一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑及其制備方法和用途，本發明針對海參的生理習性和養殖特點，應用海洋微生物技術，由海參養殖環境中分離篩選的彎曲芽孢桿菌CGMCCNo.5115、枯草芽孢桿菌CGMCCNo.5116和蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.5117所組成，以玉米粉和豆粕粉為主要培養料，28-37℃發酵24-48h，再以麥飯石和稻殼作為吸附和懸浮載體，加工制得一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑。本產品有利于海水養殖水體三維立體的凈化效果，可以吸附水體中Hg2+、Pb2+、Cr6+、Cd2+、Cu2+等重金屬離子等有害物質，大幅降低氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質的含量，活水除臭，有效抑制病原微生物，預防海參病害的發生，提高海參養殖的產量和質量。
【專利說明】一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明于水產養殖及海洋微生物【技術領域】，具體涉及一種一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]海水是海參等海珍品賴以生存的基本環境條件，俗話說:“三分養魚，七分養水”。水質的好壞直接影響到海參的生長狀況和養殖戶的經濟效益。隨著經濟和科學的發展，人們對海參的需求日益增加，在天然捕撈不能滿足市場需求的情況下，海參養殖業已由傳統的粗放型經營、資源依賴型養殖方式轉化為現在的集約化和工廠化的養殖方式，刺參養殖已成為中國水產養殖業的支柱產業之一。然而，隨著刺參集約化和規模化養殖迅速的發展，出現了一些嚴重問題，制約了其產業的發展，比如殘存餌料以及排泄物和動物死體在水體中沉積，分解生成很多的有害物質，惡化了水質，病原菌大量繁殖，致使海參產生強烈的應激反應，出現了搖頭不食、口腫、身體收縮僵直、排臟、體表潰瘍等現象，最后體壁大面積腐爛而死。為了對抗海參病疫，長期和大量濫用抗生素以及化學合成藥物，不僅導致了海參對病原微生物的易感性以及細菌病原微生物等的耐藥性，還會使抗生素檢測超標，并造成整個生態環境的污染，嚴重影響了節約減排、食品安全和阻礙了無公害刺參養殖業的可持續發展。
[0003]麥飯石是一種多孔性鋁硅酸鹽，主要是黒母云石英二長斑巖，主要化學成分為SiO2和Al2O3,具有多孔性，呈斑狀或似斑結構，這種特殊結構使其具有很強的物理吸附性和離子交換性，能夠選擇性去 除養殖水體中的顆粒態和膠體態的污染物質以及氨氮、亞硝酸氮與&S等引起水體富營養化的主要污染物，還能夠吸附清除Hg2+、Pb2+、Cr6+、Cd2+、Cu2+等重金屬離子等有害物質，在水處理方面具有良好的應用前景。
[0004]稻殼是稻谷外面的一層殼，由內穎及較大的外穎組成。稻殼長5_10mm、2.5_5mm、厚23-30微米，其色澤一般呈金黃色，被粉碎后，堆積密度可達384-400kg/m3，作為本產品的輔料，可以增加產品的漂浮性、懸浮性以及沉浮可控性，有利于海水養殖水體三維立體的凈化效果。
[0005]水產微生態制劑，是利用水產動物體內或養殖水體中的有益微生物經特殊加工工藝而形成的活菌制劑，具有氨氧化、硝化、反硝化、解磷、除硫和脫氮等作用，有效地降低水中的C0D、氨氮、亞硝酸氮和硫化物的濃度，從而有效地改善水質。目前，應用于水產養殖的微生態水質調節劑，只限于單純一種或兩種益生菌凈化養殖水體，存在菌群存活繁殖適應性差和數量減少等劣勢，并且對養殖水體中重金屬離子污染的凈化沒有效果。所以，急需一種既能除去水體中重金屬離子，又能去除水體中C0D、氨氮、亞硝酸氮和硫化物，并抑制有害微生物的繁殖，達到同時一次完全凈化養殖水體的水質改良劑。
【發明內容】
[0006]本發明為了要解決現有技術中養殖水質污染嚴重、病害頻發、海參高死亡率、海參體內重金屬、化學殘留和抗生素殘留超標等現狀，而發明一種一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑及其制備方法。一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑主要由芽孢桿菌混合組成，由海參養殖環境中分離并篩選的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) YB-1CGMCC N0.5116、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) YB-2CGMCCN0.5117和彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)XH-1CGMCC N0.5115，以玉米粉和豆柏粉為主要發酵培養基，以麥飯石和稻殼作為吸附和懸浮載體，加工成固體粉劑。本發明中涉及的微生態制劑，于2011年08月05號送到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(中國科學院微生物研究所，郵編100101)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
[0007]本發明的主要方面是:一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑的制備方法，包括以下操作步驟:
[0008]①制備益生菌原液
[0009]將在LB瓊脂斜面培養基上生長良好的枯草芽孢桿菌YB-1CGMCC N0.5116、蠟狀芽孢桿菌YB-2CGMCC N0.5117和彎曲芽孢桿菌XH-1CGMCC N0.5115，分別加入2116E培養基，PH7.0~7.5，33~37°C震蕩培養12~16h，再以1:1:1的體積比混合，制備成益生菌原液；
[0010]②液態發酵培養
[0011]向在密閉式發酵反應器中加入發酵液，并按0.1~1%的體積比加入營養物質，再將步驟①制備的益生菌原液，按3-5%的體積比接種，進行發酵，壓力為0.1~0.25Mpa，37°C發酵24h，制得發酵產物 ；
[0012]③噴霧干燥處理
[0013]上述步驟②所得的發酵產物噴霧到吸附載體，干燥處理；
[0014]其中，步驟①所說的海水LB瓊脂培養基和2116E培養基，均為《分子克隆實驗指南》中培養基配方；
[0015]步驟②所說的營養物質由玉米粉:豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的
重量比組成；
[0016]步驟③所述的吸附載體的組成為:麥飯石粉和稻殼按4:1的體積比混合。
[0017]在優化條件下:上述的制備方法中，步驟①中菌懸液的菌體濃度均約為lX108cfu/ml。
[0018]在優化條件下:上述的制備方法中，步驟③所述的吸附載體中，麥飯石粉為150~200目；終產物吸附載體和益生菌混合物，載菌含量的終濃度約為108~101(lCfu/g。
[0019]在優化條件下:上述的制備方法中，向步驟③制得的產物中加入吸附載體的重量比為1:1~1000。
[0020]在優化條件下:上述的制備方法中，步驟③中發酵產物噴霧干燥到吸附載體的方法為:發酵培養液與載體重量比為1:1~4,干燥時間為12~24h,產物水份含量不高于5%。
[0021]本發明的另外一方面在于，利用上述的方法制備一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑產品。
[0022]本發明的另外一方面在于，利用上述的一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑在海參養殖方面的應用。
[0023]本發明的一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑環境耐受性強，漂浮性、懸浮性以及沉浮可控性好，對海參的養殖水體三維立體的凈化效果顯著，尤其在海參的育苗期和養成期定期潑灑該一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑，可以快速去除養殖水體中的重金屬離子和降解氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質，避免水體酸化和臭底，有效抑制病原菌，減輕環境對海參的應激反應，有效預防海參病害的發生，提聞海參養殖的質量和廣量。
【具體實施方式】
[0024]以下結合技術方案詳細敘述本發明的實施例。
[0025]實施例中所用原料均由常規方法制備或由商業途徑獲得。
[0026]LB瓊脂斜面培養基:其組成每升中含:胰酶解蛋白胨5g，酵母膏lg，海水晶33g，磷酸高鐵0.1g,瓊脂15g, 1000mL水，pH7.6。蛋白胨和酵母膏購于英國Oxoid公司，瓊脂粉購于北京奧博星生物技術有限責任公司，其他原料均購于上海生工生物工程股份有限公司。
[0027]2216E液體培養基:其組成每升中含:胰酶解蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高鐵0.lg，陳海水lOOOmL，pH7.6。蛋白胨和酵母膏購于英國Oxoid公司，其他原料均購于上海生工生物工程股份有限公司。
[0028]玉米粉和豆柏粉，均為100-200目，購于山東萬得福實業集團有限公司。
[0029]麥飯石粉，購于內蒙古自治區奈曼旗中華麥飯石開發有限公司，150-200目。
[0030]稻殼，購于大連賽姆集團。
[0031]本發明實施例中涉及的微生態制劑包括:由海參養殖環境中分離篩選的芽孢桿菌包括:枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) YB-1CGMCC N0.5116、臘狀芽抱桿菌(Bacilluscereus) YB-2CGMCC N0.5117 和彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)XH-1CGMCC N0.5115。
[0032]三株菌株保藏于2011年08月05號送到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國科學院微生物研究所，郵編100101)，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
[0033]下面通過實例進一步詳細描述本發明。
[0034]實施例1:
[0035]1.制備益生菌原液
[0036]將在LB瓊脂斜面培養基上生長良好的枯草芽孢桿菌YB-1CGMCC N0.5116、蠟狀芽孢桿菌YB-2CGMCC N0.5117和彎曲芽孢桿菌XH-1CGMCC N0.5115，分別加入2116E培養基，PH7.0~7.5，37°C震蕩培養12~16h，再以1:1:1的體積比混合，制備成益生菌原液，菌體濃度約為lX108cfu/ml。
[0037]2.液態發酵培養
[0038]向在密閉 式發酵反應器中加入發酵液，并按0.1~1%的體積比加入營養物質，再將步驟①制備的益生菌原液，按3-5%的體積比接種，進行發酵，壓力為0.1~0.25Mpa，37°C發酵24h，制得發酵產物；
[0039]上述的營養物質由玉米粉:豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的重量比組成。
[0040]3.噴霧干燥處理[0041]吸附載體由150-200目的麥飯石粉和稻殼按體積比為2:1混合配制；
[0042]上述步驟2所得的發酵產物噴霧干燥到上述吸附載體中，發酵產物與載體重量比為1:4，干燥時間為24h，產物水份含量不高于5%，制得一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑。
[0043]實施例2
[0044]1.制備益生菌原液
[0045]將在LB瓊脂斜面培養基上生長良好的枯草芽孢桿菌YB-1CGMCC N0.5116、蠟狀芽孢桿菌YB-2CGMCC N0.5117和彎曲芽孢桿菌XH-1CGMCC N0.5115，分別加入2116E培養基，PH7.0~7.5，37°C震蕩培養12~16h，再以1:1:1的體積比混合，制備成益生菌原液，菌體濃度約為lX108cfu/ml。
[0046]2.液態發酵培養
[0047]向在密閉式發酵反應器中加入發酵液，并按0.1~1%的體積比加入營養物質，再將步驟①制備的益生菌原液，按3-5%的體積比接種，進行發酵，壓力為0.1~0.25Mpa，37°C發酵24h，制得發酵產物；
[0048]上述的營養物質由玉米粉:豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的重量比組成。
[0049]3.噴霧干燥處理
[0050]吸附載體由150-200目的麥飯石粉和稻殼按體積比為4:1混合配制；
[0051]上述步驟2所得的發酵產物噴霧干燥到上述吸附載體中，發酵產物與載體重量比為1:4，干燥時間為24h，產物水份含量不高于5%，制得一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑。
[0052]使用效果
[0053]選取3處條件相同的海參養殖圈，平均水深1.5-2m，參苗規格30_50頭/500g，密度在9-10頭/m2。
[0054]1號圈為對照組(未使用載一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑)，2、3號圈為實驗組(使用一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑);實驗組除了定期潑灑實施例1、2所述的一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑之外，飼喂方式和管理方法與對照組一樣。
[0055]實驗周期為2013年9月到10月，大約45天，實驗組每隔3天潑灑1次，潑灑量為5g/m3。
[0056]實驗期間，定期檢測水質，觀察海參攝食情況，每隔15天下水摸探，測量海參體重。鹽度為35-38%。，水溫為16-23°C, pH為7.6-8.5，溶解氧不低于4mg/L。
[0057]1.使用本實施例1、2后第45天的海參養殖圈的水質指標比較結果
【權利要求】
1.一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑的制備方法，包括以下操作步驟:①制備益生菌原液將在LB瓊脂斜面培養基上生長良好的枯草芽孢桿菌YB-1CGMCC N0.5116、蠟狀芽孢桿菌YB-2CGMCC N0.5117和彎曲芽孢桿菌XH-1CGMCC N0.5115，分別加入2116E培養基，PH7.0~7.5，33~37°C震蕩培養12~16h，再以1:1:1的體積比混合，制備成益生菌原液；②液態發酵培 養向在密閉式發酵反應器中加入發酵液，并按0.1~1%的體積比加入營養物質，再將步驟①制備的益生菌原液，按3-5%的體積比接種，進行發酵，壓力為0.1~0.25Mpa，37°C發酵24h，制得發酵產物；③噴霧干燥處理上述步驟②所得的發酵產物噴霧到吸附載體，干燥處理；其中，步驟①所說的海水LB瓊脂培養基和2116E培養基，均為《分子克隆實驗指南》中培養基配方；步驟②所說的營養物質由玉米粉:豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的重量比組成；步驟③所述的吸附載體的組成為:，麥飯石粉和稻殼按4:1的體積比混合。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟③所述的吸附載體中，麥飯石粉為150~200目。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟①中菌懸液的菌體濃度均為lX108cfu/ml。
4.根據權利要求1、2或3中任一項所述的制備方法，其特征在于還包括:向步驟③制得的產物中加入吸附載體，混合并使菌含量的終濃度為約為Kf-KTcfu/g。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，向步驟③制得的產物中加入吸附載體的重量比為1:1~1000。
6.根據權利要求1、2或5中任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟③中發酵產物噴霧干燥到吸附載體的方法為:發酵培養液與載體重量比為1:1~4，干燥時間為12~24h，產物水份含量不高于5%。
7.如權利要求1所述的方法制備的一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑。
8.如權利要求7所述的一步法除雜質、抑制有害微生物繁殖的海參養殖水體改良劑在海參養殖方面的應用。
【文檔編號】C02F3/34GK103693755SQ201310723049
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】徐永平, 尤建嵩, 李淑英, 李紀彬, 周俊龍, 徐牧, 馬欣, 高玉平, 劉士茹 申請人:大連賽姆生物工程技術有限公司