一種不動桿菌及其菌劑的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種不動桿菌及其菌劑的制備方法。其技術方案是：所提供的不動桿菌（Acinetobactersp.）Y3于2013年9月25日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2013445。本發明提供的不動桿菌（Acinetobactersp.）Y3為異養硝化菌，是將不動桿菌（Acinetobactersp.）Y3接種到硝化培養基中發酵，通過發酵擴大培養得到，菌劑制備方法簡單，易于規模化生產。該菌能在較高濃度含酚工業廢水環境中順利進行硝化反應，并以苯酚為碳源進行同時硝化和反硝化，將氨氮和有機氮轉化為氮氣，無亞硝酸鹽氮積累，實現廢水中的氨氮和苯酚的同時高效降解，在含酚工業廢水的生物脫氮處理中展現出良好的應用前景。
【專利說明】一種不動桿菌及其菌劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境污染物生物脫氮【技術領域】。具體涉及一種不動桿菌及其菌劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]近年來，為了提高廢水生物系統的處理能力，通過向系統中投加高效優勢菌種或通過基因工程產生的工程菌，即所謂的高效菌技術(生物強化技術)得到了迅速的發展，成為該領域的研究熱點。
[0003]在國外特別是發達國家，環境微生物菌劑更是受到人們的普遍關注和重視，已成為一種新的發展趨勢。丹麥的諾維信、美國Bioform公司所售的硝化菌均為復合菌劑，菌劑中含有大量的自養硝化菌，同時還含有一定數量的異養硝化好氧反硝化菌。硝化菌劑目前已經形成一定規模的產業，并已在發展中國家得到應用。與自養硝化菌相比，異養硝化細菌對培養條件的要求比較寬松，許多異養硝化細菌在低溫以及高C/Ν條件下仍能夠較好地進行硝化作用，適用的溶解氧和PH值范圍也更為寬泛。異養硝化好氧反硝化菌可以在同一反應器中，同時進行硝化和反硝化，有效降低廢水的總氮。含有異養硝化好氧反硝化菌的硝化菌劑，不僅可以提高富含有機成分廢水的硝化能力，同時還有較好的總氮脫除能力，從而為滿足更高環保要求的廢水排放標準提供菌劑保證。
[0004]目前文獻已報道了幾產喊菌(Alcaligenes /aecaJis)、假單胞菌{Pseudomonassiwizeri)、泛養硫球菌{Jhiosph3er3 pantotropha)具有較好的好氧反硝化能力，但對含酚廢水中氨氮的降解效率較低，致使難以在焦化、焦油加工等實際廢水處理中得到應用。
【發明內容】
[0005]本發明旨在解決普通異養硝化菌對含酚工業廢水中氨氮降解效率低的問題，目的是提供一種不動桿菌及其菌劑的制備方法，為焦化和焦油加工等實際廢水生物脫氮處理提供菌劑。
[0006]本發明所提供的不動桿菌sp.)Y3源于武鋼焦化公司廢水生物處理系統的活性污泥。該菌是以氨氮為氮源，以苯酚和丁二酸鈉為碳源和能源進行生長繁殖，利用硝化培養基進行馴化培養，并通過平板劃線分離純化得到。
[0007]其中，硝化培養基的成分是:丁二酸鈉為9.8g/L，磷酸氫二鈉為7.85g/L，磷酸二氫鉀為1.45g/L，硫酸鎂為0.2g/L，硫酸銨為1.0g/L，硫酸亞鐵為0.01g/L ;硝化培養基的pH值用lmol/L的氫氧化鈉調至9.0。培養基滅菌條件是:溫度為12廣126°C，時間為25min。
[0008]該菌為革蘭氏陰性，經16S rDNA鑒定為不動桿菌Ucifle?ο如cter sp.)，編號為Y3。該菌于2013年9月25日保藏于中國典型微生物保藏中心(武漢大學)，保藏編號為CCTCCN0:M2013445。該菌菌落呈乳白色，圓形，中間凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊。具有同時硝化和反硝化能力，能以苯酚作為碳源和能源進行生長繁殖。
[0009]該菌較優的培養條件是:溫度為30°C，初始pH值為9.0，接種量為3 vol%,搖床轉速為150r/min，碳氮質量比(C: N)為12: I。
[0010]本發明還涉及所述不動桿菌(Acinetobacter sp.) Y3菌劑的制備方法:先向發酵罐裝入3/4體積的硝化培養基,用蒸汽在線滅菌；再將不動桿菌(Acinetobacter sp.) Y3接種到硝化培養基中發酵，發酵條件為:溫度為30°C，pH值為9.0，接種量為3vol%，轉速為150r/min，通氣量為0.5 (V/V.min)，發酵時間為24h，發酵過程中加入0.05 vol%的陶氏消泡劑。
[0011]由于采用上述技術方案，本發明與現有技術相比具有如下積極效果:
本發明提供的不動桿菌菌劑不但制備方法簡單，易于規模化生產，而且降解效率高，環境適應能力強。所提供的不動桿菌sp.) Y3為異養硝化菌,能在大量有機物存在的條件下順利進行硝化反應，并能將硝化的產物同時進行反硝化，將氨氮和有機氮轉化為氮氣，無亞硝酸鹽氮積累。特別突出的優勢是，該菌能耐受酚濃度高達1000mg/L的工業廢水環境，并以苯酚作為碳源進行同時硝化和反硝化，實現廢水中的氨氮和苯酚的同時高效降解，在含酚工業廢水的生物脫氮處理中展現出良好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為本發明的不動桿菌difleioAacier sp.) Y3的菌落圖；
圖2為本發明的不動桿菌sp.) Y3的革蘭氏染色效果圖；
圖3為本發明的不動桿菌(Acinetobacter sp.) Y3的生長特性曲線圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明做進一步描述，并非對其保護范圍的限制。
[0014]實施例1、菌株的分離純化
(I)菌株來源
菌源采自武鋼焦化公司廢水生物處理系統的活性污泥。
[0015](2)菌株的分離純化
將采集到的活性污泥混勻，取2mL接種于IOOmL已滅菌的LB培養基中，所述LB培養基的成分是:蛋白胨為lwt%，氯化鈉為I wt%，酵母提取物為0.5 wt% ;再置于溫度為30°C和150r/min的恒溫搖床培養15h ;然后取5mL培養液轉接至已滅菌的硝化培養基中,轉接4次，轉接過程中逐漸增大硫酸銨的濃度，濃度依次為:300mg/L，600mg/L，900mg/L，1200mg/L0馴化期間，同時向硝化培養基中加入苯酚使得其最終濃度為500mg/L。馴化結束后，將菌液做梯度稀釋(10_卜10_8)，涂布于固體的硝化培養基上，置于30°C恒溫培養箱培養2天，然后挑取單菌落，平板劃線(重復2~3次)，得到純化后的菌株，將每株菌試管斜面保存。最后進行硝化性能、反硝化性能及苯酚降解性能的測定，挑選綜合性能最優的菌株Y3斜面保種，并保藏于中國典型微生物保藏中心(武漢大學)，保藏編號為CCTCC NO:M2013445。
[0016]實施例2、菌株的鑒定 (O菌株的形態學觀察
將菌株Y3培養液梯度稀釋后，均勻涂布于固體硝化培養基上面，置于30°c恒溫箱培養22h，進行形態學觀察，結果如圖1所示。由圖1可以看出，該菌菌落呈乳白色，圓形，中間凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊。挑取菌落少許，經革蘭氏染色之后，在光學顯微鏡的油鏡下觀察，結果如圖2所示，能夠清楚看到保藏編號為CCTCC NO:M2013445的菌株單個菌為短桿狀，呈紅色，為革蘭氏陰性菌。
[0017](2)菌株的 16S rDNA 鑒定
用DNA提取試劑盒提取菌株Y3的基因組DNA，然后進行16S rDNA基因克隆、測序，其16SrDNA序列見序列表。之后在GenBank中進行Blast比對，結果顯示，與其序列相似度達到99%的均為JcifleioAacier sp。結合菌株Y3的特性，將其歸屬為不動桿菌sp)。
[0018]實施例3、不動桿菌difleioAacier sp.) Y3菌劑的制備
配制3L的硝化培養基，加入到5L的發酵罐中，并加入1.5mL的陶氏消泡劑，然后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在121°C下濕熱滅菌25min，待滅菌的培養基冷卻后，將不動桿菌
{Acinetobacter sp.) Y3 以 3vol% 的量接種到硝化培養基，在 30°C > 150r/min 和 0.5(V/V.min)通氣量的條件下發酵培養，24h后停止發酵，并加入25vol%的甘油作為保護劑后，進行低溫保藏。
[0019]實施例4、不動桿菌sp.) Y3的生長及其對氨氮和苯酹的降解 將不動桿菌{Acinetobacter sp.) Y3菌株接種于無菌、含氨氮為212mg/L和苯酹
為200mg/L的異養硝化培養基中，在30°C和150r/min的條件下培養，測定菌體的菌密度(0D_)、氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮和苯酚的濃度，結果如圖3所示。結果表明:初始濃度為212mg/L的氨氮經過24h被完全降解，期間并未檢測到亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，菌體的生長與氨氮的降解趨勢基本同步，苯酚經過20h被完全降解，該菌株對氨氮和苯酚具有很好的降解效果，并展現出良好的同時硝化和反硝化能力。
[0020]上述【具體實施方式】為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的。
【權利要求】
1.一種不動桿菌，其特征在于該不動桿菌sp.)的編號為Y3,保藏于中國典型微生物保藏中心，保藏日期為2013年9月25日，保藏編號為CCTCC N0:M2013445。
2.如權利I所述不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于將所述不動桿菌{Acinetobacter sp.)Y3接種到硝化培養基中發酵，發酵條件是:溫度為30°C，pH值為9.0，接種量為3vol%，轉速為150r/min，通氣量為0.5 (V/V.π?η)，發酵時間為24h，發酵過程中加入0.05 vol%的陶氏消泡劑。
3.如權利2所述不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的硝化培養基的成分是:丁二酸鈉為9.8g/L,磷酸氫二鈉為7.85g/L,磷酸二氫鉀為1.45g/L,硫酸鎂為0.2g/L,硫酸銨為1.0 g/L，硫酸亞鐵為0.01g/L ;硝化培養基的pH值用lmol/L的氫氧化鈉調至9.0。
【文檔編號】C02F101/38GK103756947SQ201410052917
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月17日 優先權日:2014年2月17日
【發明者】顏家保, 許龍龍, 楊洋, 余永登, 張 浩, 武文麗, 陳佩, 陳冬冬 申請人:武漢科技大學