專利名稱：產酸克雷伯氏桿菌df-1及其去除水體中亞硝酸態氮的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于污水處理領域，尤其涉及一種產酸克雷伯氏桿菌DF-1及其去除水體中亞硝酸態氮的應用。
背景技術：
近海灘涂水產養殖對世界食物供給具有十分重要的貢獻，尤其對那些可利用土地少而人口眾多的國家，比如像中國。2006年中國江蘇的近海水產養殖面積就已經達到122，
000hm2。反硝化作用是氮的生物地球化學循環中重要的環節，然而近年來隨著規模化水產養殖的快速發展，投喂過剩的飼料和飼養的水生生物排泄物積累產生的亞硝態氮已成為危害水產養殖的主要毒性物質。亞硝態氮則會影響養殖水生生物的生理功能和免疫系統。目前已有報道關于氮污染造弓I起的的養殖水產動物病害甚至死亡。目前最常用的水污染處理方法主要有三種物理法，化學法和生物法。同前兩種方法相比，生物法具有處理徹底，無二次污染等優點。某些微生物可以將水體中的氮氧化物(NOf和NO3-)通過氣態中間產物(NO和N2O)轉化為氮氣，從而達到減輕水體中氮污染的目的[6’7]。目前已知的反硝化細菌多是從淡水環境中分離得來，能用于海水養殖中水處理且主要針對亞硝酸鹽還原能力的報道極少。從近海灘涂養殖池底質淤泥中分離篩選出一株反硝化能力高，且適用于淡水和咸水的好氧反硝化細菌，，以期為近海養殖亞硝酸鹽污染的生物修復提供技術依據。
發明內容
解決的技術問題本發明的目的是從近海灘涂養殖池底質淤泥中分離篩選出一株反硝化能力高，且適用于淡水和咸水的好氧反硝化細菌，及其去除水體中亞硝酸態氮的應用。技術方案
產酸克雷伯氏桿菌iKlebsiella該菌株已在國家知識產權局指定的保
藏單位保藏，保藏日期為2012年09月25日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 6623。所述產酸克雷伯氏桿菌DF-1在去除水體中亞硝酸態氮中的應用。所述產酸克雷伯氏桿菌DF-1在去除水體中亞硝酸態氮中的應用，步驟為以產酸克雷伯氏桿菌DF-1為作用菌株，經擴大培養，將菌液涂布到載體表面，浸入待處理水中，形成生物膜，進而去除水體中亞硝酸態氮。本發明所用反硝化細菌從近海灘涂養殖池底質淤泥中篩選，經16srRNA分析，屬于克雷伯氏桿菌0i7< /wi<977a),命名為產酸克雷伯氏桿菌DF-1 {Klebsiella oxytocaDF-1 )，該菌株的生理生化特征是(+表示生長，一表示抑制)
革蘭氏染色陰性，菌落呈圓形，邊緣整齊，乳脂色，半透明，凸起，表面光滑，半流質，直徑3 6 mm η葡萄糖發酵+，MR—，VP—，克氏檸檬酸鹽+,H2S +，吣3還原+。pH 3 —，5 +, 7 +, 9 +,11 +, 12 —。%。鹽度試驗0%。+，5%o +，10%。+，15%o —ο。〇溫度試驗15°C+,20°C +,25°C +,30°C +,35°C +,40°C +。有益效果 本發明利用從近海灘涂養殖池底質游泥中篩選的反硝化細菌Λ7ebsiella oxytocaDF-1去除水體中亞硝態氮，屬于生物法處理污水領域。此方法不僅具有生物法處理污水的優點，同時作為海洋微生物，開辟了海洋微生物資源研究和開發新途徑。該菌株遺傳穩定，繁殖快，去除作用強，資源保護，環境友好，對水體特別是養殖水體亞硝態氮的去除，具有廣闊的前景和意義。
圖1為反硝化細菌DF-1平板生長圖2不同pH條件下反硝化細菌DF-1生長及亞硝酸鹽氮降解曲線；
圖3不同溫度條件下反硝化細菌DF-1生長及亞硝酸鹽氮降解曲線；
圖4不同鹽度條件下反硝化細菌DF-1生長及亞硝酸鹽氮降解曲線。產酸克雷伯氏桿菌DF-1最適生長條件溫度35°C，pH 8_9，鹽度5%。，產酸克雷伯氏桿菌DF-1能充分利用蔗糖，葡萄糖，乙酸鈉，丁二酸鈉，酒石酸鉀鈉。在此條件下，亞硝化細菌oxytoca DF-1的亞硝態氮去除率超過90%。
具體實施例方式
實施例1:
以產酸克雷伯氏桿菌(ar_Fioca)DF-l為作用菌株,經母種制備,擴大培養,將菌液涂布到載體表面，浸入待處理水中，形成生物膜。具體操作步驟是
(O用液體SM培養基富集微生物，即將底質淤泥加入到已滅菌的液體SM培養基中培養。SM 液體培養基配方為0. 284%wt 丁二酸鈉，O. 0015%wt NaNO2,0. 136%wt KH2PO4,O. 027%wt (NH4)2SO4jO. l%wt 酵母提取物，0. 019%wt MgSO4 · 7H20，0· 368 %wt NaCl，pH 8.2。(2)用固體DM培養基初篩微生物，即用液體SM培養基中的菌液在固體DM培養基上劃線37攝氏度培養，固體DM培養基配方為O. 472%wt 丁二酸鈉，O. 0015%wt NaNO2,O. 15%wt KH2PO4,0. 042%wt Na2HPO4,0. 06%wt NH4CIjO. 5%wt 酪蛋白氨基酸，0. 368 %wtNaCl，pH 8. 2，2%wt 瓊脂。(3)用BTB培養基復篩反硝化細菌，即挑取DM固體培養基上菌落在BTB培養基上劃線，使BTB培養基有綠色變為藍色的微生物是反硝化細菌。BTB培養基配方為O. l%wtL-天冬酰胺，O. l%wt KNO3,0. l%wt KH2PO4,0. 005%wt FeCl2 · 6Η20，0· 02%wt CaCl2 · 2Η20,O. l%wt MgSO4 ·7Η20，O. 368%wt NaCl，lg/L BTB (溶劑為 l%wt 乙醇溶液)，ρΗ7· O, 2%wt 瓊月旨。
(4)用液體DM培養基篩選產酸克雷伯氏桿菌DF-1，即將使BTB培養基由綠變藍的菌株加入到液體DM培養基培養，計算不同菌株亞硝態氮去除率，選取去除率最大的菌株。(5)將篩選出的最適菌株進行序列分析及系統發育分析。用于16S rRNA PCR反應的引物為通用引物，PF :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，PR :5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR 反應體系(20uL) 2. OuL 10XPCR 緩沖液；0. 4uL dNTP ；1. OuL 引物 PF ；1. OuL 引物 PR ；2uL 模板；O. 2uLTaq 酶；13. 4uL 超純水。PCR 反應條件94°C預變性 5 min ；94°C,1 min ；57°C，1 min ；72°C，1 min ;進行30個循環；最后72°C延伸10 min。PCR產物經I %瓊脂糖凝膠電泳分析，通過片段大小確定是否為目的片段，然后將含有目的片段的PCR產物再經瓊脂糖凝膠電泳后用DNA膠回收試劑盒進行片斷回收，回收產物進行PCR產物測序，測序為雙向引物測序，測序引物為27F和1492R，將所測序列經BLAST程序與GenBank核酸數據庫進行比對分析，用Custal X1. 8軟件進行多重比較分析，再用MEGA5. O軟件中Neighbor-Jioning方法構建系統發育樹。(6)經過菌體形態、生理生化、16srRNA分析鑒定，確定所選菌株屬于克雷伯氏桿菌(Jlebsiella),兔筆為產酸克雷伯氏桿菌(Jlebsiella oxytoca)DF-1。以產酸克雷伯氏桿菌DF-1為作用菌株，經母種制備，擴大培養，將菌液涂布到載體表面，浸入待處理水中，形成生物膜。在生物膜形成和穩定過程，對亞硝態氮的去除作用會持續進行，處理實驗結果如下表所示。 表I不同碳源對反硝化細菌DF-1生長及反硝化性能的影響
權利要求
1.產酸克雷伯氏桿菌0i7e/wii 77a<or_Fioca)DF-l,該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年09月25日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 6623。
2.權利要求1所述產酸克雷伯氏桿菌DF-1在去除水體中亞硝酸態氮中的應用。
3.權利要求2所述產酸克雷伯氏桿菌DF-1在去除水體中亞硝酸態氮中的應用，其特征在于步驟為以產酸克雷伯氏桿菌DF-1為作用菌株，經擴大培養，將菌液涂布到載體表面， 浸入待處理水中，形成生物膜，進而去除水體中亞硝酸態氮。
全文摘要
產酸克雷伯氏桿菌DF-1及其去除水體中亞硝酸態氮的應用。該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年09月25日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.6623。本發明提供的產酸克雷伯氏桿菌DF-1遺傳穩定，繁殖快，亞硝酸態氮去除率高，可進行大規模培養，應用于污水的亞硝酸態氮去除。
文檔編號C02F3/02GK103013867SQ20121051224
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月4日 優先權日2012年12月4日
發明者隆小華, 劉元瑞, 臧旸, 劉兆普 申請人:南京農業大學