專利名稱：一種低溫生物脫氮的約氏不動桿菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物脫氮領域，特別涉及一種用于低溫生物脫氮的約氏不動桿菌菌株 及其應用。
背景技術：
目前，我國水污染的狀況十分嚴峻，其中由氮、磷污染引發的水體富營養化問題尤 為突出。據環境部門的監測結果顯示，我國七大水系中一半以上河段水質受到污染，全國 1/3的水體不適于魚類生存，1/4的水體不適于灌溉，90 %的城市水域污染嚴重，50 %的城 鎮水源不符合飲用水標準，40%的水源已不能飲用，主要污染物為氨氮、CODfc, B0D、揮發酚 和石油類物質。因此，嚴格控制污水達標排放，有效控制水污染狀況已經成為水資源保護的 當務之急。人類日常生活產生的生活污水排放量大，含有機物以及氮、磷等營養物質多，已經 成為水體的重要污染源。《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002)中提出了嚴 格的有機物、氮、磷等污染物的排放標準。目前的城市污水處理廠大都采用運行穩定、成本低廉的生物處理工藝，其中具有 脫氮除磷功能的A20、倒置A20、SBR等工藝及NICH深度處理工藝的應用日益廣泛。通常情 況下，這些工藝可以較有效地去除水中的有機物及氮、磷等營養元素，實現達標排放。然而，在寒冷的冬季，水溫嚴重下降，尤其在廣大的北方地區，排水溫度可以達到 10°c甚至更低。低溫嚴重抑制了生物處理系統中微生物的活性，從而使污染物去除速率明 顯降低，出水難以達標。其中，自養的硝化細菌受到低溫的抑制作用更加顯著，在低溫條件 下生長極其緩慢，硝化反應速率極為低下；而低溫條件下水中溶解氧濃度的升高也對缺氧 反硝化的進行造成了顯著的不利影響。因此，在低溫條件下進行生物脫氮已經成為城鎮生 活污水處理廠實現達標排放的一大難題。為了應對寒冷天氣條件下出現的上述問題，常常在工程上采用降低污泥負荷、增 加污泥回流量、增加污水停留時間、以及對部分構筑物采取保溫或升溫等措施來保證出水 水質。然而，這些措施不僅會增加工程投資和運行費用，而且很難保證污水處理效果，還常 會引起污泥膨脹等問題。不少研究指出，分離、篩選高活性的低溫微生物用于冬季生活污水的處理，能夠從 根本上解決低溫條件下污染物去除率低下的問題。研究者們已經嘗試向生物處理池中投加 自養硝化污泥來提高氨氮的去除效率，但是在低溫、較高溶解氧條件下反硝化難以進行，從 而導致硝化反應產生的硝氮、亞硝氮無法得到有效去除，出水總氮仍然難以達標。此外，由 于自養硝化菌生長緩慢，難以在系統中持留，往往需要進行連續投加，增加了運行費用。針對這種情況，本發明篩選出耐冷的異養硝化-好氧反硝化菌用于低溫生活污水 的處理。該菌能夠在低溫、好氧條件下高效的進行硝化和反硝化反應，實現同步硝化反硝 化，高效、徹底地去除污水中的總氮。此外，該菌在低溫條件下生長良好，可以在生物處理系 統中長期持留，無須進行連續投加。該菌株的應用對于解決低溫脫氮難題具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在于提供一種用于低溫生物脫氮的約氏不動桿菌菌株及其應用。本發明提供的約氏不動桿菌(Acinetobacter johnsonii)菌株HA7已與2010年 9月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為 CGMCC No. 4168。菌株HA7是從活性污泥中分離、篩選得到的一株革蘭氏陰性細菌。形態特征菌株HA7在15-20°C下，營養瓊脂培養基上培養對-3他后，菌落表面光 滑，無色素；通過革蘭氏染色后在顯微鏡下呈陰性；菌體呈球狀或球桿狀，成雙排列為主。該菌株的16S rRNA基因序列特征其16S rRNA具有如序列表中序列1所示的核 苷酸序列，序列長度為1411bp。根據其形態特征及其16S rRNA基因序列，鑒定該菌株為約氏不動桿菌 (Acinetobacterjohnsonii)0該菌株HA7可在低溫條件下脫氮，在實際應用中，可將菌株HA7置于含氮液體中， 進行生物脫氮。所述含氮液體的碳源為為醋酸鈉或琥珀酸鈉。所述含氮液體的氮是氨氮、硝酸鹽氮和/或亞硝酸鹽氮。所述含氮液體的溶解氧可為2_6mg/L。所述含氮液體的溫度10°C -20°C。所述含氮液體的pH可為6-12。本發明的又一目的在于提供一種用于低溫生物脫氮的微生物菌劑，其活性成分為 所述的菌株HA7。本發明的約氏不動桿菌及其應用與現有技術相比較有如下有益效果1.本發明的菌株HA7對低溫的耐受能力強，能夠在低溫、好氧條件下分別以氨氮 或硝酸鹽氮為唯一氮源生長，并進行異養硝化-好氧反硝化作用，是首次報導的耐冷異養 硝化-好氧反硝化菌。利用該菌株的這種特性，可以將其直接接種于低溫含氮廢水中，只需 要通過好氧階段即可實現總氮的快速、徹底去除。該菌株的應用可以解決低溫條件下自養 硝化細菌生長困難，硝化反應難以進行的問題；另外，不需設置缺氧反硝化段即可實現總氮 的有效去除，簡化了工藝流程，節省了基建和運行費用，具有巨大的經濟效益和環境效益；2.本發明的菌株HA7適用于各種含氮廢水的脫氮處理，應用前景廣闊，具有很好 的社會效益；3.本發明的菌株HA7在10°C下接種到初始氨氮濃度為80mg/L的廢水中，可以 利用醋酸鈉為唯一碳源，氨氮為唯一氮源進行新陳代謝。經過20h，氨氮的去除率達到 97. 4%，而硝氮和亞硝氮的濃度低于;3mg/L。廢水中大部分的氨氮通過異養硝化-好氧反硝 化作用直接轉化為氣體產物，從而實現了總氮的有效去除。4.本發明的菌株HA7在10°C下接種到初始硝氮濃度近80mg/L的廢水中，可以 利用醋酸鈉為唯一碳源，硝氮為唯一氮源進行新陳代謝。經過48h，硝氮的去除率達到 67.3%，亞硝氮沒有積累。5.本發明的菌株HA7的生長溫度為4_30°C，在10°C仍然能夠生長良好并高效、徹底地去除總氮。6.本發明的菌株HA7在接種量較大約為10%時，脫氮性能較好。但即使在接種量 較小約為5%時，仍能高效去除廢水中的氮素，處理效果并不隨接種量的降低而明顯下降。 這種特性也使得菌株在實際應用中經濟可行。
圖1為菌株HA7的顯微鏡照片；圖2為菌株HA7在10°C下對氨氮的降解曲線；圖3為菌株HA7在10°C下對硝氮的降解曲線；圖4為菌株HA7在不同溫度下對氨氮的降解曲線；圖5為菌株HA7在不同接種量時對氨氮的降解曲線；
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中，所述百分含量如無特殊說明，均為質量百分含量。實施例1.具有低溫異養硝化-好氧反硝化性能的菌株HA7的篩選具體步驟如下1)取IOml于低溫條件下馴化成熟的污泥至裝有90ml無菌水及滅菌玻璃珠的三角 瓶中，搖床振蕩池，使污泥充分破碎；2)采用倍比稀釋法將破碎后的污泥稀釋成10人10_2、…、IO-6各個梯度的菌懸液， 取稀釋度為10_4、10_5、10_6的菌懸液各0. ImL,均勻涂布于含BTB培養基(每L含醋酸鈉 2. 73g, NH4Cl :0. 306g, KNO3 :1. 0g, KH2PO4 :0. 15g, MgSO4 · 7H20 :0. lg, FeSO4 · 7H20 :0. OOlg, L-天冬堿:1. Og, BTB (1%溶于酒精):1ml，瓊脂:16_18g，pH :7. 0-7. 3，121 °C 20min 蒸汽滅 菌)IOml的固體平板上；3)將平板置于培養箱中15°C恒溫培養直至單菌落的形成。選取適當梯度的平板 進行觀察，對各個菌落的形態特征進行詳細比對以識別出各個不同的單菌落；4)挑取單菌落反復進行BTB平板劃線，直到確保平板上的單菌落形態一致，取單 菌落接于BTB斜面上保藏；幻通過BTB平板上菌的生長情況以及BTB平板顯色反應的深淺對菌的低溫生長性 能以及好氧反硝化性能進行半定量的判別；6)測定各個菌株在10°C時的脫氮性能；7)考察各個菌株在10°C傳代穩定性；8)考察各個菌株對低溫的耐受能力；9)由此分離出一株對低溫耐受能力強并且具有異養硝化-好氧反硝化能力的細 菌——約氏不動桿菌菌株HA7，并與2010年9月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 4168。實施例2.菌株在低溫條件下的脫氮實驗一、以氨氮為氮源的生物脫氮實驗
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以醋酸鈉為有機碳源，氨氮為氮源，實施例1中所述菌株HA7對氨氮的去除能力測 定。具體實施步驟如下將菌株HA7接種于150ml的CMa培養基中(每升含醋酸鈉2. 73g, NH4Cl :0. 306g, KH2PO4 :0. 15g, MgSO4 · 7H20 :0. lg, FeSO4 · 7H20 :0. OOlg, pH :7. 0-7. 3，121 "C 20min 蒸汽滅 菌)，于搖床10°C，160r/min進行預培養。待菌株生長至對數生長期后期時，取IOml的菌液 接入新鮮的150ml CMa培養基中，10°C，160r/min進行振蕩培養。每隔一段時間取反應液， 測定菌體光密度(OD6J之后，SOOOrpm離心lOmin，取上清液測定各種含氮化合物濃度。結果如圖2所示，菌株HA7在低溫下生長良好，且對氨氮有較強的降解能力。整 個降解過程中，菌株處于對數生長期，氨氮的濃度呈直線下降，經過20h，氨氮的去除率達到 97. 4%，氨氮降解速率達到3. 95(mgN/L · h)。此外，在整個降解過程中，硝氮和亞硝氮的濃 度一直維持在:3mg/L以下，廢水中大部分的氨氮通過異養硝化-好氧反硝化作用直接轉化 為氣體產物。因此，該菌株在低溫條件下僅經過好氧階段就有效實現了氮素的徹底去除。二、以硝酸鹽氮為氮源的生物脫氮實驗以醋酸鈉為有機碳源，硝氮為氮源，實施例1中所述菌株HA7對硝氮的去除能力測 定。具體實施步驟如下將菌株HA7接種于150ml的CMn培養基中(每升含醋酸鈉2. 73g，KNO3 :0. 577g， KH2PO4 :0. 15g, MgSO4 · 7H20 :0. lg, FeSO4 · 7H20 :0. OOlg, pH :7. 0-7. 3，121 "C 20min 蒸汽滅 菌)，于搖床10°C，160r/min進行預培養。待菌株生長至對數生長期后期時，取IOml的菌液 接入新鮮的150ml CMn培養基中，10°C，160r/min進行振蕩培養。每隔一段時間取反應液， 測定菌體光密度(OD6J之后，SOOOrpm離心lOmin，取上清液測定各種含氮化合物濃度。結果如圖3所示，菌株HA7在低溫、好氧條件下仍對硝酸鹽氮有較強的去除能力。 經過48h，硝氮的去除率達到67. 3%，并且亞硝氮沒有積累。這充分說明該菌株在好氧條件 下能夠以硝氮和亞硝氮作為電子受體進行反硝化作用，具有較好的好氧反硝化性能。實施例3.菌株在不同溫度條件下的脫氮實驗以醋酸鈉為有機碳源，氨氮為氮源，實施例1中所述菌株HA7在不同溫度下對氨氮 的去除能力測定。具體實施步驟如下將菌株HA7接種于150ml的CMa培養基中，于搖床10°C、20°C、30°C，160r/min進 行預培養。待菌株生長至對數生長期后期時，取IOml的菌液接入新鮮的150ml CMa培養基 中，分別與10°C、2(TC、3(rC，160r/min進行振蕩培養。每隔一段時間取反應液，測定菌體光 密度(OD6J之后，SOOOrpm離心lOmin，取上清液測定各種含氮化合物濃度。結果如圖4所示，該菌株在10°C-30°C的溫度范圍內，均可以有效的去除氨氮。其 在20°C時的性能略優于30°C，在10°C時生長良好，并且能夠較為快速的去除氨氮。而普通 的中溫菌一般最適溫度高于30°C，在15°C以下性能嚴重下降，在10°C時生長困難。由此可 見，該菌株為對低溫有良好耐受能力的耐冷菌，其能夠在低溫條件下有效實現生物脫氮。實施例4.菌株在不同接種量時的脫氮實驗以醋酸鈉為有機碳源，氨氮為氮源，實施例1中所述菌株HA7在不同的接種量下對 氨氮的去除能力測定。具體實施步驟如下將菌株HA7接種于150ml的CMa培養基中，于搖床10°C，160r/min進行預培養。待 菌株生長至對數生長期后期時，分別取7. 5ml、10ml、15ml的菌液接入新鮮的150ml CMa培養基中，10°C，160r/min進行振蕩培養。每隔一段時間取反應液，測定菌體光密度(0D_)之 后，SOOOrpm離心lOmin，取上清液測定各種含氮化合物濃度。 由圖5可見，菌株HA7在接種量較大約為10%時，脫氮性能較好。但即使在接種量 較小約為5%時，仍能高效去除廢水中的氨氮，處理效果并不隨接種量的降低而明顯下降。 該特性無疑使得菌株在易于實際應用。
權利要求
1.約氏不動桿菌(AcinetcAacterjohnsonii)菌株HA7，保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4168。
2.權利要求1所述的約氏不動桿菌(AcinetcAacterjohnsonii)菌株HA7在水溶液中 進行低溫脫氮的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述的水溶液的溶解氧是2-6mg/L。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特征在于所述低溫為10-20°C。
5.根據權利要求2-4任一所述的應用，其特征在于所述的水溶液中的氮是氨氮、硝酸 鹽氮、亞硝酸鹽氮中的一種或者幾種。
6.一種用于低溫脫氮的微生物菌劑，其活性成分為權利要求1所述的約氏不動桿菌 (Acinetobacter johnsonii)菌株 HA7。
全文摘要
本發明公開了一種能夠在低溫條件下進行生物脫氮的約氏不動桿菌菌株及其應用。本發明提供的約氏不動桿菌(Acinetobacter johnsonii)菌株HA7已于2010年9月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No.4168。在10-20℃下，將該菌株置于溶解氧為2-6mg/L的含氮廢水中即可生物脫氮。該菌株對低溫的耐受能力強，在低溫條件下生長良好，并且同時具備異養硝化和好氧反硝化的能力。在低溫、好氧條件下，該菌株能夠進行同步硝化反硝化，高效、徹底地去除污水中的總氮，從而有效解決低溫條件下生物脫氮難以進行的重大難題，具有良好的應用前景。
文檔編號C02F3/34GK102061277SQ201010543800
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月15日 優先權日2010年11月15日
發明者倪晉仁, 姚碩 申請人:北京大學