專利名稱：對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌及其提取方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于皮氏羅爾斯通氏菌菌株領域，特別涉及一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌及其提取方法及應用。
背景技術：
苯酚是造紙、煉油、制藥、焦化等工業過程中產生的一種有機污染物，會對動、植物產生有毒甚至致命的作用。大量酚類物質及其衍生物在土壤和水體中的排放和積累導致了生態環境的日趨惡化，許多國家已將其列入環境優先控制污染物的黑名單中。近年來，隨著生物新技術的發展，利用微生物降解法處理高濃度含酚廢水是一種經濟高效且不會產生二次污染的方法，相關方面的研究越來越受到人們的關注。但含酚工業廢水中往往含有較高濃度的重金屬離子，而高濃度重金屬離子的存在會抑制微生物對苯酚的生物降解。因此，獲得有一定耐受重金屬能力的苯酚降解菌在含酚工業廢水的生物處理中將具有突出的應用潛力。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌及其提取方法及應用，該菌株對Cd2+的耐受性高達lmm0l/L(liaiig/L)，對1000mg/L以下苯酚降解率可達75%以上，營養要求不高，在生物治理含酚工業廢水和重金屬雙重污染中具有重要應用潛力；獲得方法簡便快捷，成本低，對環境友好。本發明的一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌，其特征在于該菌株對鎘具有高抗性并且具有降解苯酚能力；其16S rDNA序列見序列表SEQ. ID. NOl。本發明的一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌的提取方法，包括(1)通過Cd2+在0. IXPTYG培養液中梯度壓力式馴化法馴化，多次平板涂布法分離直至得到耐受性較高的單菌落DX-T3-01。在不同Cd2+濃度的0. 1 XPTYG培養液中觀察其生長狀況；并通過0. IXPTYG固體培養基檢測篩選菌株對重金屬鎘的最低抑制濃度；(2)對0. 4mM/L Cd2+濃度培養24h后菌體進行SEM_EDX、FI1R分析，結果驗證了菌體表面對Cd2+的吸附作用。所述步驟(1)中的0. IXPTYG培養基成分為每升培養基包含0. 25g蛋白胨， 0. 25g 胰蛋白胨，0. 5g 酵母浸膏，0. 5g 葡萄糖，30mg MgSO4 · 7Η20，3· 5mg CaCl2 · 2Η20，0· 3g 放線菌酮，蒸餾水定容至1L，1 X IO5Pa滅菌30min，pH = 7。所述步驟(1)中的梯度壓力式馴化法為在0. IXPTYG培養基中，分別依次加入 Cd2+使其濃度為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mM/L，改變濃度的間隔時間為5_7d，于30°C， 150r/min條件下進行馴化培養。所述步驟(1)中的不同Cd2+濃度為 0、l、2、3、4、5、6、8、10mM/L，0. IXPTYG 固體培養基為0. 1 XPTYG液體培養基基礎上加入質量分數1. 5%的瓊脂，1 X IO5Pa滅菌30min，篩選菌株對重金屬鎘的最低抑制濃度為4mM/L。
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本發明的一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌的應用，包括將皮氏羅爾斯通氏菌置于無機鹽培養基中，無機鹽培養基中均含有苯酚和Cd2+的樣品中，在30°C、150r/min的條件下進行培養，培養時間為100h，即能降解苯酚。所述步驟無機鹽培養基為KH2PO4 l.Og, (NH4)2SO4 1. 0g, NaCl 1. 0g，CaCl2 · 2H20 0. lg，MgSO4 · 7H20 0. 2g，蒸餾水定容至 1L，1 X IO5Pa 滅菌 30min, pH 值為 7。菌株16S rDNA的基因全序列在NCBI數據庫中分析比較，鑒定為皮氏羅爾斯通氏菌，系統進化樹見圖3，同源性達到99%以上，命名為fcilstonia pickettii DX-T3-01。本發明所提供的皮氏羅爾斯通氏菌Ralstonia pickettii DX-T3-01已于2012年 1月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia 北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC No. 57 。所述的皮氏羅爾斯通氏菌feilstonia pickettii DX-T3-01，革蘭氏染色為陰性， 專性需氧，營養要求不高；該菌為短桿菌，菌體大小為(0. 5 0. 8) μ mX (1. 2 2. 0) μ m， 其電鏡掃描見圖4 ；菌落直徑大小為Imm 2mm，不透明，米白色，拱頂球狀，表面光滑濕潤， 邊緣整齊，較粘稠，易挑起，專性需氧，營養要求不高，革蘭氏染色為陰性；最適生長條件PH 為6. 0 7. 0，溫度為30 :35°C，搖床震蕩速率為150r/min。該皮氏羅爾斯通氏菌(feilstonia pickettii)DX-T3-01質粒檢測結果表明該菌不攜帶質粒，因此降解基因編碼于染色體上，這一特性使得在利用質粒進行水平基因轉移的過程中，避免了質粒的不相容性，是構建具備多種降解能力的基因工程菌的良好材料。本發明的皮氏羅爾斯通菌(feilstonia pickettii)DX-T3_01不僅可以利用苯酚作為唯一的碳、氮源進行新陳代謝，而且能在相對較高濃度的苯酚基質條件下(苯酚濃度約為1000mg/L)良好生長；它對苯酚的去除主要通過生物吸附和生物降解兩個階段，從而對苯酚達到很高的去除率，對500mg/L及以下的苯酚在60h內降解率為100%，見圖5 ；在苯酚和重金屬鎘復合污染的環境中該菌株IOOh內對1000mg/L以下苯酚降解率達75%以上，同時可耐受lmM/L(liaiig/L)的Cd2+，見圖6。另外適量的外加碳源不但不會影響本發明的菌株對苯酚降解作用，而且對其降解具有促進作用。有益效果(1)本發明從土壤中提取抗重金屬苯酚降解菌株，提取到的菌株對重金屬鎘的耐受性在液體培養基中最高可達18mM/L，在固體培養基上最高可達16mM/L，顯示了很強的抗鎘特性。菌種來源易得且分離純化方法簡便快捷，成本低，對環境友好；同時是一種很好的構建耐重金屬鎘基因工程菌資源；(2)提取的皮氏羅爾斯通氏菌(fcilstonia pickettii)DX-T3-01可以高效降解苯酚同時具有抗鎘特性，對500mg/L及以下的苯酚在60h內降解率為100%，在重金屬鎘濃度為lmmol/L條件下IOOh內對1000mg/L以下苯酚降解率可達75% ；這對菌株在含重金屬污染的含酚工業廢水的處理應用中的作用十分重要，在生物治理含酚工業廢水和重金屬雙重污染中具有重要應用潛力。
圖 1 為 0. 4mM/L Cd2+ 濃度培養 24h 后 SEM-EDX 圖；圖2 為 0. 4mM/L Cd2+ 濃度培養 24h 后 FTIR 圖；CN 102533616 A圖 3 為 Ralstoniapickettii strain DX-T3-01 的遺傳發育樹；圖 4 為 Ralstoniapickettii strain DX-T3-01 的掃描電鏡圖；圖5為Ralstoniapickettii strain DX-T3-01對不同初始濃度苯酚降解率圖。圖 6 為 Cd2+對菌株Ralstonia pickettii strain DX-T3-01 生長和苯酚降解的影響。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1控制投加高抗鎘菌于重金屬Cd2+濃度4mM/L的0. 1 XPTYG培養液中，0. IXPTYG 培養液為蛋白胨0. 25g，胰蛋白胨0. 25g，酵母粉0. 5g，葡萄糖0. 5g，MgSO4 · 7H20 30mg, CaCl2 ·2Η20 3. 5mg，放線菌酮 0. 3g，蒸餾水定容至 1L，1 X IO5Pa 滅菌 30min，pH 約 7。12h 培養后菌體生長良好。接菌體涂布于含Cd2+的0. IXPTYG固體平板中，0. IXPTYG固體平板為對應培養液加入1. 5%的瓊脂。5d內篩選菌株能在16mM/L的0. IXPTYG固體平板中良好生長。實施例2控制投加高抗鎘菌于濃度為300、400、500、600、700、800mg/L的苯酚無機鹽培養基中，觀察其降解率。其中無機鹽培養基為KH2PO4 l.Og, (NH4)2SO4 1. 0g, NaCl l.Og, CaCl2 · 2H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. 2g,蒸餾水定容至 1L, 1 X IO5Pa 滅菌 30min, pH 值約為 7。 48h測試結果表明濃度為300、400、500mg/L時，苯酚能夠在60h幾乎完全降解。實施例3分別挑取經分離純化后的單一菌落于各自的無機鹽培養基中，各無機鹽培養基中均含有700mg/L的苯酚和lmmol/LCd2+，在30°C、150r/min、250mL錐形瓶中裝填量IOOmL 的條件下進行培養，培養時間為100h，培養后通過電子顯微鏡觀察細菌生長情況以及測定溶液中苯酚的剩余濃度，從而確定出具有抗鎘特性的苯酚高效降解菌株。本發明所提供的一種具有抗鎘特性的苯酚高效降解菌在初始PH值為6. 5 7. 0，溫度為30°C，振蕩速率為 150r/min，250mL錐形瓶的裝液量為IOOmL的條件下，菌株接種量為1%，苯酚初始濃度為 700mg/L，重金屬Cd2+為lmmol/L培養時間100h，然后利用4-氨基安替比林法對苯酚濃度進行測定，測定波長為510nm ；苯酚的降解率高達100%。
權利要求
1.一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌，其特征在于該菌株對鎘具有高抗性并且具有降解苯酚能力；其16S rDNA序列見序列表SEQ. ID. N01，保藏號為CGMCC No. 57沈。
2.一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌的提取方法，包括(1)通過Cd2+在0.IXPTYG培養液中梯度壓力式馴化法馴化，多次平板涂布法分離直至得到耐受性較高的單菌落DX-T3-01。在不同Cd2+濃度的0. IXPTYG培養液中觀察其生長狀況；并通過0. IXPTYG固體培養基檢測篩選菌株對重金屬鎘的最低抑制濃度；(2)對0.4mM/L Cd2+濃度培養24h后菌體進行SEM_EDX、FI1R分析，結果驗證了菌體表面對Cd2+的吸附作用。
3.根據權利要求2所述的一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌的提取方法，其特征在于所述步驟(1)中的0. IXPTYG培養基成分為每升培養基包含0. 25g蛋白胨，0. 25g 胰蛋白胨，0. 5g 酵母浸膏，0. 5g 葡萄糖，30mg MgSO4 · 7H20, 3. 5mg CaCl2 · 2H20,0. 3g 放線菌酮，蒸餾水定容至1L, 1 X IO5Pa滅菌30min, pH = 7。
4.根據權利要求2所述的一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌的提取方法，其特征在于所述步驟(1)中的梯度壓力式馴化法為在0. IXPTYG培養基中，分別依次加入 Cd2+使其濃度為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mM/L，改變濃度的間隔時間為5_7d，于30°C， 150r/min條件下進行馴化培養。
5.根據權利要求4所述的一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌的提取方法，其特征在于所述步驟(1)中的不同Cd2+濃度為0、l、2、3、4、5、6、8、10mM/L，0. IXPTYG固體培養基為0. 1 XPTYG液體培養基基礎上加入質量分數1. 5 %的瓊脂，1 X IO5Pa滅菌30min，篩選菌株對重金屬鎘的最低抑制濃度為4mM/L。
6.一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌的應用，包括將皮氏羅爾斯通氏菌置于無機鹽培養基中，無機鹽培養基中均含有苯酚和Cd2+的樣品中，在30°C、150r/min的條件下進行培養，培養時間為100h，即能降解苯酚。
7.根據權利要求6的一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌的應用，其特征在于 所述步驟無機鹽培養基為 KH2PO4 l.Og, (NH4)2SO4 1. 0g, NaCl 1. 0g，CaCl2 · 2H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. 2g，蒸餾水定容至 1L，1 X IO5Pa 滅菌 30min, pH 值為 7。
全文摘要
本發明涉及一種對鎘具有高抗性的皮氏羅爾斯通氏菌及其提取方法及應用，該菌株對鎘具有高抗性并且具有降解苯酚能力。本發明的菌株對重金屬鎘的耐受性在液體培養基中最高可達18mM/L，在固體培養基上最高可達16mM/L，顯示了很強的抗鎘特性。本發明的菌株對500mg/L及以下的苯酚在60h內降解率為100％。本發明的菌株可在苯酚和重金屬鎘復合污染的環境中100h內對1000mg/L以下苯酚降解率達75％以上，同時可耐受1mM/L(112mg/L)的Cd2+。
文檔編號C02F101/20GK102533616SQ20121004275
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月23日 優先權日2012年2月23日
發明者付瑾, 劉娜, 平婧, 朱文祥, 柳建設, 王兆慧, 范鳳霞, 袁學武, 謝學輝, 陳小光 申請人:東華大學