專利名稱：利用誘導固化作用的耐砷細菌原位修復砷污染土壤的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用誘導固化作用的耐砷細菌原位修復砷污染土壤的方法，屬于生物環境污染修復技術領域。
背景技術：
砷是一種劇毒元素，自從1250年發現以來，已經發生了很多嚴重的砷中毒事件。全球至少有5000多萬人正面臨著地方性砷中毒的威脅，其中，亞洲的砷污染最為嚴重，主要集中在孟加拉國、印度和中國。土壤及水環境的砷污染已經成為一個受全世界廣泛關注的環境問題。砷通常是以As3+和As5+的形式出現在土壤中。砷化合物的毒性極強，砷對人的中毒劑量為0.01-0.052克，致死量為0.06-0.2克，已有研究發現高濃度的砷會增加患皮膚癌及膀胱、腎臟、肝臟和肺部腫瘤的風險。三價砷甚至能造成胎兒畸形和死亡。由于使用砷化合物的企業(如玻璃、顏料、農藥等)、采礦業及重金屬冶煉等工業的迅速發展，已造成了我國土壤環境的嚴重砷污染。現已在我國的多個礦區周圍的土壤中檢測到了高濃度的砷，如我國貴州、郴州、西安和新疆地區均已發現了砷濃度范圍高達ll-1217mg Kg—1的大面積土壤。我國于1983年在新疆的奎屯開墾區發現了高砷污染地區，是我國大陸最早發現地方性砷中毒的省區，此地土壤中砷濃度高達7.27-75.38mg Kg'據不完全統計，我國現生活在砷污染地區的人口數已經超過了兩百萬。由于土壤的鹽堿化加速砷從礦物及巖石等中溶出和遷移，并會在一定程度上阻礙污染物的生物可利用性，所以要去除像新疆這種干旱區鹽堿地土壤中的砷是更加困難的。新疆礦產資源非常豐富，隨著西部大開發政策的實施，對新疆礦產資源的開發力度也越來越大，種種開發活動已經引起了嚴重的土壤砷污染。不同來源的砷會在礦渣或土壤中長期積累，然后含砷污染物會慢慢遷移進入到其他地區或是水體中，就會使污染區域不斷擴大。因此，我們迫切需要一種方法對含砷尾礦及高砷土壤進行治理和修復，至少要先找到一種能夠阻止砷溶出、遷移進入地表及地下水體的高效的、經濟實用的、環境友好型的技術方法。無疑，生物修復方法，特別是廣泛存在、易培養的細菌就成了最具潛力的方法。目前，國際上公認的最有前途的砷污染土壤的處理方法就是生物修復技術。利用生物技術修復砷污染環境現已有很多應用實例，但是修復效果大都不理想。如大家熟知的超積累植物蜈蚣草，已在很多土壤砷污染地區得以實際應用。但是植物修復有一定的局限性，很多植物都不能在像中國西北部這樣的干旱惡劣的環境中生存。而且植物修復周期太長、效率較低。除此之外，還有包括硫還原菌在內的各種細菌修復方法也被應用于砷污染環境的修復之中。但是由于吸附了砷的菌體無法分離出來，依然存在于環境中，然后由于各種原因，已經被細菌吸收了的砷又會重新釋放到環境中。另外，大部分微生物對氧化還原條件和有毒金屬價態改變的敏感性等問題，都導致了生物修復技術在實際中的應用還是有一定困難的。另外，某些高鹽度土壤更加大了生物修復的難度。因此，這些不足就使我們迫切需要找到一種實用、經濟、高效的土壤原位修復技術。發明內容
本發明的目的是，提供一種利用誘導固化作用的耐砷細菌原位修復砷污染土壤的方法，該方法首先通過逐次增加營養肉湯培養基中的砷含量，分離出一種耐高濃度砷環境能產生較多尿素分解酶的耐砷細菌；然后將耐砷細菌置于尿素酶和CaCl2的營養湯培養基中，富集得到具有鈣化作用耐砷細菌菌液；再將富集得到鈣化作用耐砷細菌CR5菌液與含砷的污染土壤中混合形成混合溶液，使得混合液pH呈現微弱堿環境至pH為8-9，將混合溶液置于濕潤環境下培養，鈣化作用耐砷細菌通過誘導固化作用將富含砷污染土壤中砷得到固定，使砷污染土壤得到原位修復。該方法操作簡便、易于控制，成本低，可廣泛用于重金屬土壤污染的修復。本發明所述的一種利用誘導固化作用的耐砷細菌原位修復砷污染土壤的方法，其特征在于按下列步驟進行:a、選用砷污染嚴重地區土壤置于帶蓋的滅菌瓶中，將土壤樣品置于營養肉湯錐形瓶中，營養肉湯PH為8-8.5，砷含量為IOOmg L—1，然后將錐形瓶置于轉速為130rpm mirT1，溫度為30°C的條件下培養48h，得到菌液；b、將培養得到的菌液分別依次接入砷含量為IOOmg r\250mgr\500mg L—1的營養肉湯培養基中，按常規方法分離得到耐砷細菌，該耐砷細菌在基因庫的代碼為CR5，編號為 HQ331532 ；C、然后將耐砷細菌CR5置于質量含量為2%的尿素酶、20-60禮17匕(:12和砷含量為100-500mg L—1的營養湯培養基中，將混合液置于轉速為130rpm mirT1,溫度為30°C的條件下培養5-7天，富集得到鈣化作用耐砷細菌CR5菌液，所得到的菌液pH為8-9 ；d、將富集得到具有鈣化作用耐砷細菌CR5菌液100-300ml與50_100g含砷量為200-600mg Kg—1的污染土壤進行混合,形成混合溶液，混合液pH呈現微弱堿環境至pH為8-9，將混合溶液置于濕潤環境下培養7-15天后終止實驗，鈣化作用耐砷細菌CR5通過鈣化作用將富含砷污染土壤中砷得到固定，砷污染土壤得到原位修復，阻止其向周圍土壤及地表或地下水中遷移。步驟b和步驟c中選用的營養肉湯培養基為蛋白胨IOg L—1、牛肉膏1.5g L—1、酵母粉1.5g Γ1和氯化鈉5g L'步驟a中選用的污染土壤為高鹽環境下的砷污染土壤，砷污染環境為其土壤中重金屬為可交換狀態，且與碳酸鹽相互結合，包括砷污染土壤、銫污染土壤、銅污染土壤、鉛污染土壤。步驟d中形成混合溶液中的菌液菌密度為107CFU/ml。本發明所述的利用誘導固化作用的耐砷細菌原位修復砷污染土壤的方法，具體工藝步驟是:耐砷細菌的分離:選用砷污染嚴重地區土壤置于帶蓋的滅菌瓶中，稱取l_2g 土壤樣品置于含50ml營養肉湯的錐形瓶中，其營養肉湯pH為8-8.5，三價砷離子含量為IOOmgΙΛ然后將錐形瓶置于轉速為130rpm mirT1，溫度為30°C的條件下培養48h，將培養得到的菌液分別依次接入三價砷離子含量為IOOmg r\250mg r\500mg L—1的營養肉湯培養基中，其他培養條件不變分離得到耐砷細菌；誘導固化作用耐砷細菌馴化富集:將分離得到的耐砷細菌置于質量含量為2%的尿素酶、20-60mM L-1CaCl2和三價砷離子含量為100_500mg L—1的營養湯培養基中，將混合液置于轉速為130rpm mirT1，溫度為30°C的條件下培養5天-7天富集得到鈣化作用耐砷細菌菌液，所得到的菌液PH為8-9 ；誘導固化作用細菌修復砷污染土壤:將富集得到具有誘導固化作用耐砷細菌菌液100-300 ml與含三價砷離子200-600mg Kg-1的50_100g的污染土壤中混合形成混合溶液，其中菌液菌密度為107CFU/ml，混合液pH呈現微弱堿環境至pH為8_9，將混合溶液置于濕潤環境下培養7-15天后終止實驗，鈣化作用耐砷細菌通過鈣化作用將富含砷污染土壤中砷得到固定，砷污染土壤得到原位修復，阻止其向周圍土壤及地表或地下水中遷移。本發明所述的利用誘導固化作用的耐砷細菌原位修復砷污染土壤的方法，該方法中分離的耐砷細菌在基因庫的代碼為CR5，編號為HQ331532 ；
權利要求
1.一種利用誘導固化作用的耐砷細菌原位修復砷污染土壤的方法，其特征在于按下列步驟進行: a、選用砷污染嚴重地區土壤置于帶蓋的滅菌瓶中，將土壤樣品置于營養肉湯錐形瓶中，營養肉湯pH為8-8.5，砷含量為100 mg L-1，然后將錐形瓶置于轉速為130 rpm min—1，溫度為30°C的條件下培養48 h，得到菌液； b、將培養得到的菌液分別依次接入砷含量為100mg L_\250 mg L—1和500mg Γ1的營養肉湯培養基中，按 常規方法分離得到耐砷細菌，該耐砷細菌在基因庫的代碼為CR5，編號為 HQ331532 ； C、然后將耐砷細菌CR5置于質量含量為2%的尿素酶、20- 60 mM I/1 CaCl2和砷含量為100- 500 mg L4的營養湯培養基中，將混合液置于轉速為130rpm mirT1 ,溫度為30°C的條件下培養5-7天，富集得到鈣化作用耐砷細菌CR5菌液，所得到的菌液pH為8-9 ； d、將富集得到具有鈣化作用耐砷細菌CR5菌液100-300 ml與50_100g含砷量為200-600 mg Kg—1的污染土壤進行混合,形成混合溶液,混合液pH呈現微弱堿環境至pH為8-9，將混合溶液置于濕潤環境下培養7-15天后終止實驗，鈣化作用耐砷細菌CR5通過鈣化作用將富含砷污染土壤中砷得到固定，砷污染土壤得到原位修復，阻止其向周圍土壤及地表或地下水中遷移。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b和步驟c中選用的營養肉湯培養基為蛋白胨IOg L'牛肉膏1.5g L'酵母粉1.5g L—1和氯化鈉5g L'
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中選用的污染土壤為高鹽環境下的砷污染土壤，砷污染環境為其土壤中重金屬為可交換狀態，且與碳酸鹽相互結合，包括砷污染土壤、銫污染土壤、銅污染土壤、鉛污染土壤。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟d中形成混合溶液中的菌液菌密度為107-108CFU/mlo
全文摘要
本發明涉及一種利用誘導固化作用的耐砷細菌原位修復砷污染土壤的方法，該方法首先通過逐次增加營養肉湯培養基中的砷含量，分離出一種耐高濃度砷環境能產生較多尿素分解酶的耐砷細菌；然后將耐砷細菌置于含有尿素酶和CaCl2的營養湯培養基中，富集得到具有鈣化作用耐砷細菌菌液；再將富集得到鈣化作用耐砷細菌CR5菌液與含砷的污染土壤中混合形成混合溶液，使得混合液pH呈現微弱堿環境至pH為8-9，將混合溶液置于濕潤環境下培養，鈣化作用耐砷細菌通過誘導固化作用將富含砷污染土壤中砷得到固定，使砷污染土壤得到原位修復。該方法操作簡便、易于控制，成本低，可廣泛用于重金屬土壤污染的修復。
文檔編號B09C1/10GK103121033SQ201310070138
公開日2013年5月29日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者潘響亮, 宋文娟, 張道勇, 高磊 申請人:中國科學院新疆生態與地理研究所