耐鹽并具有低溫生物脫氨功能的枯草芽孢桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一株耐鹽并具有低溫生物脫氨功能的枯草芽孢桿菌及其應用。本發明的枯草芽孢桿菌DA-1，分類命名：Bacillus?subtilis，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC?No.8292，保藏時間是2013年10月8日。本發明的枯草芽孢桿菌成本低廉、操作簡便、活菌率高。制備的枯草芽孢桿菌微生態制劑可在低溫條件下去除富營養化水體中氨氮，特別是在漁業養殖中，可快速高效降低水體中氨氮的含量，改善養殖水體環境，帶來顯著的社會效益。
【專利說明】耐鹽并具有低溫生物脫氨功能的枯草芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種在低溫條件下具有高脫氨活性的細菌、培養該細菌的方法、以該菌為主要組成成分的低溫生物脫氨劑的制備、及運用該制劑在水體氮素降解中的應用。
【背景技術】
[0002]氮素循環是自然界中最為重要的生態系統物質循環的組成之一。然而，氮肥的使用及高密度水產養殖的發展，在帶來巨大經濟效益的同時也造成了嚴重的環境問題。在水產養殖中，因氮磷元素含量過高而造成的富營養化情況頻繁出現，除使水質惡化及破壞其中的生物平衡外，其中的氨氮和亞硝態氮對養殖動物具有較強毒性，特別是氨氮（NH+—N )，它能直接或間接影響魚類的生長、繁殖乃至死亡，一方面它能被植物直接吸收利用，增加浮游生物量，為魚類提供更豐富的營養餌料。另一方面它對魚類及其他水生動物有毒性，它能破壞鰓組織，并滲進血液中，降低血液載氧能力，使呼吸機能下降。
[0003]已有研究報道表明假絲酵母、諾卡氏菌、光合細菌、硝化細菌等對養殖水體中的氨氮具有較強的去除能力，但存在接種量大、應用成本高等缺點，而芽孢桿菌易分離、易培養，該類微生物不僅可產生多種胞外水解酶，分解水中殘留的有機物，還可產生休眠芽孢，能夠抵御惡劣環境，方便制劑加工和儲運，在降低水體氨氮含量和調節水質方面有良好的應用前景。
[0004]枯草芽孢桿菌除了對氨氮有較好的脫除能力外，還能產生大量的胞外酶類，從而大量消耗池塘中的殘館和動物排泄物等大分子有機質。大分子有機質被分解為小分子有機酸、氨基酸等物質，能為水體中光合細菌、藻類以及其它浮游生物提供營養，客觀上促進了微生態環境的穩定；芽孢桿菌還可使水生動物的腸道pH降低，產生較強活性的蛋白酶和淀粉酶，促進水生動物的 消化；此外，芽孢桿菌定植在目標動物腸道中，經生物奪氧作用，能抑制病原菌的滋生以及提高動物的免疫力，最終預防疾病的發生，最終促進目標動物生長和提高飼料轉化率。
[0005]目前已報道的枯草芽孢桿菌大多存在氨氮的脫除能力不強，對環境溫度要求高(25V以下氨氮脫除能力不強)，菌株存活率不高，生產成本大，菌株在高鹽度水體中脫氮活性低等問題，影響了枯草芽孢桿菌在環境保護中的應用。
【發明內容】
[0006]本發明公開了一株具有低溫脫氨生物活性的細菌：枯草芽孢桿菌DA-1，該細菌具有較高的氨氮脫除能力。這類菌株是好氧細菌，在生物脫氮中能有效地將nh4+-n直接轉化成菌體的自身組成物質，更具體地，這類細菌是芽孢桿菌屬的一類細菌，由發明人在江蘇省南京市鐘山風景區琵琶湖畔采集的土壤中篩選得到。本發明公開的細菌是枯草芽孢桿菌DA-1,分類命名：枯草芽孢桿菌,Bacillus subtilis。其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號是：CGMCC No. 8292。保藏時間：2013年10月08日，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學研究微生物研究所。
[0007]在低溫條件下，本發明的DA-1仍具有較高的氨氮脫除能力。
[0008]本發明的DA-1可以在15~30°C，120~250r/min的搖瓶轉速，pH5~10的條件下，在每升含10~25g葡萄糖、1~3g可溶性淀粉、10~40g黃豆餅粉、20~40mg硫酸猛、0. 1~0. 4g酵母膏、0. 1~0. 3g三氯化鐵和0. 1~0. 3g碳酸鈣的培養基中進行培養。
[0009]更優選的培養方法是：本發明的DA-1在30°C，200r/min的搖瓶轉速，pH7. 0的條件下，在每升含15g葡萄糖、2g可溶性淀粉、30g黃豆餅粉、30mg硫酸錳、0. 2g酵母膏、0. lg三氯化鐵、0. lg碳酸鈣的培養基中。
[0010]上述培養基中，滅菌條件優選：121°C滅菌20min，葡萄糖單獨115°C滅菌15min后加入無菌培養基中。固體培養基中需加入1.5%瓊脂粉。本發明所述百分比均為重量百分比。
[0011]本發明還公開了 DA-1的高密度發酵方法，通過液體深層發酵，該細菌能夠形成大量芽孢，在氨氮污染水體中單獨使用該生物脫氮劑可有效脫除水體中氨氮。
[0012]本發明公開了一種大規模高密度培養低溫脫氨芽孢桿菌DA-1的方法，包括：在30°C，攪拌轉速200~300r/min，通氣量0. 3~0. 8vvm,接菌量3~6%，初始pH7. 0的條件下，在每升含10~25g葡萄糖、1~3g可溶性淀粉、10~40g黃豆餅粉、20~40mg硫酸猛、1~3g磷酸氫二鉀、1~2g磷酸二氫鉀、0. 2~1. 0g硫酸鎂、0. 1~0. 5g酵母膏、0. 1~0. 3g三氯化鐵和0. 1~0. 3g碳酸鈣的培養液中進行發酵罐培養細菌。
[0013]優選的方法包括在30°C、攪拌轉速250r/min、通氣量0. 5vvm、接菌量5%，初始PH7.0的條件下，在每升含15g葡萄糖、2g可溶性淀粉、30g黃豆餅粉、30mg硫酸錳、3g磷酸氫二鉀、1. 5g磷酸二氫鉀、0. 5g硫酸鎂、0. 2g酵母膏、0. lg三氯化鐵和0. lg碳酸鈣的培養液中進行發酵罐培養細 菌。
[0014]本發明的DA-1是具有出色氨氮脫除能力的細菌，發酵培養后可獲得活菌數多、芽孢率高的菌株，在低溫條件下就可表現出氨氮脫除活性。
[0015]在使用中，一般將本發明DA-1進行大規模高密度培養后，低溫離心收獲菌體，菌體重懸于12~15%的脫脂牛奶，凍干成菌體凍干粉。凍干粉優選的活性為1. 0~
2.7X10nCFU/g。使用時直接將凍干粉投入待脫氨氮的水體即可。
[0016]本發明還公開了一種對水體進行生物脫氨的方法，包括：將菌體凍干粉直接投入淡水養殖水體，使其終濃度為107~108CFU/m3。最佳的方法組合包括將低溫脫氨芽孢桿菌進行大規模高密度培養后，通過8000r/min、4°C離心lOmin收獲菌體，重懸于15%的脫脂牛奶，凍干。菌體凍干粉直接投入淡水養殖水體，使其終濃度為107~108CFU/m3。本發明的低溫脫氨芽孢桿菌DA-1在低溫條件下就具有出色脫氨活性，在合適的溫度、pH、唯一碳源、C/N比等組合培養條件下，DA-1能表現出更強的氨氮脫除能力。
[0017]溫度、pH、鹽度對DA-1降解氨氮的影響：
[0018]枯草芽孢桿菌DA-1接種到每升含有5g牛肉膏，10g蛋白胨，5g氯化鈉，pH7. 0的基礎培養基中于搖床培養24h，使菌體量達到109CFU/mL以上。采用活菌計數法測定芽孢桿菌菌濃。菌體經離心生理鹽水漂洗三次后，棄上清，加等體積的生理鹽水懸浮菌體，將菌懸液以1%的接種量(體積比)接種至氨氮濃度為50mg/L的篩選培養基，篩選培養基組成：5. 0g葡萄糖，0.258(順4)2504，1.(^ NaCl，0.5g K2HP04，0.25g MgS04，lOOOmL 水，ρΗ7· 0。將培養溫度（°C)分別設為10、15、20、25、30，？!17.0、20017^11搖床培養；將？!1分別設為5.0、6.0,7.0,8.0,9. 0，培養溫度30°C、200r/min搖床培養;將鹽度（％)分別設為0、1、2、3、4，培養溫度30°C，pH7. 0, 200r/min搖床培養，48h后測定氨氮降解率。
[0019]從圖1可以看出，在從15_30°C的溫度范圍內，DA-1的氨氮降解率都能保持在95%以上，當溫度過低達到10°c時，氨氮降解率會受到影響，下降到60%。
[0020]由圖2可以看出，溫度為30°C，當pH為5. 0時，DA-1對氨氮的降解率低于10%，當pH > 6. 0時，氨氮轉化率較高，當pH為7. 0時，氨氮降解率最高。DA-1適合在中性和微堿性環境下生長代謝。這是因為氫離子濃度會改變微生物與原生質膜的電荷，進而影響微生物的酶活性以及生長代謝，pH還能夠影響培養基中營養物質的離子化程度，從而影響微生物對營養物質的吸收，影響環境中有害物質對微生物的毒性以及影響代謝反應中各種酶的活性等。
[0021]DA-1對pH適應能力強，在pH7~9均表現出很強的氨氮降解能力，完全能夠滿足養殖水體中氨氮的降解。
[0022]從圖3可以看出，在溫度為30°C，pH7. 0的條件下，以200r/min的搖床轉速進行培養時，鹽度對菌株的還原活性沒有明顯影響。水產養殖的水體中存在一定的鹽濃度，淡水鹽濃度一般不超過0. 5%，海水平均鹽濃度為3. 5%。綜上，菌株可以適應海水的高鹽濃度，可快速去除水體中的氨氮。
[0023]本發明的低溫脫氨枯草芽孢桿菌DA-1是一株好氧異養微生物,它在低溫條件下(15~25°C )，能對富營養化水體，特別是含銨鹽的水體進行氮素無害化生物處理，經低溫脫氨枯草芽孢桿菌生物處理的淡水養殖水體達到魚蝦相對安全的水平。低溫脫氨枯草芽孢桿菌的水體無害化處理是在有氧條件下進 行的，不需要特殊的設備，氨氮被大量轉化為菌體自身的組成物質，細菌可以作為魚類的食物從而進入食物鏈，最終實現環境保護，并同時真正做到了能源和物質的無害、合理再循環。
[0024]本發明公開了一種在低溫條件下對含氨氮廢水進行生物脫氨的方法，本發明中具有低溫氨氮脫除能力的枯草芽孢桿菌DA-1可加入到含氨氮廢水中，在自然環境15~25°C靜止或攪拌狀態下，3~4天后，可脫除水體氨氮的80~95%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]附圖1是DA-1在不同溫度下的氨氮降解情況
[0026]附圖2是pH對枯草芽孢桿菌DA-1脫氨氮的影響
[0027]附圖3是鹽度對枯草芽孢桿菌DA-1脫氨氮的影響
[0028]附圖4是DA-1搖瓶發酵時的生長曲線
[0029]附圖5是10L發酵罐培養時DA-1芽孢率變化
[0030]附圖6是DA-1芽孢形態（1000X)
[0031]附圖7是DA-1在實際養殖水體中的氨氮脫除曲線
【具體實施方式】
[0032]實施例1
[0033]DA-1搖瓶發酵[0034]1.種子活化培養基：
[0035]牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水定容至1L，pH7. 0。加入1. 5%瓊脂粉制成固體斜面培養基。
[0036]2.發酵培養基：
[0037]葡萄糖15g，可溶性淀粉2g，黃豆餅粉30g，硫酸錳30mg，磷酸氫二鉀3g，磷酸二氫鉀1. 5g，硫酸鎂0. 5g，酵母膏0. 2g，三氯化鐵0. lg,碳酸鈣0. lg,蒸餾水定容至1L，初始pH調節至?. 0。
[0038]將菌種DA-1接種到種子活化培養基，30°C恒溫培養18h，5%接種量至裝有100mL發酵培養基的500mL錐形瓶中，30°C，200r/min條件震蕩培養。結果如附圖4所示，培養0~2h時，DA-1菌株生長處于停滯期，細菌數量少；2h后細菌進入對數期，細菌數量增長極快；12~20h為DA-1的生長穩定期；20h后細菌數逐漸降低，細菌進入衰亡期。
[0039]實施例2
[0040]芽孢桿菌的發酵罐大規模培養
[0041]1.種子培養基：
[0042]牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水定容至1L，pH7. 0。加入1. 5%瓊脂粉制成固體斜面培養基。
[0043]2.發酵培養基：
[0044]葡萄糖15g，可溶性`淀粉2g，黃豆餅粉30g，硫酸錳30mg，磷酸氫二鉀3g，磷酸二氫鉀1. 5g，硫酸鎂0. 5g，酵母膏0. 2g，三氯化鐵0. lg,碳酸鈣0. lg,蒸餾水定容至1L，初始pH調節至?. 0。
[0045]從瓊脂斜面上接DA-1兩環菌苔裝入有100mL種子培養基的500mL錐形瓶中，在
30°C，200r/min搖床培養12h。按5%接種量接種，將500mL種子培養液轉移至裝有9. 5L發酵培養基的10L發酵罐中。根據搖瓶實驗的研究結果，確定最佳發酵罐的培養條件：30°C、攪拌轉速200r/min、通氣量0. 5vvm、接菌量5%，初始pH為7. 0，在每升含15g葡萄糖、2g可溶性淀粉、30g黃豆餅粉、30mg硫酸錳、3g磷酸氫二鉀、1. 5g磷酸二氫鉀、0. 5g硫酸鎂、0. 2g酵母膏、0. lg三氯化鐵和0. lg碳酸鈣的培養液中進行發酵培養。發酵罐中DA-1菌株芽孢率變化如圖5所示，經過潛伏期，細菌迅速生長繁殖，24h時DA-1菌株開始形成芽孢，28h時DA-1菌株芽孢率達到40%，當發酵培養到33h時，如圖6所示，芽孢率達到85%，此時可以停止發酵，對發酵液按實施例3進行后續處理。
[0046]實施例3
[0047]凍干粉制備以及活菌濃度測定
[0048]按照實施例2，將發酵罐培養24小時的枯草芽孢桿菌DA-1菌體通過12，000g,在4°C下離心15min收集，接著懸浮于含有15%脫脂奶粉的400mL發酵液，最后凍干。凍干程序設置為第一段：-30°C，240min (4h);第二段：_10°C，600min (10h);第三段：0°C，960min(16h);第四段：4°C，360min (6h)。
[0049]菌體凍干粉制劑活菌濃度范圍為2. 7X10nCFU/g,總重約96g。
[0050]實施例4
[0051]枯草芽孢桿菌DA-1在實際養殖水體中的氨氮脫除能力
[0052]按照實施例3制備的凍干粉，將菌體凍干粉制劑（2.7X10nCFU/g)直接投入污染海水養殖池塘，菌體的投入量為108CFU/m3，每天以靛藍光度法測定池塘水體的氨氮含量。
[0053]結果顯示，在水溫17°C、pH7. 8的水體環境下，水中NH4+_N從菌體投放后的第2天開始下降，到第5天時已由2. 4mg/L下降至0. 17mg/L，見圖7，枯草芽孢桿菌具有非常顯著的降解氨氮的效果，能在不采取其他方法的情況下，將水體氨氮快速降解至對魚蝦相對安全的水平。在整個實施過程中，pH在7. 6~7. 9的范圍間波動，這個范圍適合芽孢桿菌的生 長。
【權利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號是：CGMCC No. 8292。
2.—種培養權利要求1的枯草芽孢桿菌的方法，包括：在15~30°C、120~250r/min搖瓶轉速、pH5~10條件下，在每升含10~25g葡萄糖、1~3g可溶性淀粉、10~40g黃豆餅粉、20~40mg硫酸錳、0. 1~0. 4g酵母膏、0. 1~0. 3g三氯化鐵和0. 1~0. 3g碳酸鈣的培養液中進行培養。
3.權利要求2的方法，包括：在30°C，200r/min搖瓶轉速，pH7.0條件下，在每升含15g葡萄糖、2g可溶性淀粉、30g黃豆餅粉、30mg硫酸錳、0. 2g酵母膏、0. lg三氯化鐵和0. lg碳酸鈣的培養液中進行培養。
4.一種規模化發酵培養權利要求1的枯草芽孢桿菌的方法，包括：在30°C，攪拌轉速200~300r/min，通氣量0. 3~0. 8vvm,接菌量3~6%，初始pH7. 0的條件下，在每升含10~25g葡萄糖、1~3g可溶性淀粉、10~40g黃豆餅粉、20~40mg硫酸猛、1~3g磷酸氫二鉀、1~2g磷酸二氫鉀、0.2~l.Og硫酸鎂、0. 1~0. 5g酵母膏、0. 1~0. 3g三氯化鐵和0. 1~0. 3g碳酸鈣的培養液中進行發酵罐培養細菌，所述百分比為重量百分比。
5.權利要求4的方法，包括：在30°C，250r/min的攪拌轉速，0.5vvm的通氣量、5%的接菌量、初始PH7.0的條件下，在每升含15g葡萄糖、2g可溶性淀粉、30g黃豆餅粉、30mg硫酸錳、3g磷酸氫二鉀、1. 5g磷酸二氫鉀、0. 5g硫酸鎂、0. 2g酵母膏、0. lg三氯化鐵和0. lg碳酸鈣的培養液中進行發酵培養。
6.權利要求1中的枯草芽孢桿菌在養殖水體脫氨中的應用。
7.一種對海水養殖水體進行生物脫氨的方法，包括：將權利要求1的枯草芽孢桿菌培養后，懸浮于脫脂牛奶并凍干，將凍干粉直接投入水體，在自然環境PH7~9，培養3~4天后，即可脫除水體的氨氮。
8.權利要求7的方法，包括：將權利要求1的枯草芽孢桿菌培養后，懸浮于脫脂牛奶并凍干，將凍干粉直接投入水體，菌體的投入量為107~108CFU/m3，在自然環境pH7~9，溫度15~20°C，培養3~4天后，即可脫除水體中的氨氮。
【文檔編號】C02F101/16GK103773722SQ201410019773
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月16日 優先權日:2014年1月16日
【發明者】周長林, 賈源賓, 張寧 申請人:中國藥科大學, 南京曜動節能環保科技有限公司