專利名稱：一株高效降解木質素的水稻內生菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及從水稻中分離獲得的一株具有高效降解木質素能力的水稻內生細菌。
背景技術：
資源利用以及環境問題是全球關注的兩大重要主題。木質纖維素材料，如糧食作物和經濟作物生產中的副產物農作物秸桿，是一種可供開發和綜合利用的寶貴資源。由于結構復雜，分子量大，不含易水解的單元，木質素是公認的最難以化學和生物降解的天然高聚物之一。木質纖維素材料中，木質素與纖維素以共價鍵形式緊密接合，將纖維素分子包埋于其中，形成堅固的天然屏障阻礙分解纖維素，而將纖維素材料降解成單糖是進一步發酵生產燃料乙醇的基礎。因此，木質素的降解是能否有效利用木質纖維素，降低生物能源生產成本的關鍵。造紙廢水是目前最主要的環境污染源之一，其主要成份是未降解的木質素類化合物及其衍生物，這些難以降解的物質對受納水體造成嚴重污染，破壞水體生態系統，直接威脅人類健康。簡而言之，木質素降解困難的技術瓶頸，制約了資源再利用，同時也帶來了環境污染問題。目前，降解木質素主要采用理化處理和生物降解。理化處理能源成本較高，且易造成二次污染。篩選并利用微生物降解木質素不僅可以緩解環境污染，生產生物能源，還可以通過控制性的解聚，變廢為寶，生成有利用價值的芳香族化合物，實現資源再利用。在微生物資源中，植物內生菌作為一類與植物互利共生的微生物，分布廣泛，生長環境獨特，作為植物木質素生物降解的新資源開發，具有很強的目的性和選擇性，但目前高效降解木質素的植物內生細菌的研究基本還是空白。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種高效降解木質素的水稻內生菌，該水稻內生菌具有強的木質素褪色率和降解率，并能有效降解水稻秸桿，在資源再利用及環境治理等方面具有很大的潛力。本發明提供的技術方案是一株高效降解木質素的水稻內生細菌，其是
sp. Sd-I，保藏號為CGMCC No. 6698，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明所述水稻內生細菌已于2012年10月22日為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，其保藏號為CGMCC. 6698，分類命名為泛菌sp.，經檢測存活。
本發明水稻內生細菌來源于水稻種子，結合菌落菌體形態特征和基于細菌16S rDNA基因序列的系統發育分析，鑒定為菌,命名為Sd_l。目前為止，國內外尚未有關于屬的菌株應用于木質素降解及水稻秸桿處理，本發明為木質素降解研究提供了一種新的微生物資源。
本發明水稻內生細菌Sd-I菌株的分離、純化和篩選過程為將秈稻(谷梅4號)種子表面消毒干凈后置于內生菌分離培養基TWYE上，27°C培養待內生菌長出再結合劃線分離法在相應的固體PDA平板上進行分離，直至獲得各種微生物的純培養。將分離得到的菌株純培養接種到以木質素為唯一碳源的固體平板篩選培養基上，放入生化培養箱中恒溫靜置培養，每天觀察，篩選生長效果最好的菌株，即為高效降解木質素的菌株，再劃線分離得到最終的純培養菌株。所述TWYE培養基組成為酵母提取物O. 25g, KH2PO4 O. 5g,瓊脂18g，去離子水定容至1L，調節PH值范圍7. 2±0. 2。PDA培養基組成為土豆200g，煮沸30min后過濾，濾液中加入IOg葡萄糖,瓊脂15g,去離子水定容至1L,自然PH。木質素為唯一碳源的培養基組成為堿木質素 3g, (NH4)2SO4 2g，K2HPO4 lg，MgSO4 O. 2g，CaCl2 0. lg，FeSO4 0. 05，MnSO40.02g，KH2PO4 lg,瓊脂15g，去離子水定容至1L，pH為7· 0 7· 4。本發明具有以下有益效果本發明彌補了常規微生物對木質素降解率低，降解時間過長等不足。本發明所述菌株Paflioea sp. Sd-I在30°C, 170r/min的條件下培養4天后,在補充了 1%葡萄糖和O. 5%蛋白胨的情況下，可以使含有3g/L木質素的液體培養基的褪色率達到52. 38%，木質素的降解率達到69. 06%。該菌株可以有效降解水稻秸桿中的木質素，本發明提供實例表明降解率可達到54. 51%。
圖I :本發明菌株的菌落形態圖；圖2 :本發明菌株的菌體在木質素液體培養基中的生長情況；圖3 :本發明菌株對木質素的褪色及降解情況；具體實施方式
下面通過具體實施方式
的詳細描述來進一步闡明本發明，但并不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。
實施例I :菌株的生物學鑒定1.菌株形態特征(1)菌落形態特征將單克隆菌落劃線接種至PDA固體培養基中，將平板倒置于恒溫培養箱，30°C培養I 3天，觀察其菌落形態，菌落呈淺黃色，表面光滑、邊緣圓滑，見附圖I。(2)菌體形態特征對菌株進行革蘭氏染色，利用光學顯微鏡觀測，顯示該菌株為短桿狀，革蘭氏陰性菌；2.菌株16SrDNA分析采用細菌基因組DNA提取試劑盒，抽提菌株基因組DNA，以菌株基因組DNA為模板，采用細菌16S rDNA通用引物(27F，1492R)，擴增菌株的16S rDNA片段，將得到的細菌16S rDNA 序列與NCBI中的核酸數據庫進行Blast同源性比對(www.ncbi.nlm.nih. gov/Blast), 與數據庫中已知細菌Aflioea屬的16S rDNA序列的相似性達到了 99%，將該菌株鑒定為 Pantoea 屬。3.菌株相關生理生化實驗分別對菌株純培養物進行甲基紅實驗、精氨酸水解實驗、脲酶實驗、糖酵解、V-P實驗等一系列相關生理生化實驗，得出該菌株可以利用蔗糖、乳糖產酸，但不產氣。氧化酶陰性，不產生H2S,不水解脲素及精氨酸，可還原硝酸鹽，具有纖維素降解、不能利用檸檬酸鹽等。通過對比與Pantoea屬的生理生化結果基本一致，詳細結果見表I。表I. Pantoea sp. Sd-I相關生理生化實驗結果
權利要求
1.一株高效降解木質素的水稻內生細菌，所述水稻內生細菌為sp. Sd-Ι，保藏號為 CGMCC No. 6698。
2.如權利要求I所述的水稻內生細菌用于降解木質素的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于將所述水稻內生細菌按I.4 X IO9CFU的接種量接種到含有3g/L堿木質素并補充1%葡萄糖與O. 5%蛋白胨作為起始碳、氮源的液體培養基中培養，使木質素褪色并降解。
4.如權利要求2所述的應用，其特征在于將所述水稻內生細菌按I.4 XlO9 CFU的接種量接種到含有10g/L水稻秸桿并補充1%葡萄糖與O. 5%蛋白胨作為起始碳、氮源的液體培養基中培養，使水稻秸桿降解。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述水稻秸桿是用1%NaOH處理過的。
全文摘要
本發明公開了一株用于高效降解木質素的水稻內生菌Pantoea sp.Sd-1，保藏號為CGMCC No.6698。本發明水稻內生菌是一株能夠在以堿木質素為唯一碳源的培養基上生長的菌株。該菌株在補充了1%葡萄糖和0.5%蛋白胨的含有3g/L堿木質素的液體培養基中，在培養4天后木質素褪色率與降解率分別達到52.38%和69.06%。在補充了1%葡萄糖和0.5%蛋白胨的含有10g/L水稻秸稈的液體培養基中，秸稈降解率最高可達54.51%。
文檔編號C02F3/34GK102978142SQ20121053851
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月13日 優先權日2012年12月13日
發明者朱詠華, 廖紅東, 熊現秋, 劉選明, 楊曉璐, 馬江山, 施小偉, 林建中 申請人:湖南大學