一株可降解石油烴的溶桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株可降解石油烴的溶桿菌——海連溶桿菌2-5，及其在微生物降解石油烴中的應用。海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2013年1月18日，保藏編號CGMCC No.7164。本發明的海連溶桿菌2-5是溶桿菌屬的新菌種，分離自石油污染的海綿樣品，能夠有效降解石油烴并利用石油作為生長的唯一碳源。在人工海水培養基中，7天內對石油烴（初始濃度為1000mg/L）的平均降解率為67.8%。本發明的海連溶桿菌2-5可用于石油烴的降解。
CGMCC No7164
20130118
【專利說明】-株可降解石油烴的溶桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株可降解石油烴的溶桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 隨著石油工業的迅速發展，人們越來越多地涉及海上石油開發，因此，井噴、運 輸船舶的石油泄漏、撞船、沉船以及輸油管道的泄漏等事故，造成的海上溢油事故也時 有發生，嚴重污染了海洋環境，給海洋的生態平衡帶來了極大危害。因此，需要采取及 時有效的措施對石油污染進行迅速處理。而目前公認的處理海洋石油污染最環保的方 法就是利用微生物降解石油。據統計已經發現能夠降解石油的微生物超過了 200多種， 在海洋環境石油經降解占主導地位的微生物主要包括：無色桿菌屬（Achromobacter )、 不動桿菌屬（Acinetobacter)、產喊桿菌屬（Alcaligenes)、芽抱桿菌屬（Bacillus)、黃 桿菌屬（Flavobacterium)、棒桿菌屬（Coryneforms)、微桿菌屬（Microbacterium)、放 線菌屬（Actinomycetes)、諾卡氏菌屬（Nocardia)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、食燒菌 屬（Alcanirorax)、解環菌屬（Cycloclasticus)、海桿菌屬（Marinobacter)、海細菌屬 (Marinobacterium)、油螺旋菌屬（Oleispira)、海旋菌屬（Thalassospira)和微球菌屬 (Miro coccus)等。目前對降解微生物資源的研究已成為一個新的重要方向，越來越多的石 油降解微生物被發現，國際上已建成了專門的降解微生物菌群資源庫。分離篩選對石油烴 具有降解能力的菌株，是研究微生物降解石油機理及對石油烴污染環境進行生物修復的基 礎。石油降解菌的研究已經從近海環境擴展到大洋、極地等環境，這些降解菌主要是從海 水、海泥樣品中分離獲得，而從石油污染后引發一系列變化的生物體內篩選降解菌的研究 并不多見。
[0003] 海綿作為濾食性的低等海洋動物，體內共生著豐富的微生物菌群，菌群的多樣性 與海綿種屬及其生存環境密切相關。同時海綿生存環境的變化(包括環境惡化)，將會導致 其共生微生物多樣性的變化。海綿微生物和海綿互利共生，不僅能為海綿提供營養物質和 能量，還可通過生產和釋放一些具有生物活性的化合物，參與海綿對抗化學污染的生物防 御系統，其中一個重要的功能是降解污染。從海綿中篩選出具有高效石油降解能力的微生 物，探索該類海綿相關微生物對環境的修復作用，及其與宿主在生物修復方面的協同作用， 形成一種高度符合自然規律的生物修復方法，為海洋石油污染的生物修復提供理論和技術 基礎。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一株可降解石油烴的溶桿菌。
[0005] 本發明所提供的溶桿菌是從大連灣潮間帶原油污染的海綿樣品中篩選到的。根 據其形態特征、培養特性、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析等證實屬于溶桿菌屬 (Lysobacter)新種，命名為海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5。海連溶桿菌 (Lysobacter hymeniacidonis) 2-5已于2013年1月18日保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研 究所)，保藏登記號為CGMCC NO. 7164。
[0006] 海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 為革蘭氏陰性菌， 細胞呈桿狀，無鞭毛，沒有運動性，大小為（1.1?1.2) μ mX (0.2?0.3) μ m。在LB培養 基上培養3天，該菌株的菌落呈大圓形、光滑、較大、隆起、淺棕黃色、半透明、邊緣整齊等特 征。
[0007] 海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 屬于好氧菌，可生 長的pH范圍為6. 0?8. 0,最適生長pH值為7. 2 ;可生長溫度范圍為15?42°C，最適生長 溫度為30°C ;該菌株能在0?6%(w/v)鹽度范圍內生長，最適生長鹽度為3%。
[0008] 海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164接觸酶和氧化酶陽 性，β -半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、脲酶和色氨酸脫氨酶 陰性；該菌株的檸檬酸鹽利用、七葉靈水解、V. Ρ.反應、明膠液化陽性，淀粉水解和硝酸鹽 還原陰性。該菌株能利用糖原、L-阿拉伯糖、a-環糊精、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖 胺、核糖醇、L-阿拉伯糖、D-阿糖醇、D-纖維二糖、D-果糖、a-D葡萄糖、m-肌醇、a-D-乳 糖、乳果糖、麥芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、甲基葡萄苷、D-綿子糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、 D-海藻糖、松二糖、木糖醇、乙酸、順-阿康酸、檸檬酸、甲酸、D-半乳糖酸內酯、D-半乳糖醛 酸、D-葡糖酸、b-甲基葡糖苷、D-葡糖醛酸、a-羥基丁酸、b-羥基丁酸、g-羥基丁酸、a-氧 代丁酸、a-氧代戊二酸、D，L-乳酸、丙二酸、丙酸、奎尼酸、D-已糖酸、琥珀酰胺酸、葡糖醛 酰胺、L-丙氨酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘 氨酰天冬氨酸、甘氨酰谷氨酸、羥基脯氨酸、L-亮氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、 L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、D，L-肉堿、肌苷和尿苷作為唯一碳源和能源。
[0009] 海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 細胞中的脂肪酸 主要包括異式十六碳飽和脂肪酸（15. 10%)、異式十五碳飽和脂肪酸（14. 35%)、c〇9c異式 --h七碳單不飽和脂肪酸（9. 45%)、3_輕基異式十三碳飽和脂肪酸（8. 37%)、異式^ 碳飽 和脂肪酸（7. 66%)、ω 7c_十六碳單不飽和脂肪酸/ω 6c_十六碳單不飽和脂肪酸（6. 45%)、 十六碳飽和脂肪酸（5. 33%)、c〇8c型環式 h九碳飽和脂肪酸（5. 20%)、ω 7c異式--h八 碳單不飽和脂肪酸（3. 95%)、異式十七碳飽和脂肪酸（2. 54%)、環式十七碳飽和脂肪酸 (2. 30%)、反異式十五碳飽和脂肪酸（2. 11%)、3-輕基十碳飽和脂肪酸（1. 66%)、異式十碳飽 和脂肪酸（1. 33%)、反異式十七碳飽和脂肪酸（1. 32%)、3_羥基十八碳飽和脂肪酸（1. 30%)、 異式十四碳飽和脂肪酸（1. 23%)、I型-異式/B型-反異式十七碳單不飽和脂肪酸（1. 22%) 和3-羥基八碳飽和脂肪酸（1. 00%)。
[0010] 海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 的 G+C 摩爾百分 含量為63. 88% ;該菌株的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示，與已發表的溶桿菌屬 的模式菌 Lysobacter concretionis KCTC12205、Lysobacter. daejeonensis DSM17634、 Lysobacter defluvii IMMIB APB_9T 和 Lysobacter spongiicola KMM329 的 16S rRNA 基 因序列的同源性分別為96. 0%、96%、96%和95%。
[0011] 海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 與上述模式菌 株Lysobacter concretionis KCTC122〇roNA雜交的同源性比較低，為23%;同時，該菌 株的生理生化特性、細胞壁脂肪酸組成也與上述模式菌株有明顯差異，說明海連溶桿菌 (Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 是溶桿菌屬的一個新菌種。
[0012] 本發明的另一個目的是提供一種降解石油烴的方法。
[0013] 本發明所提供的降解石油烴的方法，是用所述海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164對待測樣品進行處理，使石油烴得到降解。
[0014] 上述方法中，所述的應用為：以2216E為基礎培養基，對海連溶桿菌2-5菌種進行 擴大培養，以培養獲得的菌液為石油降解菌劑，加入到以原油為唯一碳源和能源的人工海 水培養基中，使海水培養基中的原油得到降解。
[0015] 以海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164為活性成分制備 的生物制劑也屬于本發明的保護范圍。
[0016] 本發明的海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164是溶桿菌 屬的新菌種，分離自石油污染的海綿樣品，能夠有效降解石油烴并利用石油烴作為生長的 唯一碳源。在人工海水培養基中，7天內對石油烴(初始濃度為1000mg/L)的平均降解率為 67.8%。本發明的海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 可用于石 油烴的降解。
[0017] 下面結合說明書附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步說明，并非對本發明的限 制。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018] 圖 1 為海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164 在掃描電子 顯微鏡下的形態照片；
[0019] 圖 2 為海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164 在透射電子 顯微鏡下的形態照片；
[0020] 圖 3 為海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164 的 16S rRNA 基因序列系統發育樹分析圖；
[0021] 圖 4 為海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164 對石油煙的 降解曲線圖；
[0022] 海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5已于2013年1月18日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區大屯路， 中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC NO. 7164。
【具體實施方式】
[0023] 下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0024] 實施例 1 :海連溶桿菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 的分離 及鑒定
[0025] 一、降解石油烴菌株的分離
[0026] 分離培養基：（1)人工海水培養基（ASM) =MgSO4 · 7Η207· 0g/L，KC10. 7g/L， ΚΗ2Ρ042· 0g/L，Na2HP043. 0g/L，NH4NO3L 0g/L，NaC130g/L，Crude oil lg/L，ΡΗ7· 2 ;微量元素 溶液 10mL。微量元素組成為：CaCl220mg/L，FeCl350mg/L，CuSO 4O. 5mg/L，MnCl2. 4Η200· 5mg/ L，ZnSO4. 7H2010mg/L。（2)固體平板分離培養基（ASMl):上述人工海水培養基加18g/L瓊 脂；（3)固體平板純化培養基：2216E (Difco)。
[0027] 將石油溶于石油醚中，配制成濃度為100mg/mL的石油溶液。
[0028] 將采自大連灣石油污染海域海綿樣品，用無菌手術刀切成小塊，在燒杯中用無菌 海水將樣品洗滌3次，以除去樣品表面附著的微生物和其它雜質，在無菌研缽中研磨5min， 使之成勻漿狀，取5mL，加入到滅菌的含IOOmL人工海水培養基ASM的500mL搖瓶中，以石油 (濃度0. 5?lg/L)為唯一碳源進行富集培養，置于28°C，200r/min搖床中培養，做為第一 次富集培養液，7天后，取5mL的第一次富集培養液轉接入新鮮的人工海水培養基中，再進 行富集培養，做為第二次富集培養液，7天后，取第二次富集培養液5mL，轉接入新鮮的人工 海水培養基中，共轉接3次。將最終的富集培養液進行ΚΓ 1、1(Γ2、KT3梯度稀釋，涂布固體 平板分離培養基ASMl上；以不加原油的人工海水培養基為空白對照平板，28°C培養7?10 天，挑取單菌落于2216E純化平板，劃線分離單菌，得到純化的單菌落。挑取純化后的單菌 落接種在裝有5mL液體培養基的2216E試管中，將試管置于200r/min振蕩培養箱中，28°C 振蕩培養72h左右，取200 μ L菌液加入裝有含I. 8mL20%甘油水溶液的凍存管中，-70°C放 置保存備用。
[0029] 結果表明，空白對照平板上沒有任何菌落生長，說明沒有外加石油作為碳源的平 板上，海水樣本中的微生物無法生長；相應的，在加有石油的平板上有菌株能夠生長，說明 這些單菌落對應的菌株能夠降解石油烴并以石油烴為唯一碳源生長。挑取能夠降解石油 烴的單菌落2-5作進一步研究。
[0030] 二、菌株的形態特征
[0031] 將上述步驟一分離得到的菌株2-5接種到2216E培養基中，當細胞生長至對數生 長后期，菌落大小穩定后，進行單菌落平均狀態的描述。主要包括菌落的大小、顏色、透明 度、濕潤度、菌落表面狀態(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(是否整齊、不規 貝IJ、放射狀等)。
[0032] 將處于對數生長期的細胞，采用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細胞形 態，結果如圖1和圖2所示；同時進行革蘭氏染色，于40X 100倍的光學顯微鏡下觀察菌體 細胞的形態。
[0033] 結果表明，上述步驟一篩選到的菌株菌落直徑為2. 5?3mm，呈圓形、光滑、隆起、 黃色、有光澤、半透明、邊緣整齊；在電子顯微鏡下觀察，菌體細胞呈桿狀、無鞭毛，沒有運動 性，大小為（I. 1 ?1. 2) μ--Χ (0· 2 ?0· 3) μ--。
[0034] 二、菌株的生長特性
[0035] 上述步驟一篩選到的菌株屬于革蘭氏陰性、好氧細菌。該菌株最適生長pH值是 7. 2,可生長pH范圍是6. 0?8. 0 ;最適生長溫度為30°C，可生長的溫度范圍為15?42°C。 該菌株屬于海洋細菌，生長依賴于鹽的存在，能在〇?6 (w/v)鹽度范圍內生長繁殖，最適 生長鹽度3%。
[0036] 四、菌株的生化特征
[0037] 1、碳源利用
[0038] 利用Biolog微生物自動鑒定系統測試菌株對95種碳源的利用情況。先將待測菌 株的純培養菌落制成細胞懸液，然后接種于GN2鑒定板上培養，再用Biolog Microstation 軟件讀取數據，確定碳源利用情況。
[0039] 2、其它生化特征
[0040] 該菌株的接觸酶、氧化酶、β -半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨 酸脫羧酶、脲酶和色氨酸脫氨酶活性利用ΑΡΙ20Ε生化試劑盒檢測；菌株的檸檬酸鹽利用、 七葉靈水解、淀粉水解、V. Ρ.反應、明膠液化和硝酸鹽還原反應利用ΑΡΙ20ΝΕ生化試劑盒檢 測。
[0041] 以上實驗結果表明，上述步驟一篩選到的菌株能利用糖原、L-阿拉伯糖、a-環糊 精、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、核糖醇、L-阿拉伯糖、D-阿糖醇、D-纖維二糖、D-果 糖、a-D葡萄糖、m-肌醇、a-D-乳糖、乳果糖、麥芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、甲基葡萄苷、 D-綿子糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、D-海藻糖、松二糖、木糖醇、乙酸、順-阿康酸、檸檬酸、甲 酸、D-半乳糖酸內酯、D-半乳糖醛酸、D-葡糖酸、b-甲基葡糖苷、D-葡糖醛酸、a-羥基丁 酸、b-羥基丁酸、g-羥基丁酸、a-氧代丁酸、a-氧代戊二酸、D，L-乳酸、丙二酸、丙酸、奎尼 酸、D-已糖酸、琥珀酰胺酸、葡糖醛酰胺、L-丙氨酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天 冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰天冬氨酸、甘氨酰谷氨酸、羥基脯氨酸、L-亮氨酸、 L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、D，L-肉堿、肌苷 和尿苷作為唯一碳源和能源。該菌株的接觸酶和氧化酶陽性，β_半乳糖苷酶、精氨酸雙水 解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、脲酶和色氨酸脫氨酶陰性；該菌株的檸檬酸鹽利用、七 葉靈水解、V. Ρ.反應、明膠液化陽性，淀粉水解和硝酸鹽還原陰性。
[0042] 五、與溶桿菌屬模式菌株生理生化特征比較
[0043] 將上述步驟一篩選到的菌株生理生化特征與溶桿菌屬模式菌株（L. spongiicola DSM 21749T,L. concretionis KCTC 12205T, L daejeonensis DSM 17634T, L defluvii DSM 18482τ)的生理生化特征相比較，結果見表1所示。
[0044] 表1篩選到的菌株與溶桿菌屬模式菌株的生理生化特征比較
[0045]
【權利要求】
1. 海連溶桿菌2_5(Lysobacter hymeniacidonis2_5)，保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，保藏日期2013年1月18日，保藏編號CGMCC NO. 7164。
2. 如權利要求1所述的海連溶桿菌2-5,其特征在于：所述海連溶桿菌2-5菌落特征和 生理生化特性為：桿狀，大小為0.2?0.3 iimXl. 1?1.2 iim，革蘭氏染色為陰性，在LB固 體培養基30°C培養2?3天后，菌落呈淺棕黃色，圓形，邊緣整齊，表面光滑，易挑起；接觸 酶和氧化酶陽性，V. P.反應陽性，淀粉水解陰性，檸檬酸鹽利用陽性，硝酸鹽還原陰性，七葉 靈水解陽性，明膠液化陽性。
3. 如權利要求1所述的海連溶桿菌2-5,其特征在于：所述海連溶桿菌2-5的16S rRNA 序列為： GCGGCAGCTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGAGAGAGCTTGCT CTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATGCGTCGGAATCTGC CTATTTGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACG ACCTACGGGTGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCAGATAGATG AGCCGACGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGC GACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGA CAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGC CTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTACGGGAAGAAACGCGATCGGTTAA TACCCGGTCGAACTGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTTC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAAT TACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA AGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGATACTGGCAGGCTAGA GTGCGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTA GATATCGGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGACCAGCA CTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACC CTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGGACACTT AGGTCTTCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGAAGT ACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAACCTTACC TGGCCTTGACATCCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG GAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGC CAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGCGACAAGCC GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAG GGCTACACACGTACTACAATGGTGGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGC GACGGTGAGCCAATCCCAGAAACCCCATCTCAGTCCGGATTGGAGTC TGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGC ATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAC ACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGA GGACGGTACCACGGAGAT 。
4. 一種權利要求1?3任一所述的海連溶桿菌2-5在降解海洋環境石油烴污染中的應 用。
5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于：以2216E為種子培養基，對海連溶桿菌2-5 菌種進行培養，將菌種接種到種子培養基2216E中培養獲得菌懸液，菌懸液以0. 5?2 X 106個細胞/mL培養基的接種量接種到種子培養基中，30°C、轉速為200r/min培養48h，得菌液， 以培養獲得的菌液為石油降解菌劑，加入到含原油〇. 5?lg/L的海水樣品或以原油為唯一 碳源的人工海水培養基(ASM)中，使海水樣品或人工海水培養基中的原油得到降解。
6. 如權利要求5所述的應用，其特征在于所述人工海水培養基(ASM)各組分終濃度為： MgS04 ? 7H207. Og/L, KC10. 7g/L, KH2P042. Og/L, Na2HP043. Og/L, NH4N031. Og/L, NaC130g/L, Crude oillg/L，PH7. 2 ;微量元素溶液 lOmL ; 微量元素組成為：CaCl220mg/L，FeCl350mg/L，CuS040. 5mg/L，MnCl2. 4H200. 5mg/L， ZnS04. 7H2010mg/L〇
7. 如權利要求4所述的應用，其特征在于：所述應用按如下步驟進行： (1) 將5?10g原油溶于約5?10ml的石油醚中，過濾除菌，加入到含100mL人工海水 培養基的500mL搖瓶中，使原油在培養基中的終濃度為0. 5?lg/L ; (2) 將海連溶桿菌2-5種子接種到2216E培養基，30°C、轉速為200r/min培養24h，得 菌液，將獲得的菌液按接種量為5%體積比，加入到上述人工海水培養基（ASM)中，在30°C、 轉速為200r/min的好氧避光條件下培養7天；同時，以不加石油的人工海水培養基作為對 照，以不接種海連溶桿菌2-5的人工海水培養基作為空白對照，用于扣除石油揮發的影響。
【文檔編號】C02F3/34GK104371942SQ201310357456
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月15日 優先權日:2013年8月15日
【發明者】薛松, 信艷娟, 曹旭鵬, 吳佩春 申請人:中國科學院大連化學物理研究所