專利名稱：一種短小芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及ー種短小芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
石油污染土壌的微生物修復技術，近十幾年來在國外得到了較大發展，但是石油烴類污染物降解速度緩慢，致使治理過程延續時間較長，一直是這項技術的ー個突出難點，因此尋找高效石油降解菌是當前石油污染土壌微生物修復技術的研究熱點。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供ー種可用于降解 石油污染物的短小芽孢桿菌。該菌株是以原油為唯一碳源篩選出來的優勢菌株，菌株在生長繁殖過程中可改變原油的性質，使原油的組分發生變化，起到乳化、潤濕和分散原油的作用。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是ー種短小芽孢桿菌，其特征在于，所述短小芽孢桿菌為Bacillus pumilus 4070，保藏編號CGMCC No. 6073，保藏日為2012年5月3日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。I、該菌株具有如下的性質形態特征菌落扁平較大，白色，表面微皺，直徑3mm 4mm，菌體呈直或微彎的桿菌。生理生化特征革蘭氏陽性細菌。2、該菌株的篩選方法為步驟一、富集將從西安市未央區長安大學渭水校區陜西省地下水與生態環境エ程研究中心試驗場土壌石油污染10000mg/kg修復區IOcm左右紅三葉草根際修復區采集的土樣以無菌方式稱取10. Og,接入100. OmL石油/無機鹽液體培養基中，置于28土1°C、130r/min恒溫搖床富集培養7d ;然后吸取5mL培養液重新轉接入新鮮的石油/無機鹽液體培養基中，再進行3次富集、馴化，每次7d ;所述石油/無機鹽液體培養基的組成為NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%,CaCl2O. 0002%,蒸餾水lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)0. 5%，以上均為質量百分比，培養基 pH 值 7. 0 7. 5，105KPa 滅菌 20min 25min ；步驟ニ、篩選和純化將步驟一中富集培養后的富集培養液按十倍稀釋法稀釋，取10_4、10_5、10_63個稀釋度的培養液各0. ImL涂布于石油/無機鹽固體平板培養基上，置于37土 TC恒溫培養箱內培養48h，選取不同顔色及形態的優勢單菌落，在石油/無機鹽固體平板培養基上進行多次劃線分離，以純化得到形態一致的純化菌株，將純化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體培養基上進行進一步篩選、活化，得到菌株，待用；所述石油/無機鹽固體平板培養基的組成為=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%,KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，瓊脂 2%，蒸餾水 lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)0. 5%，以上均為質量百分比，培養基pH值7. 0 7. 5，105KPa滅菌20min 25min ；步驟三、復篩將步驟ニ中活化好的菌株分別接種于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%環己烷的無機鹽液體培養基中，28土 1°C、130r/min搖床培養，當培養液明顯渾濁后，取ImL培養液接種到含lwt%正十二烷和lwt%環己烷的無機鹽固體培養基中培養，然后再將培養的菌株接種于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%環己烷的無機鹽液體培養基中培養，如此重復3次，保存最終仍能使含有正十二烷和環己烷的無機鹽液體培養基變渾濁的菌株。3、該菌株的鑒定方法為步驟一、提取總DNA 101、取過夜培養菌株(至多2X109個)，10000r/min離心Imin收集菌體，加入180 u L 溶菌溶液(20mg/mL 溶菌酶，20mMTris_HCl pH8，2. 5mMEDTA, l%TritonX-100),重懸菌液，37°C水浴30min 60min ;然后向重懸菌液中添加20 y L蛋白酶K溶液(10mg/mL)， 充分振蕩混勻，56°C水浴30min至細胞完全裂解，接著加入200 u L溶液BD，充分振蕩混勻，70°C水浴lOmin，再加入200 u L無水こ醇，充分振蕩混勻；102、將吸附柱放入收集管中，用移液器將101中振蕩混勻后的菌液全部加入吸附柱中，靜置2min, 12000r/min離心3min,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L溶液PW,10000r/min離心Imin,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L漂洗溶液Wash buffer, IOOOOr/min離心lmin，倒掉濾液；將吸附柱放入收集管中，于12000r/min離心2min，除去殘留的漂洗液 Wash buffer ；103、取出吸附柱，放入一個新的I. 5mL的離心管，加入50ii L預熱(60°C)的洗脫液Elution buffer,靜置3min, 10000r/min室溫離心lmin,收集DNA溶液；采用濃度為2%瓊脂糖對提取的總DNA進行檢測，片段大小在13kb左右；步驟ニ、16SrDNA的PCR擴增以步驟一中提取的總DNA為模板進行PCR擴±曾，PCR反應體系DNA模板lOpmol，上游引物(IOiiM)IiU,下游引物(IOiiM)IiU ；dNTP (IOMm) I U I ; 10 X Taq reaction Buffer5 U I ；Taq (5U/ U I) 0. 25 U I ;加水至 50 U I ;PCR 反應條件預變性 98°C 5min ;循環 95°C 35s，55°C 35s，72°C 30s，35 個循環，最后 72 V延伸8min，4°C保存；所述PCR擴增的引物序列為上游引物(SEQID NO. I) :5，-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ ；下游引物(SEQID NO. 2) :5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ ；步驟三、菌株16SrDNA序列分析及比對對步驟ニ中PCR擴增的產物(片段大小I. 4kb左右)進行測序(由生エ生物工程(上海)有限公司協助完成)，得到的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO. 3)與GenBank中已發表的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的16SrDNA序列進行同源性比較，相似度達100%。 綜合生理生化鑒定、16SrDNA序列分析鑒定結果，鑒定本發明的菌株為短小芽孢桿菌。本發明還提供了上述短小芽孢桿菌在降解石油污染物中的應用。本發明與現有技術相比具有以下優點I、本發明的短小芽孢桿菌源于土壤，因此該菌株進入土壤后很快成為優勢菌群，占據一定生態位，有效促進石油烴類的降解，優化土壌微生物體系，改善土壌的物理性狀，增強土壤的生物活性，修復板結退化的土壤。2、本發明的短小芽孢桿菌是以原油為唯一碳源篩選出來的優勢菌株，菌株在生長繁殖過程中可改變原油的性質，使原油的組分發生變化，起到乳化、潤濕和分散原油的作用。3、本發明的短小芽孢桿菌可在短時間內降解土壌中的石油污染物。下面通過實施例，對本發明的技術方案做進ー步的詳細描述。
具體實施方式
菌株的篩選步驟一、富集將從西安市未央區長安大學渭水校區陜西省地下水與生態環境エ程研究中心試驗場土壌石油污染10000mg/kg修復區IOcm左右紅三葉草根際修復區采集的土樣以無菌方式稱取10. Og,接入100. OmL石油/無機鹽液體培養基中，置于28土1°C、130r/min恒溫搖床富集培養7d ;然后吸取5mL培養液重新轉接入新鮮的石油/無機鹽液體培養基中，再進行3次富集、馴化，每次7d ;所述石油/無機鹽液體培養基的組成為NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%,CaCl2O. 0002%,蒸餾水lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)0. 5%，以上均為質量百分比，培養基 pH 值 7. 0 7. 5，105KPa 滅菌 20min 25min ；步驟ニ、篩選和純化將步驟一中富集培養后的富集培養液按十倍稀釋法稀釋，取10_4、10_5、10_63個稀釋度的培養液各0. ImL涂布于石油/無機鹽固體平板培養基上，置于37土 TC恒溫培養箱內培養48h，選取不同顔色及形態的優勢單菌落，在石油/無機鹽固體平板培養基上進行多次劃線分離，以純化得到形態一致的純化菌株，將純化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體培養基上進行進一步篩選、活化，得到菌株，待用；所述石油/無機鹽固體平板培養基的組成為=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%,KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，瓊脂 2%，蒸餾水 lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)0. 5%，以上均為質量百分比，培養基pH值7. 0 7. 5，105KPa滅菌20min 25min ；步驟三、復篩將步驟ニ中活化好的菌株分別接種于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%環己烷的無機鹽液體培養基中，28± I、130r/min搖床培養，當培養液明顯渾濁后，取ImL培養液接種到含lwt%正十二烷和和lwt%環己烷的無機鹽固體培養基中培養，然后再將培養的菌株接種于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%環己烷的無機鹽液體培養基中培養，如此重復3次，保存最終仍能使含有正十二烷和環己烷的無機鹽液體培養基變渾濁的菌株。菌株的鑒定步驟一、提取總DNA 101、取過夜培養菌株(至多2X109個)，10000r/min離心Imin收集菌體，加入180 u L 溶菌溶液(20mg/mL 溶菌酶，20mMTris_HCl pH8，2. 5mMEDTA, l%TritonX-100),重懸菌液，37°C水浴30min 60min ;然后向重懸菌液中添加20 y L蛋白酶K溶液(10mg/mL)，充分振蕩混勻，56°C水浴30min至細胞完全裂解，接著加入200 u L溶液BD，充分振蕩混勻，70°C水浴lOmin，再加入200 u L無水こ醇，充分振蕩混勻；102、將吸附柱放入收集管中，用移液器將101中振蕩混勻后的菌液全部加入吸附柱中，靜置2min, 12000r/min離心3min,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 y L溶液PW,10000r/min離心lmin,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L漂洗溶液Wash buffer, IOOOOr/min離心lmin，倒掉濾液；將吸附柱放入收集管中，于12000r/min離心2min，離去殘留的漂洗液 Wash buffer ；103、取出吸附柱，放入一個新的1.5mL的離心管，加入50iiL預熱(60°C)的洗脫液Elution buffer,靜置3min, 10000r/min室溫離心lmin,收集DNA溶液；采用濃度為2%瓊脂糖對提取的總DNA進行檢測，片段大小在13kb左右；步驟ニ、16SrDNA的PCR擴增以步驟一中提取的總DNA為模板進行PCR擴±曾，PCR反應體系DNA模板lOpmol，上游引物(IOiiM)IiU,下游引物(IOiiM)IiU ；dNTP (IOMm) I U I ； 10 X Taq reaction Buffer5 U I ；Taq (5U/ U I) 0. 25 U I ;加水至 50 U I ；PCR 反應條件預變性 98°C 5min ;循環 95°C 35s，55°C 35s，72°C 30s, 35 個循環，最后 72 V 延伸8min，4°C保存；所述PCR擴增的引物序列為上游引物(SEQID NO. I) :5，-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ ；下游引物(SEQID NO. 2) :5，-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，；步驟三、菌株16SrDNA序列分析及比對對步驟ニ中PCR擴增的產物(片段大小
I.4kb左右)進行測序(由生エ生物工程(上海)有限公司協助完成)，得到的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO. 3)與GenBank中已發表的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的16SrDNA序列進行同源性比較，相似度達100%。 綜合生理生化鑒定、16SrDNA序列分析鑒定結果，鑒定本發明的菌株為短小芽孢桿菌,并命名為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus4070，保藏編號CGMCC No. 6073。本發明的短小芽孢桿菌的應用效果試驗I、短小芽孢桿菌對原油的降解能力試驗將本發明的短小芽孢桿菌接種于含有原油的無機鹽液體培養基中，于28± I °C，130rpm 發酵培養 7 天，培養基組成=NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，原油 1%，蒸餾水 IOOOmL,以上均為質量百分比，PH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;與未接種短小芽孢桿菌的培養基相比，發酵液的顔色明顯加深，而且，接種短小芽孢桿菌的發酵液中的原油具有不掛瓶的特點。這說明，本發明的短小芽孢桿菌以原油為唯一碳源生長，改變了原油的性質，使原油的組分發生了變化。將接種短小芽孢桿菌發酵后的原油在顯微鏡下觀察，發現原油中有菌液存在，細菌存在在油水界面上，并以油為碳源，適應環境產生趨油物質，從而起到乳化、潤濕和分散原油的作用。2、短小芽孢桿菌對培養基中石油的降解試驗將本發明的短小芽孢桿菌接種于含有原油的無機鹽液體培養基中，于28土TC，130rpm發酵培養7天，含有原油的無機鹽液體培養基組成=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，原油 1%，蒸餾水IOOOmL,以上均為質量百分比，pH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;然后分別取IOmL發酵液接種于IOOmL新鮮的含有原油的無機鹽液體培養基(培養基組成同上)、含有正十二烷的無機鹽液體培養基和含有環己烷的無機鹽液體培養基中，于28土 TC，130rpm發酵培養7天，含有正十二烷的無機鹽液體培養基組成=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%,正十二烷 1%，蒸餾水IOOOmL,以上均為質量百分比，pH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;含有環己烷的無機鹽液體培養基組成=NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g,FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%,環己烷1%,蒸餾水IOOOmL,以上均為質量百分比，pH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;以未接種的三種液體培養基為空白對照，于28土 1°C，130rpm發酵培養7天進行取樣，分別檢測接種短小芽孢桿菌的發酵液和空白対照的總石油烴(TPH)降解率、直鏈烷烴降解率和環烷烴降解率，結果見表I。表I菌株的石油降解率及其功能
TPH降解率直鏈烷烴降解率~ 環烷烴降解率
4070 菌株 37.4%41.6%26.9%
空白對照 9.8%13.8%11. 1%從表I中可以看出，在本發明的短小芽孢桿菌存在下總石油烴的降解率比空白對照提高27. 6%，直鏈烷烴和環烷烴的降解率均有較大幅度提高，說明本發明的短小芽孢桿菌能夠有效降解直鏈烷烴和環烷烴。3、短小芽孢桿菌對土壤中石油的降解情況將本發明的短小芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中37土TC活化36h，將活化后的菌種按照5% (質量百分比)比例添加到不同的污染度土壌中，土壌中均添加5%的麩皮，土壤中的C N P的比例為100 5 I，N、P源分別為NH4NO3和K2HPO4，土壤中石油的污染度分別為0. 3%、0. 7%和I. 5%，保持土壤含水率為20% 25%，以未添加菌種的土壤為空白対照。經過21天的降解，TPH (總石油烴)的降解率結果如表2所示。表2 土壤石油污染菌株的石油降解率
石油污染度 0. 3%|_ 0. 7%I. 5%
4070 菌株 43.5%39. 5%37.4%
空白對照15.6%12.2%10. 7%通過短小芽孢桿菌的降解，3種石油污染度條件下土壤中的TPH均有明顯的降低，分別較空白提高了 27. 9%,27. 3%和26. 7%，可以看出短小芽孢桿菌在土壤中短期能夠達到較好的降解效果。綜上所述，本發明的短小芽孢桿菌源于土壤，因此該菌株進入土壤后很快成為優勢菌群，占據一定生態位，可在短時間內降解土壌中的石油污染物，有效促進石油烴類的降解，優化土壌微生物體系，改善土壌的物理性狀。以上所述，僅是本發明的較佳實施例，并非對本發明做任何限制，凡是根據發明技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結構變化，均仍屬于本發明技術方案的保護范圍內。
權利要求
1.一種短小芽孢桿菌，其特征在于，所述短小芽孢桿菌為Bacillus pumilus4070，保藏編號 CGMCC No. 6073 ο
2.一種如權利要求I所述短小芽孢桿菌在降解石油污染物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種短小芽孢桿菌Bacillus pumilus 4070，保藏編號CGMCC No.6073。另外，本發明還公開了該短小芽孢桿菌在降解石油污染物中的應用。本發明的短小芽孢桿菌源于土壤，因此該菌株進入土壤后很快成為優勢菌群，占據一定生態位，有效促進石油烴類的降解，優化土壤微生物體系，改善土壤的物理性狀，增強土壤的生物活性，修復板結退化的土壤。該短小芽孢桿菌是以原油為唯一碳源篩選出來的優勢菌株，菌株在生長繁殖過程中可改變原油的性質，使原油的組分發生變化，起到乳化、潤濕和分散原油的作用，可在短時間內降解土壤中的石油污染物。
文檔編號B09C1/10GK102757920SQ201210264208
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月27日 優先權日2012年7月27日
發明者李春榮, 王周峰, 王文科, 申圓圓 申請人:長安大學