專利名稱：賴氨酸芽孢桿菌及其降解mc-lr的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)保水處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從太湖流域藍(lán)藻藻漿壓濾液中篩選的I株賴氨酸芽孢桿菌及利用其降解微囊藻毒素-LR (MC-LR)的方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工、農(nóng)業(yè)已呈現(xiàn)大規(guī)模機(jī)械化，作業(yè)過程中產(chǎn)生的 大量含氮磷廢水皆就近排入附近河流、湖泊等水體，帶來的富營養(yǎng)化問題已日趨嚴(yán)重，藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)。據(jù)研究報道，25%-70%的藍(lán)藻水華污染可產(chǎn)生微囊藻毒素(MCs)。MCs是一類環(huán)狀七肽肝毒素，具有90多種同分異構(gòu)體，其中微囊藻毒素-LR (MC-LR)和微囊藻毒素-RR(MC-RR)是我國藍(lán)藻水華水體中出現(xiàn)頻率及含量較高的兩種類型。MCs在水中的溶解度大于1.0 g/L，不易被沉積物、懸浮顆粒物吸附，幾乎全部以溶解性狀態(tài)分布于水體中，可在水生生物體內(nèi)富集，并通過食物鏈進(jìn)入人體，低劑量的MC-LR即可引發(fā)原發(fā)性肝癌、大腸癌、胰腺癌等疾病，嚴(yán)重危害人類健康，世界衛(wèi)生組織和我國的飲用水標(biāo)準(zhǔn)均規(guī)定了 MC-LR不超過1.0 U g/L的限值。MC-LR因具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在自然條件下降解過程非常緩慢，且具有熱穩(wěn)定性，煮沸30 min也不能破壞其毒性，常規(guī)水處理工藝對其去除率較低。目前，去除MC-LR的方法主要有化學(xué)法、物理法和生物法等，其中微生物降解法是公認(rèn)的最為安全有效的方法。據(jù)公開研究報道，能夠降解MC-LR的微生物種類稀少，種群結(jié)構(gòu)單一，僅局限于某些特殊菌株。如公開號為CN1785851的發(fā)明專利，從滇池底泥中篩選出I株降解MCs的食酸戴爾福特菌。《農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報》2009年第28卷第8期1669-1675頁報道了楊靜東等采用從太湖水華藍(lán)藻細(xì)胞中提取的MCs作為微生物生長的唯一碳源和氮源，從富營養(yǎng)化的太湖水體中篩選出降解MCs的微生物菌群。公開號為CN102154170的發(fā)明專利，是本發(fā)明人從太湖河浜底泥中篩選出I株降解MC-LR的球形芽孢桿菌。但目前已報道的MC-LR降解菌僅在特定條件下表現(xiàn)出高效性，常用外加碳源對其降解性能多具有抑制作用，菌劑制備碳源選擇受限，以致于MC-LR降解菌在實(shí)際工程中的應(yīng)用難以大規(guī)模實(shí)現(xiàn)。根據(jù)生物進(jìn)化論適者生存的原理，藍(lán)藻水華水體中可能存在與藍(lán)藻共生的細(xì)菌，本發(fā)明以取自常州雪堰鎮(zhèn)藻水分離站的太湖藍(lán)藻藻漿壓濾液作為MC-LR降解菌的來源，通過馴化、富集、分離純化，從中篩選出I株具有MC-LR降解能力的賴氨酸芽孢桿菌。本發(fā)明提供的這株賴氨酸芽孢桿菌對MC-LR的分解利用具有專一性，常用外加碳源能夠促進(jìn)其降解MC-LR，因此，這種與藍(lán)藻共生的細(xì)菌在天然水體中更易繁殖，且能成為優(yōu)勢菌種，在藍(lán)藻水華污染治理中的應(yīng)用前景更為廣闊。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，針對MC-LR難以有效去除的難題而提供的一種從藍(lán)藻藻漿壓濾液中篩選的對MC-LR分解利用具有專一性的賴氨酸芽孢桿菌，并利用其降解MC-LR的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供了 MC-LR降解菌R3，建議的分類命名為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌Uysinibacillus fusiformis、。已于2012年5月11日保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO. 6107。利用上述菌種降解MC-LR的方法，按照下述步驟進(jìn)行
將紡錘形賴氨酸芽孢桿菌iLysinibacillus fusiformis )單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中于溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速130 r/min條件下培養(yǎng)20 h至對數(shù)期，再按照體積分?jǐn)?shù)5%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)20 h至對數(shù)期，備用。
將上述對數(shù)期賴氨酸芽孢桿菌按照投菌量為2-10%(以體積分?jǐn)?shù)計)的比例接種到以MC-LR為唯一碳源、pH值為5. 0-9. 0的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C搖床轉(zhuǎn)速130 r/min下培養(yǎng)7 d即能夠有效地降解MC-LR。上述降解MC-LR的方法優(yōu)選以體積分?jǐn)?shù)計為4-6%的投菌量接種到以MC-LR為唯一碳源、pH值為7. 0的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C搖床轉(zhuǎn)速130 r/min下培養(yǎng)7 d。其中所述的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基組成如下蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g ；蒸餾水 1000 mL, pH 7. 2-7. 4。其中所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基組成如下K2HP04 1.6 g, KH2PO4 0.4 g，NH4Cl 0.5 g,MgSO4 7H20 0. 2 g, CaCl2 2H20 25 mg, FeCl3 6H20 2. 3 mg，適量 MC ;蒸餾水 1000 mL, pH
7.2-7. 4。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)
I、本發(fā)明選用價廉易得的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分離篩選、純化MC-LR降解菌，具有成本低、安全、聞效等優(yōu)點(diǎn)。2、本發(fā)明選擇太湖藍(lán)藻藻漿壓濾液作為MC-LR降解菌的菌種分離源，所篩選出的I株賴氨酸芽孢桿菌能與藍(lán)藻共生，能夠適應(yīng)自然環(huán)境，且該菌對MC-LR的分解利用具有專一性，外加碳源能夠較大程度地促進(jìn)其降解作用，對于利用微生物法去除長期遭受藍(lán)藻水華污染的大面積水體中的MC-LR具有較廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式菌株的篩選及鑒定
I、樣品米集
以取自常州市雪堰鎮(zhèn)藻水分離站的太湖藍(lán)藻藻漿壓濾液作為MC-LR降解菌的菌種分離源。篩選降解菌用到的MC-LR是在實(shí)驗(yàn)室條件下從太湖藍(lán)藻細(xì)胞中提取、提純的。2、培養(yǎng)基配制
營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稱取牛肉膏3 g，蛋白胨10 g及NaCl 5 g于燒杯中，加入蒸餾水1000mL，在電爐上加熱，并攪拌，使之快速溶解，調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2，然后分別取100 mL培養(yǎng)基于錐形瓶中，用紗布和牛皮紙將錐形瓶封好，放入高壓鍋中121°C滅菌20 min。固體培養(yǎng)基加入瓊脂2. 4%。無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基稱取K2HPO4I. 6g, KH2PO4 0.4 g, NH4Cl 0.5 g,MgSO4 *7H20 0.2g, CaCl2 2H20 25 mg, FeCl3 6H20 2. 3 mg, MC 49. 07 u g 于燒杯中，加入蒸餾水 1000 mL,調(diào)節(jié)pH至7. 2-7. 4，于高壓鍋中121°C滅菌20 min。3、篩選方法
將采集的水樣10 mL接入內(nèi)裝玻璃珠和90 mL無菌水且已滅菌的錐形瓶中，將該錐形瓶放入溫度30°C的搖床中，轉(zhuǎn)速130 r/min，搖勻，取10 mL接入50 mL以MC-LR作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行 馴化培養(yǎng)4 d，共4次，逐次增加MC-LR的濃度。然后進(jìn)行倍比稀釋將樣品稀釋到10_5、10_6、10_7，采用涂布法進(jìn)行分離，每個梯度做3個平行。根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色等挑選其中長勢較好的菌落，在以MC-LR為唯一碳源的固體培養(yǎng)基中劃線分離培養(yǎng)2-3 d，然后進(jìn)行純化培養(yǎng)，繼代5-6次，得到相對優(yōu)勢的MC-LR降解菌株。4、菌株形態(tài)及生理生化性能
通過對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、染色反應(yīng)和生理生化測定，并根據(jù)科學(xué)出版社《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(2001)對其進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)特征菌落為圓形、較大，呈淡黃色透明狀，邊緣平滑整齊，中間凸起，有粘性，油鏡下觀察，菌體為桿狀。生理生化特征革蘭氏染色陰性，接觸酶陽性，好氧，乙酰甲基醇(V. P)陰性，甲基紅(M. R)陰性，糖或醇類發(fā)酵無變化，淀粉水解、產(chǎn)硫化氫陰性，硝酸鹽還原陽性，葡萄糖氧化發(fā)酵產(chǎn)酸。5、菌株的16S rDNA序列同源性分析
通過將菌株的16S rDNA序列與美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank中的已知序列比對，該菌株與序列登錄號為JF742762的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌ZB2iLysinibadIlus相似度高達(dá)99. 9%,且在基于距離法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中兩
菌株處于同一分支，自展值為100，其中重復(fù)數(shù)設(shè)置為1000，可信度高。本發(fā)明提供了 MC-LR降解菌R3，建議的分類命名為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌Uysinibacillus fusiformis、。已于2012年5月11日保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO. 6107。根據(jù)16S rDNA序列同源性分析，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性，初步鑒定本發(fā)明所篩選出的MC-LR降解菌為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌Uysinibacillusfusiformis、。該菌在NCBI的GenBank中申請的序列登錄號為JQ991002。利用上述菌株降解MC-LR的具體實(shí)施例如下
實(shí)施例I
將對數(shù)期(20 h)賴氨酸芽孢桿菌按照體積分?jǐn)?shù)5%的投菌量接種至初始MC-LR濃度49. 07 u g/L, pH值分別為5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于搖床溫度30。。，轉(zhuǎn)速130 r/min條件下培養(yǎng)7 d，采用酶聯(lián)免疫法測MC-LR剩余濃度。7 d后，當(dāng)pH為5. 0時，MC-LR的去除率為33. 80% ;當(dāng)pH為6. 0時，MC-LR的去除率為40. 96%，當(dāng)pH為7. 0時，MC-LR的去除率為46. 47%,當(dāng)pH為8. 0時，MC-LR的去除率為41. 22%,當(dāng)pH為9. 0時，MC-LR的去除率為30. 13%。可見，酸性和堿性條件，都不利于該菌株生長，最適pH為7.0，這與一般MC降解菌都適于生存在中性稍偏堿環(huán)境相一致。據(jù)檢測，藍(lán)藻暴發(fā)時水體pH值為7. 0-8. 0，因此，該菌在實(shí)際工程應(yīng)用時滿足其PH條件，能夠充分發(fā)揮其降解作用。實(shí)施例2將對數(shù)期(20 h)賴氨酸芽孢桿菌分別按體積分?jǐn)?shù)2%、4%、6%、8%、10%的投菌量接種于pH值為7. 0，MC-LR初始濃度為49. 07 u g/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C搖床轉(zhuǎn)速130 r/min下培養(yǎng)，7 d后采用酶聯(lián)免疫法檢測MC-LR剩余濃度。當(dāng)接種量為2%時，MC-LR的去除率為13. 16% ;當(dāng)接種量為4%時，MC-LR的去除率達(dá)到46. 69% ;當(dāng)接種量為6%時，MC-LR的去除率為46. 07% ;當(dāng)接種量為8%時，MC-LR去除率為25. 98% ;當(dāng)接種量為10%時，MC-LR的去除率僅為5. 73%?？梢?，最佳投菌量為4-6%，接種量過多或過少都不利于MC-LR的去除，最佳投菌量是微生物充分利用MC-LR而將之去除的關(guān)鍵因素。實(shí)施例3
將對數(shù)期(20 h)賴氨酸芽孢桿菌按照體積分?jǐn)?shù)5%的投菌量接種至pH值皆為7. 0，初始MC-LR濃度分別為7. 73、24. 73、30. 92、92. 75、123. 66 u g/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C 搖床轉(zhuǎn)速130 r/min下培養(yǎng)，7 d后采用酶聯(lián)免疫法檢測MC-LR剩余濃度。當(dāng)MC-LR的初始濃度為7. 73 u g/L時，MC-LR去除率為21. 96% ;當(dāng)MC-LR的初始濃度為24. 73 u g/L時，MC-LR去除率為22. 04% ;當(dāng)MC-LR的初始濃度為30. 92 u g/L時，MC-LR去除率為41. 22% ；當(dāng)MC-LR的初始濃度為92. 75 u g/L時，MC-LR去除率為18. 84% ;當(dāng)MC-LR的初始濃度為123. 66 u g/L時，MC-LR去除率為12. 59%。可見，MC-LR初始濃度對MC-LR的去除有較大影響，MC-LR濃度過低或過高都不利于該賴氨酸芽孢桿菌利用MC-LR而將其去除。實(shí)施例4
將對數(shù)期(20 h)賴氨酸芽孢桿菌按照體積分?jǐn)?shù)5%的投菌量接種至pH值皆為7. 0，分別含無菌水、甲醇、乙醇、葡萄糖不同外加碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C搖床轉(zhuǎn)速130 r/min下培養(yǎng)，7 d后采用酶聯(lián)免疫法檢測MC-LR剩余濃度。MC-LR初始濃度為39. 26 u g/L,7 d后，當(dāng)MC-LR為唯一碳源時，MC-LR去除率為21. 52% ;當(dāng)甲醇為外加碳源時，MC-LR去除率為30. 26% ;當(dāng)乙醇為外加碳源時，MC-LR去除率為36. 90% ;當(dāng)葡萄糖為外加碳源時，MC-LR去除率為59. 26%。可見，這3種碳源對該賴氨酸芽孢桿菌去除MC-LR都有一定的促進(jìn)作用，其中葡萄糖的促進(jìn)作用最強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.紡錘形賴氨酸芽孢桿菌iLysinibacillusfusiformis),保藏編號為CGMCCNO. 6107。
2.利用權(quán)利要求I所述的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌菌種降解MC-LR的方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行 將紡錘形賴氨酸芽孢桿菌iLysinibacillus fusiformis )單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中于溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速130 r/min條件下培養(yǎng)20 h至對數(shù)期，再按照體積分?jǐn)?shù)5%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)20 h至對數(shù)期，備用； 將上述對數(shù)期賴氨酸芽孢桿菌按照投菌量以體積分?jǐn)?shù)計為2-10%的比例接種到以MC-LR為唯一碳源、pH值為5. 0-9. 0的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C搖床轉(zhuǎn)速130 r/min下培養(yǎng)7 d即能夠有效地降解MC-LR。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌iLysinibacillusZiz1Sifbrffii1S)菌種降解MC-LR的方法，其特征在于以體積分?jǐn)?shù)計為4-6%的投菌量接種到以MC-LR為唯一碳源的PH值為7. 0的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C搖床轉(zhuǎn)速130 r/min下培養(yǎng)7 d。
全文摘要
本發(fā)明賴氨酸芽孢桿菌及其降解MC-LR的方法，屬于環(huán)保水處理技術(shù)領(lǐng)域。提供了紡錘形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)，保藏編號為CGMCCNO.6107。本發(fā)明還提供了利用紡錘形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)菌種降解MC-LR的方法。賴氨酸芽孢桿菌能與藍(lán)藻共生，能夠適應(yīng)自然環(huán)境，且該菌對MC-LR的分解利用具有專一性，外加碳源能夠較大程度地促進(jìn)其降解作用，對于利用微生物法去除長期遭受藍(lán)藻水華污染的大面積水體中的MC-LR具有較廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C02F1/58GK102965298SQ20121027563
公開日2013年3月13日 申請日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者張文藝, 李秋艷, 李仁霞, 陳雪珍, 占明飛 申請人:常州大學(xué)