專利名稱：一株低溫氨氮降解菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株氨氮降解菌。
背景技術：
氨氮(NH3-N)以離子態氨(NH4+)和非離子態氨(NH3)兩種形式存在于水中。傳統生物去除水中氨氮的方法是在有氧的條件下利用自養型硝化細菌將水中NH3-N氧化成N03_-N，之后在缺氧的條件下利用異養型反硝化細菌將N03_-N還原成N2或N20。這種傳統氨氮去除方式存在以下弊端:(I)上述反應需要在兩個獨立的缺氧和好氧環境條件下才能完成，在工藝中，需要建設有缺氧池和好氧池，增加了占地面積，并使運行維護更復雜；(2)硝化菌對環境條件敏感，最適生長溫度20 30°C，15°C以下時，硝化速度下降，難以適應低溫環境；(3)硝化細菌可將水中NH3-N轉化為N02_-N和N03__N，如果工藝運行不當，會導致出水NO2--N含量升高，危害人體健康。除了上述傳統意義上的自養硝化菌外，有些異養微生物也能進行硝化作用，這些菌株被定名為異養硝化菌。目前已分離出大量的異養型硝化菌，如Peseudomonas spp、Alcaligenes faecalis>Thiosphaera pantotropha、Thauera mechernichensis 等，石開究表明，異養硝化菌不但可在異養的條件下進行硝化作用，同時可在有氧的條件下進行反硝化，克服了傳統生物脫氮技術需要缺氧、好氧兩個環境體系及no2_-n含量易積累等問題。且異養型微生物具有生長速度快，適應性強等優點，使得異養硝化菌受到廣泛關注。
發明內容
本發明目的是提供一株低溫氨氮降解菌。一株低溫氨氮降解菌，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.7487，保藏日期為2013年4月18日，保藏地址為北京市朝陽區北辰路I號院3號，它命名為哈工大異養硝化不動細菌L16(Acinet0bacterHeteronitrifihit L16)。哈工大異養硝化不動細菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16),菌株的形態特征:它屬于短桿菌屬，長為0.6 1.0iim,寬為1.2 1.8iim,無鞭毛；革蘭氏染色陰性，但不易脫色；無芽孢；菌落圓形，光滑，凸起。哈工大異養硝化不動細菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16),菌株的生理生化特征:它為專性好氧菌，可在2 35°C、pH6 8條件下生長；5°C，pH值7.2為最適生長條件，為嗜冷菌；接觸酶陰性，氧化酶陰性，可進行硝酸鹽的還原，可以乙酸鈉為單一碳源進行生長，可利用糊精、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-海藻糖、蔗糖、D-松二塘、水 蘇糖、D-棉籽糖、a-D-乳糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、果膠、D-半乳糖醛酸、6-磷酸-D-果糖、丙酸、丁酸鈉、溴酸鈉、L-氨基戊二酸、L-絲氨酸，可抵抗潔霉素，奈啶酸，褐霉素，亞碲酸鉀，三乙酰竹桃霉素，萬古霉素，氨曲南，四氮唑紫，二甲胺四環素；不能在5%以上NaCl溶液中生長。哈工大異養硝化不動細菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16),菌株的分子生物學鑒定結果:16S rRNA序列GenBank注冊號為KC843489，與其相近種屬不動細菌的魯菲不動桿菌(Acinetobacter Iwoffii)的相似性為98 %，應用DNA-DNA雜交方法，哈工大異養硝化不動細菌L16 (AcinetobacterHeteronitrifihit L16)與魯菲不動桿菌(Acinetobacter Iwoffii)進行雜交，同源雜交率為30.2%,為一新種細菌。本發明一株低溫氨氮降解菌，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.7487，保藏日期為2013年4月18日，保藏地址為北京市朝陽區北辰路I號院3號，它命名為哈工大異養硝化不動細菌L16 (AcinetobacterHeteronitrifihit L16)。本發明一株低溫氨氮降解菌，所屬分類學“種”為一新種，哈工大異養硝化不動細菌L16 (Acinetoba cter Heteronitrifihit L16),為首次命名的分類學新菌種。G+C45mol%，Genbank 序列注冊號為 KC843489。主要脂肪酸組成為 C12:_，C16:lu9c, C16:lu7c,
〇16:0，C18:lu9co本發明一株低溫氨氮降解菌，它命名為哈工大異養硝化不動細菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16),進行低溫飲用水氨氮降解,在菌株量達到IO7 IO9個/ml，以乙酸鈉為碳源，降解30min后測定氨氮降解速率，發現在氨氮初始濃度為55.0mg/L時,氨氮降解速率最高,可達9.56mg NH4+/L h。當初始氨氮濃度為5.0mg/L時，用乙酸鈉作為碳源，將C/N比為2，在溫度2°C，pH值7.2，150rpm (溶解氧大于5mg/L)條件下，對氨氮降解30min后,測定氨氮降解速率，降解速率可達6.36mg NH4VL h。
圖1為具體實施方式
一中哈工大異養硝化不動細菌L16 (AcinetobacterHeteronitrifihit L16)的電子顯微結構形態圖。
具體實施例方式具體實施方式
一:本實施方式一株低溫氨氮降解菌，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.7487，保藏日期為2013年4月18日，保藏地址為北京市朝陽區北辰路I號院3號，它命名為哈工大異養硝化不動細菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16)。本實施方式中一株低溫氨氮降解菌，它使用常規的分離、純化和篩選方法獲得，過程如下:取冬季松花江水樣5ml,接種至50ml篩選培養基中，在2°C、150rpm/min下富集7 IOd,梯度稀釋后,接種于固體培養基上,在2°C下培養3 5d,選取典型的單一菌落進行純化培養，將最終獲得的純培養菌株進行氨氮降解試驗，選取30min內對氨氮降解率達到50%以上的菌株。篩選培養基為:NH4Cl0.1 0.5g/L, CH3CH2ONa0.2 1.0g/L, MgSO4 7H200.01 0.05g/L, K2HPO40.05 0.2g/L, NaCl0.05 0.12g/L, MnSO4 4H200.0lg/L, FeSO40.0lg/L,維生素C0.002g/L, NADPH0.001g/L和余量的蒸餾水，pH值7.0 7.4。結果:所得到的菌，其菌體形態如圖1所示，它屬于短桿菌屬，長為0.6 1.0y m，寬為1.2 1.8 y m，無鞭毛；革蘭氏染色陰性，但不易脫色；無芽孢；菌落圓形，光滑，凸起；參照“常見細菌系統鑒定手冊.北京:科學出版社，2001.東秀珠，蔡妙英”進行生理生化特征測定；它為專性好氧菌，可在2 35°C、pH6 8條件下生長；5°C，pH值7.2為最適生長條件，為嗜冷菌；接觸酶陰性，氧化酶陰性，可進行硝酸鹽的還原，可以乙酸鈉為單一碳源進行生長，可利用糊精、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-海藻糖、蔗糖、D-松二塘、水蘇糖、D-棉籽糖、a-D-乳糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、果膠、D-半乳糖醛酸、6-磷酸-D-果糖、丙酸、丁酸鈉、溴酸鈉、L-氨基戊二酸、L-絲氨酸，可抵抗潔霉素，奈啶酸，褐霉素，亞碲酸鉀，三乙酰竹桃霉素，萬古霉素，氨曲南，四氮唑紫，二甲胺四環素；不能在5%以上NaCl溶液中生長。所得到的菌進行分子生物學鑒定:16S rDNA測序方法，提取細菌基因組DNA后進行16S rDNA序列擴增，用于擴增的PCR反應引物為通用引物:正向引物5，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ’ ；反向引物 5 ’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 ’。PCR 反應體系如下:模板DNA50 100ng，25iiL Taq酶混合液，0.5 y L正向引物，0.5 y L反向引物，加入無菌去離子水至50 u L0 PCR擴增條件:94°C預變形5min，之后94°C變性lmin，50 55°C擴增lmin，72°C延伸1.5min，經過30次循環后，72°C延伸5min。將獲得片段用于測序。參見 SEQ ID No:3。結果:16S rRNA序列GenBank注冊號為KC843489，與其相近種屬不動細菌的魯菲不動桿菌(Acinetobacter Iwoffii)的相似性為98 %，應用DNA-DNA雜交方法“具體參照文獻方法(常見細菌系統鑒定手冊.北京:科學出版社，2001.東秀珠，蔡妙英.)”，哈工大異養硝化不動細菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16)與魯菲不動桿菌(Acinetobacter Iwoffii)進行雜交，同源雜交率為30.2%,為一新種細菌。
—株低溫氨氮降解菌，它為哈工大異養硝化不動細菌L16 (AcinetobacterHeteronitrifihit L16),低溫飲用水氨氮降解工藝:將哈工大異養硝化不動細菌L16培養至IO7 IO9個/ml，取50ml在6000g離心IOmin獲得菌體沉淀，用無菌去離子水對菌體沉淀清洗2 3次，將菌體轉入50ml、氨氮濃度為55.0mg/L的降解溶液中，用乙酸鈉作為碳源，降解30min后測定氨氮降解速率，發現在氨氮初始濃度為55.0mg/L時,氨氮降解速率可達9.56mg NH4VL h。當初始氨氮濃度為
5.0mg/L時，用乙酸鈉作為碳源，C/N比為2，在溫度2°C，pH值7.2，150rpm (溶解氧大于5mg/L)條件下，對氨氮降解30min后,測定氨氮降解速率，降解速率可達6.36mgNH4+/L h ；可見，哈工大異養硝化不動細菌L16的降解時間僅為30min，更符合在飲用水處理工藝中，微生物的降解時間(20 40min)，能夠滿足飲用水處理的時間要求。
權利要求
1.一株低溫氨氮降解菌，其特征在于它已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.7487，保藏日期為2013年4月18日，保藏地址為北京市朝陽區北辰路I號院3號，它命名為哈工大異養硝化不動細菌L16 (AcinetobacterHete ronitrifihit L16)。
全文摘要
一株低溫氨氮降解菌，它涉及一株氨氮降解菌。一株氨氮降解菌已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.7487，保藏日期為2013.4.18，保藏地址為北京市朝陽區北辰路1號院3號，它命名為哈工大異養硝化不動細菌L16(Acinetobacter Heteronitrifihit L16)。本發明哈工大異養硝化不動細菌L16進行低溫飲用水氨氮降解，在菌株量達到107～109個/ml，初始氨氮濃度為5.0mg/L時，用乙酸鈉作為碳源，C/N比為2，在溫度2℃，pH值7.2，150rpm(溶解氧大于5mg/L)條件下，對氨氮降解30min后，降解速率可達6.36mg NH4+/L·h。
文檔編號C02F3/34GK103243050SQ20131019204
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月22日 優先權日2013年5月22日
發明者李偉光, 黃曉飛, 張多英, 秦雯 申請人:哈爾濱工業大學