專利名稱：一株不動桿菌及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，具體涉及ー株不動桿菌及其構建方法和應用。
背景技術：
水體富營養化已成為困擾世界各國的普遍性環境問題。浮游藻類的大量繁殖導致水華的頻繁爆發，嚴重影響了人類的生活、生產和身體健康，造成了世界范圍內的生態災害，探索控制水華發生的有效途徑已迫在眉睫。目前治理水體富營養化主要是采用物理和化學方法，但這兩種方法不僅會消耗大量的財カ和物力，而且會在一定程度上破壞生態環境。溶藻菌作為水華和赤潮的防治生物，日益受到國內外環境工作者的廣泛關注。國外對溶藻菌的研究已有數十年的歷史，自Geitler報道ー種寄生在剛毛藻上的粘細菌以來， 陸續有溶藻菌的相關報道，研究重點也逐漸從単一溶藻菌的篩選及溶藻特性研究過渡到菌-一藻種群生態學及分子調控機理等方面。目前，國內對溶藻細菌的研究還處于初始階段，因此，尋找高效溶藻菌對溶藻菌的深入研究及應用具有重要意義。水華魚腥藻是導致水體富營養化的主要藻種之一，分布廣，能夠產生藻毒素，直接和間接危害人類，然截止目前，利用微生物方式控制水華魚腥藻的研究甚是罕見。為此，本發明通過分離純化高效溶藻菌株，探討該溶藻菌株對水華魚腥藻的生長效應和光合色素的影響，對于安全、經濟、高效的控制水體富營養化、治理水華具有重要的科學實踐價值。
發明內容
本發明的目的之ー是提供ー種不動桿菌；本發明的目的之ニ是提供ー種利用微生物去除水華魚腥藻(引起水華的常見藻類)的方法，以消除當前水華中水華魚腥藻的大量繁殖帶來的環境污染問題。本發明中的不動桿菌從農業部都市農業(南方)重點實驗室黃化的水華魚腥藻液中分離篩選并獲得，已于2012年6月6日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCjii :中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。保藏編號為CGMCC No. 6196。其分類命名為不動桿菌，拉丁名=Acinetobacter
sp. O為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案一株不動桿菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO :I 所示，命名為 Acinetobacter SSAL-8。上述不動桿菌的構建方法，包括以下步驟A、以黃化的水華魚腥藻液作為溶藻細菌的分離源，采用涂布平板法及分區劃線法多次純化分離得到25株溶藻細菌；B、將分離獲得的25株溶藻細菌分別置于IOOmL LB液體培養基中，在180r .min'37°C下培養24h ；C、將經過培養的25株溶藻細菌分別取800 u L滴加到水華魚腥藻固體平板上，通過溶藻斑的大小考察、比較各菌的溶藻效果，最終篩選出具有較高溶藻效應的菌株SSAL-8，經鑒定為芽孢桿菌，命名為Acinetobacter SSAL-8 ；D、將菌株Acinetobacter SSAL-8接入斜面培養基，于4°C擴大培養制成菌懸液；E、將菌懸液加入到滅菌的甘油中，甘油的最終濃度為25%,放入_80°C的冰箱保藏。上述的不動桿菌的構建方法，其中，所述的LB液體培養基的組分及含量為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ;蒸餾水 IOOOmL ；pH7. 0-7. 2。上述的不動桿菌的構建方法，其中，所述的斜面培養基的組分及含量為磷酸氫ニ鉀(K2HPO4), 0. 075g ;硫酸鎂(MgSO4 H2O), 0. 125g ;碳酸鈣(CaCO3), 0. IOOg ;檸檬酸鐵(1% 水溶液)，0. 5mL ;檸檬酸(I %水溶液)，0. 5mL ;鑰酸(I %水溶液)，5滴；氫氧化鈉(I %水溶液)，I. 5mL ;瓊脂粉，15g ;蒸懼水，IOOOmLo上述不動桿菌用于降解水華魚腥藻，其降解效果隨菌株濃度的増大而增加，當菌株的濃度為35%時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率達91%。
圖I為不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻細胞數的影響；圖2為不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻干重的影響；圖3為不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻色素吸收光譜的影響；圖4為不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻葉綠素a的影響。
具體實施例方式實施例I、不動桿菌Acinetobacter SSAL-8的分離、純化及其鑒定不動桿菌Acinetobacter SSAL-8的分離及純化以農業部都市農業(南方)重點實驗室黃化的水華魚腥藻液作為溶藻細菌的分離源，采用涂布平板法及分區劃線法多次純化分離，將分離獲得的25株細菌分別置于IOOmLLB液體培養基中，180r37°C下培養24h，然后分別取800 y L滴加到水華魚腥藻固體平板上，通過溶藻斑的大小考察、比較各菌的溶藻效果，最終篩選出具有較高溶藻效應的菌株SSAL-8。經鑒定為芽孢桿菌，命名為Acinetobacter SSAL-8。將其接入斜面培養基，于冰箱4°C保存；將擴大培養制成的菌懸液加入到滅菌的甘油中，甘油的最終濃度為25%，放入-80°C的冰箱保藏。所述的LB液體培養基的組分及含量為酵母提取物，5g;胰蛋白胨，10g;NaCl，IOg ;蒸餾水 IOOOmL ；pH7. 0-7. 2。所述的斜面培養基的組分及含量為磷酸氫ニ鉀(K2HPO4)，0.075g;硫酸鎂(MgSO4 -H2O),0. 125g ;碳酸鈣(CaC03),0. IOOg ;檸檬酸鐵(I%水溶液)，0. 5mL ;檸檬酸(1%水溶液),0. 5mL ;鑰酸(1%水溶液)，5滴；氫氧化鈉(1%水溶液)，I. 5mL ;瓊脂粉，15g ;蒸餾水，lOOOmL。不動桿菌Acinetobacter SSAL-8的生理生化鑒定該菌株為革蘭氏陰性不動桿菌，桿狀，芽孢近圓形，大多中央生菌落呈近白色。使用引物7f(5' -CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和 1540r(5' -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3/ )。經序列比對表明，該菌株為不動桿菌，將其命名為Acinetobacter SSAL-8。該不動桿菌Acinetobacter SSAL-8已于2012年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存號為CGMCC No. 6196。實施例2、不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻生長效應和光合色素的影響不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻生長效應的影響水華魚腥藻培養參照藻類生長抑制實驗的標準方法(國家環保部)，采用水生111號無氮培養液培養，pH為7. 5。培養溫度30±2°C，連續24h光照，光照強度3000±2001x，
靜置培養，每天定期搖動3次。在水華魚腥藻濃度為5 X IO4 I X IO5個/mL時，分別向IOOmL藻液中加入不動桿 菌Acinetobacter SSAL-8 (菌體濃度約為IO9個/mL)，處理濃度(v/v)梯度為5%U0%,15^^20^^25^^30%和35%,姆組樣設3個重復。制備與實驗組相同的一系列不同配比的培養液(LB培養液水生111號無氮培養液)，分別用于培養不動桿菌AcinetobacterSSAL-8和水華魚腥藻形成對照組。以細胞計數法測定藻體細胞數量、并測定水華魚腥藻干重。細胞計數方法從接種計時起，每隔24h取樣，用計數框進行細胞計數。用移液器取經過超聲波破碎儀打碎過的藻液0. ImL于計數框中，在低倍鏡下觀察，放大倍數40X 10，隨機取五個視野，數出所看到的細胞數，取其平均值。N= IOXaXSitVSft ;a-每個視野內細胞平均值；Si+-計數框面積；Sft-視野面積；N-每mL中細胞個數。水華魚腥藻干重測定方法取定量的藻液，離心得藻，加入稱量皿，在80°C烘至恒重。不同濃度的不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻的細胞數的影響的測定結果如圖I所示，結果表明水華魚腥藻細胞的去除效果與不動桿菌AcinetobacterSSAL-8濃度呈現出一定的相關性，即隨著不動桿菌Acinetobacter SSAL-8濃度的增長，對水華魚腥藻細胞的去除作用越強。當不動桿菌Acinetobacter SSAL-8菌體濃度為5 %、10%、15%、20%、25%、30%和35%時，培養24h對水華魚腥藻細胞的去除率分別為2%、5%、11%、15%、18%、21%和 24%，培養16811后分別變為5%、16%、25%、28%、29%、32%和34%，與對照相比，呈現顯著差異(P < 0. 05)。不同濃度的不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻的干重的影響的測定結果如圖2所示，結果表明純LB液體培養基的投入對水華魚腥藻干重亦會產生影響，當LB液體培養基濃度依次為5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%時，培養168h后的水華魚腥藻干重相應增加，分別為 15. 90、16. 40、16. 77、17. 74、18. 11、19. 38 和 22. 04mg/mL。通過排除LB液體培養基本身對水華魚腥藻生長的影響因素，可見，隨著菌體濃度從5%依次升至35 %，不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻干重的抑制率依次為4 %、15 %、25%、29%、35%、36%和 38%。不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻光合色素的影響以Bhandari and Sharma法連續掃描400 750nm波長范圍內色素吸收光譜,并對水華魚腥藻葉綠素a含量進行測定。葉綠素a的提取測定取水華魚腥藻藻液IOmL過0. 45 的混合纖維素膜，將帶藻細胞的膜冷凍過夜，取出后迅速用SmL熱こ醇于熱水浴中萃取2min，將萃取液超聲破碎5-20min后，于暗處靜置2_6h，離心(5000r/min，4°C ) 5min后取上清液3. 5mL置于比色皿中，于665nm和750nm處測吸光值，計算酸化前的光密度值(E665b=Abs665b-Abs750b),然后滴加200 ii L的lmol/L鹽酸酸化,5min后于波長665nm和750nm處再測吸光值，計算酸化后的光密度值(E665a = Abs665a-Abs75J。采用熱こ醇為萃取溶剤，A =11. 5，K = 2. 43，比色皿光程為Icm
27.9 X (L6656 - tM5a JXV不同濃度的不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻色素吸收光譜的影響的測定結果如圖3所示,結果表明不同濃度的不動桿菌Acinetobacter SSAL-8作用于水華魚腥藻時，其色素光譜吸收曲線變化差異較大。高濃度(> 25% )處理下光譜吸收曲線已非常不明顯，各處峰值模糊甚微，表明Acinetobacter SSAL-8已大大地抑制了藻體色素的種類和含量。中低濃度(5 25%)處理下，隨著菌體濃度的増加，各色素光譜吸收峰值均有降低，這與不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對藻體細胞數以及干重的影響相一致,譜圖 充分體現溶藻菌的濃度相關性。葉綠素a是光能的捕獲者，也是葉綠體膜內光傳導者，因此葉綠素a含量的多少，充分反映出藻體光合成能力的強弱。不同濃度的不動桿菌Acinetobacter SSAL-8對水華魚腥藻葉綠素a的影響的測定結果如圖4所示(A、B、C、D、E、F、G、H分別代表不動桿菌 Acinetobacter SSAL-8 濃度為 0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35% )，結果表明溶藻菌對葉綠素a的抑制作用隨著菌體濃度的增加而增強。菌體濃度為
20%、25%、30%和35%，對不動桿菌Acinetobacter SSAL-8而言，24h對葉綠素a的抑制率分別為 6%、12%、21%、29%、30%、41%和 43%，168h 后依次升至 61%,68%,82%,90%,87%、90%和 91%。
權利要求
1.一株不動桿菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示,命名為Acinetobacter SSAL-8。
2.如權利要求I所述的不動桿菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟 A、以黃化的水華魚腥藻液作為溶藻細菌的分離源，采用涂布平板法及分區劃線法多次純化分離得到25株溶藻細菌； B、將分離獲得的25株溶藻細菌分別置于IOOmLLB液體培養基中，在180r下培養24h ； C、將經過培養的25株溶藻細菌分別取800y L滴加到水華魚腥藻固體平板上，通過溶藻斑的大小考察、比較各菌的溶藻效果，最終篩選出具有較高溶藻效應的菌株SSAL-8，經鑒定為不動桿菌，命名為Acinetobacter SSAL-8 ; D、將菌株AcinetobacterSSAL-8接入斜面培養基，于4°C擴大培養制成菌懸液； E、將菌懸液加入到滅菌的甘油中，甘油的最終濃度為25%，放入_80°C的冰箱保藏。
3.如權利要求2所述的不動桿菌的構建方法，其特征在于所述的LB液體培養基的組分及含量為:酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ;蒸餾水IOOOmL ；pH7. 0-7. 2。
4.如權利要求2所述的不動桿菌的構建方法，其特征在干所述的斜面培養基的組分及含量為=K2HPO4,0. 075g ；MgS04 H20,0. 125g ；CaC03,0. IOOg ;檸檬酸鐵的 I %水溶液，0.5mL;檸檬酸的1%水溶液，0. 5mL;鑰酸的I %水溶液，5滴；氫氧化鈉的I %水溶液，1.5mL ;瓊脂粉，15g ;蒸懼水，IOOOmLo
5.如權利要求I所述的不動桿菌的應用，其特征在于所述的不動桿菌用于降解水華魚腥藻，其降解效果隨菌株濃度的増大而增加，當菌株的濃度為35%時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率達91 %。
全文摘要
本發明提供了一株不動桿菌及其構建方法和應用。其中的不動桿菌從黃化的水華魚腥藻液中分離篩選并獲得，該不動桿菌的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，命名為Acinetobacter SSAL-8。該不動桿菌可用于降解水華魚腥藻，其降解效果隨菌株濃度的增大而增加，當菌株的濃度為35％時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率達91％。
文檔編號C02F3/34GK102851236SQ20121027176
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月1日 優先權日2012年8月1日
發明者沈健英, 孫秀敏 申請人:上海交通大學