液脫氧。向此脫氧的溶液中，采用注射器加入1.0mL(13.06mmol)2-丙醇(異丙醇)和4.0mL(0.35mmol)的1.99wt％過硫酸銨(99.99％純，Aldrich)溶液。采用在150rpm下的恒定機械攪拌和在150ml/分鐘下的氦凈化，將燒瓶浸入在50+1℃下的油浴中120分鐘。將反應采用攪拌加入200mL蒸餾水而驟冷和采用空氣鼓泡10分鐘。將獲得的水透明溶液放入再生的50K分子量截止(MWCO)Spectra/Por-7纖維素膜中，并對4.5加侖蒸餾(18M ohm-cm)水透析三天。每天換兩次水。將透析溶液凍干，獲得8.41g非交聯的丙烯酰胺聚合物(92％收率)。
由凝膠滲透色譜(GPC)使用American Polymer Standards(Mentor，Ohio)的聚丙烯酰胺主標準物表征此聚合物。在于30℃采用串聯的三個色譜柱，Ultrahydrogel(Waters Corp.Milford，MA)2000埃柱，Ultrahydrogel 1000埃柱，和保護柱，使用0.05M NaNO3，在1ml/min的流量下進行分離。注射體積是100μl和檢測器是Knauer DRI 8X。發現此非交聯的丙烯酰胺聚合物的Mn為589千道爾頓(kDa)，Mw為2517kDa(圖1-3中的2.5M)，和多分散性為4.23。由間歇模式光散射測量的Mw是1936kDa(表1中的制備編號1)。熟練技術人員理解觀察到的聚合物分子量可依賴于表征方法而變化。在所附權利要求中引用的分子量是基于上述GPC方法。
在使用之前，將聚合物在40℃下真空干燥至少4小時。
實施例2由溶液聚合另一種非交聯的丙烯酰胺聚合物的制備如在實施例1中制備第二種非交聯的丙烯酰胺聚合物，區別在于將2.0mL(26.12mmol)異丙醇加入到脫氧溶液中。熟練技術人員會理解異丙醇用作鏈轉移劑，當制備聚合物時限制聚合物的分子量。因此，通過改變異丙醇的數量，可以改變聚合物的分子量。
如在實施例1中那樣，將獲得的水透明溶液透析和凍干。產量是9.0g非交聯的丙烯酰胺聚合物(98％收率)。由凝膠滲透色譜表征聚合物并發現Mn為310kDa，Mw為1376kDa(圖1-3中的1.4M)，和多分散性為4.40。由間歇模式光散射測量的Mw是975kDa(表1中的制備編號2)。
遵循在實施例1和2中描述的溶液聚合程序，通過改變異丙醇的數量(參見表1，制備編號1-4)制備具有不同分子量的另外的非交聯丙烯酰胺聚合物。
表1.非交聯的丙烯酰胺聚合物制備。
實施例3由反向乳液聚合非交聯的丙烯酰胺聚合物的制備第五種非交聯的丙烯酰胺聚合物由反向乳液聚合(IEP)制備如下。向1L聚丙烯燒杯中加入100.05g Petrolum Special(bp180-220℃，FLuka)，100.01g的28.57wt％丙烯酰胺溶液(Bio-Rad)，2.50g脫水山梨醇單油酸酯(Fluka)，和1.00mL過硫酸銨1.0109wt％溶液(99.99％，Aldrich)。通過采用2”磁力攪拌棒在800rpm下攪拌10分鐘乳化混合物。然后將乳液轉移入裝配有用于機械攪拌的2”Teflon葉片用于凈化的滲出管和溫度計的1L三頸圓底燒瓶中。采用在300rpm下的恒定機械攪拌，將乳液采用超純氦(99.99％)在150mL/min流量下凈化120分鐘。向乳液中使用微量注射器加入0.010mL的N，N，N，N-四甲基乙二胺(超純，Armesco)。采用在300rpm下的恒定機械攪拌和在150mL/min流量下氦氣凈化19小時，將燒瓶降入在35±1℃下的油浴中。在聚合期間，乳液的溫度從不超過35℃。
在19小時之后，加入400mL丙酮和將乳液在300rpm下攪拌2小時。使聚合物粉末沉淀并將上清液層潷析。向沉淀的聚合物中，加入300mL丙酮，將機械攪拌器由1.5”蛋形磁力攪拌棒代替，并在800rpm下攪拌3小時。沉淀的聚合物變成非常細的粉末。使此粉末沉降，并潷析有機層。將聚合物粉末采用300mL丙酮磨碎和在800rpm下再攪拌3小時。將聚合物吸濾，并采用很多量的丙酮清洗。將大約5.4克濕聚合物粉末加入到450mL蒸餾水和將溶液采用1”磁力攪拌棒在75rpm下攪拌兩天。將獲得的混合物分入五個50mL Falcon管中和翻轉兩天以得到非常粘性的溶液。將此溶液放入再生的50KMWCO Spectra/Por-7纖維素膜中，并對4.5加侖蒸餾(18M ohm-cm)水透析三天。每天換兩次水。將透析溶液凍干，獲得4.50g非交聯的丙烯酰胺聚合物。由間歇模式光散射測量的Mw是12500kDa，和由凝膠滲透色譜測量的Mw是6377kDa(表1中的制備編號5；圖1-3中的6.4M)。
實施例4示例性篩分組分的制備用于本發明組合物的示例性篩分組分制備如下。將一百毫克表1所示的任何非交聯的丙烯酰胺聚合物加入到如下物質中2.44克水，0.075克12.3％pDMA溶液，和0.5克1M Na-TAPS/10mM EDTA緩沖劑，pH8.0。通過在轉子輪上旋轉過夜溶解混合物。在此程序之后，制備五種不同的篩分組分，每種包括表1所示的不同的非交聯的丙烯酰胺聚合物。
實施例5由毛細管電泳分離分析物通過結合實施例4的五種篩分組分的一種與0.2％pDMA制備用于分離分析物的五種示例性組合物。使用含有47cm未涂敷毛細管(36cm從注射端到檢測器)的ABI310毛細管電泳設備(Applied Biosystems，FosterCity，CA)，分析這五種組合物以評價它們分離多核苷酸分析物的能力。在每次分析之前，通過將五種組合物的一種泵入經過未涂敷的毛細管400秒而制備毛細管電泳元件。
在甲酰胺中溶解分析物，分析物包括熒光標記的DNA測序片段和單股DNA測序梯度物，梯度物包括18個已知大小的DNA片段，由熒光染料TET標記。在1.5kV下將此分析物溶液注入毛細管電泳元件中10秒。在50℃，60℃或70℃的運行溫度下使用200V/cm的電場進行分離。
測量峰寬度(定義為高斯峰標準偏差的4倍)和峰從DNA測序梯度物和片段的遷移時間。這些數值用于計算單堿基分辨率數值。在每個運行溫度下進行的三次或四次重復運行的單堿基分辨率數值和遷移時間見圖1，2和3。
五種組合物和三個運行溫度的單堿基分辨率極限見圖4。不管運行溫度，當聚合物分子量增加增加直到約3,000,000Da時，單堿基分辨率(見圖4)。然而，當聚合物分子量增加大于約3,000,000Da時，三個運行溫度曲線的每一個達到穩定水平。因此，增加聚合物分子量大于約3,000,000Da并不顯著增加單堿基分辨率。然而，增加聚合物分子量大于約3,000,000Da引起聚合物溶液粘度的快速增加。例如，用于實施例的2,500,000Da聚合物的粘度大約是500厘泊，而6,400,000Da聚合物的粘度大于50,000厘泊。因此，分子量為1,000,000-3,000,000Da的篩分組分提供有效的單堿基分辨率同時足夠保持用于毛細管裝載的低粘度。
盡管已經參考各種應用、方法和組合物描述了本發明，但應該理解可以進行各種變化和修改而不背離本發明。提供以上實施例以更好地說明本發明而不是用于限制本發明的范圍。
權利要求
1.一種由毛細管電泳分離分析物的組合物，該組合物含有包括分子量為1,000,000至3,000,000道爾頓的非交聯的丙烯酰胺聚合物的篩分組分；和包括一種或多種選自N，N-二取代聚丙烯酰胺和N-取代聚丙烯酰胺的非交聯的聚合物的表面相互作用組分，其中所述N-取代基選自C1-C3烷基、鹵素取代的C1-C3烷基、甲氧基取代的C1-C3烷基、和羥基取代的C1-C3烷基；其中篩分組分和表面相互作用組分相同或不同；其中組合物并不包含交聯的聚合物凝膠。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述組合物在25℃下的粘度為小于10,000厘泊。
3.根據權利要求1的組合物，其中所述組合物在25℃下的粘度為小于5000厘泊。
4.根據權利要求1的組合物，其中所述組合物在25℃下的粘度為小于1000厘泊。
5.根據權利要求1的組合物，其中所述組合物在25℃下的粘度為小于600厘泊。
6.根據權利要求1的組合物，其中一種或多種非交聯的聚合物包括聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。
7.根據權利要求1的組合物，該組合物還含有至少一種變性劑。
8.根據權利要求7的組合物，其中所述至少一種變性劑是選自甲酰胺、脲和2-呲咯烷酮的至少一種。
9.根據權利要求8的組合物，其中所述至少一種變性劑包括脲。
10.一種由毛細管電泳分離分析物的組合物，該組合物含有包括分子量為1,000,000至3,000,000道爾頓和在25℃下的粘度為小于10,000厘泊的非交聯的丙烯酰胺聚合物的篩分組分；包括聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的表面相互作用組分；和包括脲的變性劑；其中組合物并不包含交聯的聚合物凝膠。
11.根據權利要求10的組合物，其中所述組合物在25℃下的粘度為小于5000厘泊。
12.根據權利要求10的組合物，其中所述組合物在25℃下的粘度為小于1000厘泊。
13.根據權利要求10的組合物，其中所述組合物在25℃下的粘度為小于600厘泊。
14.一種毛細管電泳元件，該元件包括未涂敷的毛細管；在未涂敷的毛細管中用于分離分析物的組合物，該組合物含有包括分子量為1,000,000至3,000,000道爾頓和在25℃下的粘度為小于10,000厘泊的非交聯的丙烯酰胺聚合物的篩分組分；和表面相互作用組分，該表面相互作用組分包括一種或多種非交聯的聚合物的溶液；和其中毛細管電泳元件并不包括交聯的聚合物凝膠。
15.根據權利要求14的毛細管電泳元件，其中所述組合物在25℃下的粘度為小于5000厘泊。
16.根據權利要求14的毛細管電泳元件，其中所述組合物在25℃下的粘度為小于1000厘泊。
17.根據權利要求14的毛細管電泳元件，其中所述組合物在25℃下的粘度為小于600厘泊。
18.根據權利要求14的毛細管電泳元件，其中一種或多種表面相互作用組分非交聯的聚合物選自N，N-二取代聚丙烯酰胺和N-取代聚丙烯酰胺，其中所述N-取代基選自C1-C3烷基、鹵素取代的C1-C3烷基、甲氧基取代的C1-C3烷基、和羥基取代的C1-C3烷基。
19.根據權利要求18的毛細管電泳元件，其中所述表面相互作用組分非交聯的聚合物是聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。
20.根據權利要求14的毛細管電泳元件，其中所述組合物還含有至少一種變性劑。
21.根據權利要求20的毛細管電泳元件，其中所述至少一種變性劑為選自甲酰胺、脲和2-呲咯烷酮的至少一種。
22.根據權利要求21的毛細管電泳元件，其中所述至少一種變性劑包括脲。
23.根據權利要求14的毛細管電泳元件，其中所述未涂敷的毛細管包括二氧化硅、煅燒的二氧化硅、石英、硅酸鹽基玻璃、磷酸鹽玻璃或含氧化鋁的玻璃。
24.根據權利要求14的毛細管電泳元件，其中所述未涂敷的毛細管包括塑料基材。
25.根據權利要求14的毛細管電泳元件，其中所述組合物含有包括分子量為1,000,000至3,000,000道爾頓和在25℃下的粘度為小于600厘泊的線性丙烯酰胺聚合物的篩分組分；包括聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的表面相互作用組分；和包括脲的變性劑；其中所述組合物并不包含交聯的聚合物凝膠。
26.根據權利要求25的毛細管電泳元件，其中所述未涂敷的毛細管包括二氧化硅、煅燒的二氧化硅、石英、硅酸鹽基玻璃如硼硅酸鹽玻璃、磷酸鹽玻璃或含氧化鋁的玻璃。
27.根據權利要求25的毛細管電泳元件，其中所述未涂敷的毛細管包括塑料基材。
28.一種由毛細管電泳分離分析物的方法，該方法包括在組合物中由毛細管電泳分離分析物，所述組合物含有包括分子量為1,000,000至3,000,000道爾頓的非交聯的丙烯酰胺聚合物的篩分組分；和包括一種或多種選自N，N-二取代聚丙烯酰胺和N-取代聚丙烯酰胺的非交聯的聚合物的表面相互作用組分，其中所述N-取代基選自C1-C3烷基、鹵素取代的C1-C3烷基、甲氧基取代的C1-C3烷基、和羥基取代的C1-C3烷基；其中篩分組分和表面相互作用組分相同或不同；其中所述組合物并不包含交聯的聚合物凝膠。
29.根據權利要求28的方法，該方法采用多個未涂敷的毛細管并聯進行。
30.根據權利要求28的方法，其中所述非交聯的丙烯酰胺聚合物在25℃下的粘度為小于1000厘泊。
31.根據權利要求28的方法，其中所述非交聯的丙烯酰胺聚合物在25℃下的粘度為小于500厘泊。
32.根據權利要求28的方法，其中所述組合物還含有至少一種變性劑。
33.根據權利要求32的方法，其中所述至少一種變性劑是選自甲酰胺、脲和2-呲咯烷酮的至少一種。
34.根據權利要求33的方法，其中所述至少一種變性劑包括脲。
35.一種由毛細管電泳分離分析物的方法，該方法包括由毛細管電泳采用根據權利要求14的毛細管電泳元件分離分析物。
36.根據權利要求35的方法，該方法采用多個未涂敷的毛細管并聯進行。
37.根據權利要求36的方法，其中未涂敷的毛細管包括二氧化硅、煅燒的二氧化硅、石英、硅酸鹽基玻璃、磷酸鹽玻璃或含氧化鋁的玻璃。
38.根據權利要求36的方法，其中所述未涂敷的毛細管包括塑料基材。
39.一種由毛細管電泳分離分析物的方法，該方法包括由毛細管電泳采用根據權利要求25的毛細管電泳元件分離分析物。
40.根據權利要求39的方法，該方法采用多個毛細管并聯進行。
41.根據權利要求40的方法，其中所述未涂敷的毛細管包括二氧化硅、煅燒的二氧化硅、石英、硅酸鹽基玻璃、磷酸鹽玻璃或含氧化鋁的玻璃。
42.權利要求40的方法，其中未涂敷的毛細管包括塑料基材。
43.一種由毛細管電泳分離分析物的方法，該方法包括向具有第一和第二端的未涂敷的毛細管中插入組合物，該組合物含有包括分子量為約1,000,000至3,000,000道爾頓的非交聯的丙烯酰胺聚合物的篩分組分；和包括一種或多種選自N，N-二取代聚丙烯酰胺和N-取代聚丙烯酰胺的非交聯的聚合物的表面相互作用組分，其中所述N-取代基選自C1-C3烷基、鹵素取代的C1-C3烷基、甲氧基取代的C1-C3烷基、和羥基取代的C1-C3烷基；其中篩分組分和表面相互作用組分相同或不同；其中所述組合物并不包含交聯的聚合物凝膠；在毛細管中裝載不同大小的分析物的樣品；和在毛細管的第一和第二端之間施加電場使得樣品中的不同大小的分析物通過毛細管遷移，因此分離分析物。
44.根據權利要求43的方法，其中所述組合物還含有至少一種變性劑。
45.根據權利要求44的方法，其中所述至少一種變性劑包括脲。
46.根據權利要求43的方法，其中所述表面相互作用組分非交聯的聚合物是聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。
47.根據權利要求43的方法，該方法采用多個未涂敷的毛細管并聯進行。
48.根據權利要求47的方法，其中所述未涂敷的毛細管包括二氧化硅、煅燒的二氧化硅、石英、硅酸鹽基玻璃、磷酸鹽玻璃或含氧化鋁的玻璃。
49.根據權利要求47的方法，其中所述未涂敷的毛細管包括塑料基材。
50.一種用于由毛細管電泳分離分析物的試劑盒，該試劑盒包括組合物，該組合物含有包括分子量為約1,000,000至3,000,000道爾頓和粘度小于1000厘泊的非交聯的丙烯酰胺聚合物的篩分組分；和包括一種或多種選自N，N-二取代聚丙烯酰胺和N-取代聚丙烯酰胺的非交聯的聚合物的表面相互作用組分，其中所述N-取代基選自C1-C3烷基、鹵素取代的C1-C3烷基、甲氧基取代的C1-C3烷基、和羥基取代的C1-C3烷基；其中篩分組分和表面相互作用組分相同或不同；其中所述組合物并不包含交聯劑。
51.一種用于由毛細管電泳分離分析物的試劑盒，該試劑盒包括組合物，該組合物含有包括分子量為約1,000,000至3,000,000道爾頓和在25℃下的粘度小于1000厘泊的非交聯的丙烯酰胺聚合物的篩分組分；其中所述組合物并不包括交聯的聚合物凝膠。
52.根據權利要求51的試劑盒，該試劑盒還包括表面相互作用組分，該表面相互作用組分包括一種或多種選自N，N-二取代聚丙烯酰胺和N-取代聚丙烯酰胺的非交聯的聚合物，其中所述N-取代基選自C1-C3烷基、鹵素取代的C1-C3烷基、甲氧基取代的C1-C3烷基、和羥基取代的C1-C3烷基。
53.根據權利要求52的試劑盒，其中所述表面相互作用組分是聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。
54.根據權利要求53的試劑盒，該試劑盒還包括至少一種變性劑，該變性劑是選自甲酰胺、脲和2-呲咯烷酮的至少一種。
55.根據權利要求54的試劑盒，其中所述至少一種變性劑包括脲。
56.一種由毛細管電泳分離分析物的組合物，該組合物含有包括分子量為約1,000,000至3,000,000道爾頓的非交聯的丙烯酰胺聚合物的篩分組分；其中所述組合物并不包括交聯的聚合物凝膠。
全文摘要
本發明提供用于高速高分辨率地分離分析物的組合物、方法和試劑盒，所述分離通過毛細管電泳采用未涂敷的毛細管進行。所述組合物含有包括非交聯的丙烯酰胺聚合物的篩分組分和包括至少一種不帶電荷和非交聯水溶性二氧化硅吸收聚合物的表面相互作用組分。本發明還提供在毛細管電泳中采用新穎組合物的方法，以及提供包括用于新穎方法的新穎組合物的試劑盒。
文檔編號B01D53/02GK1503906SQ01816229
公開日2004年6月9日 申請日期2001年9月25日 優先權日2000年9月25日
發明者卡爾·O·文斯, 卡爾 O 文斯, 奧爾德里奇·N·K·勞, 里奇 N K 勞 申請人:埃普勒拉股份有限公司