專利名稱：Tt1基因在提高植物和微生物抗重金屬能力中的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及TTl基因在提高植物和微生物抗重金屬能力 中的用途。
背景技術：
土壤是人類賴以生存的主要資源之一，它是生態環境的重要組成部分，也是地球 化學循環的儲存庫，對環境變化具有高度的敏感性，所以土壤污染是環境污染的重要環節。 近年來，隨著現代工業的發展和農業生產的現代化，工業三廢的排放，農業化肥與有機農藥 的大量施用，生活污水的不斷排放，城市污泥，礦床的開采等大量的污染物進入土壤環境， 土壤污染日益嚴重。其中重金屬污染是當今面積最廣，危害最大的環境問題之一。重金屬是在工業生產和生物學效應方面均具有重要意義的一大類元素，在化學概 念上，還沒有明確的的定義，但是目前還是有了廣為接受的概念，那就是元素的密度大于 6g/cm3，具有金屬性質(延展性、導電性、穩定性、配位特性等，且原子數目大于20的元素)。 環境污染方面所涉及的重金屬主要是指生物毒性顯著的汞、鎘、鉛、鉻以及類金屬砷，還包 括具有毒性的重金屬鋅、銅、鈷、鎳、錫、釩等。當土壤中的重金屬含量積累到一定程度，會對土壤植物系統產生毒害作用，導致 土壤退化、農作物的產量和品質下降，每年因重金屬污染帶來的糧食減產達1000多萬噸， 被重金屬污染的糧食每年達1200萬噸，直接年經濟損失在200多億元。另外，重金屬可以 通過植物的吸附作用進入植物體內，另外還可以通過徑流和淋洗等作用污染地表水和地下 水，最終能通過接觸和食物鏈等途徑危害人們的生命健康。由于重金屬污染毒性機制和生 物效應的復雜性，重金屬污染一直是被當做研究的熱點。因此，土壤重金屬污染的治理對于 環境質量的改善十分重要，土壤重金屬污染的修復也是環境可持續發展的必然要求。目前，治理土壤重金屬污染的途徑主要有2種一是利用物理的、化學的方法試圖 清除土壤或水體的重金屬污染。二是利用植物、微生物自身，結合現代生物技術來治理污 染。后者已成為環境科學的熱點和前沿領域，該技術普遍被認為具有物理、化學修復方法所 無法比擬的費用低廉、不破壞場地結構、不造成地下水二次污染、可以美化環境的作用、易 為社會接受等優點，發展前途十分廣闊。植物修復技術1983年，Chaney提出利用超富集植物清除土壤重金屬污染的思想，該思想于九十 年代逐步被應用于鋅、銅、鎳、鎘、砷等重金屬污染土壤的修復。自此，植物修復研究逐漸發 展成一門新興的環境技術，即利用自然生長的或通過遺傳工程培育的植物種植于污染環境 中，通過植物系統及其根際微生物群落將污染物移除、揮發或轉變的技術。微生物修復技術土壤微生物作為地球化學物質循環和能量轉換的主要參與者，土壤微生物對重金 屬等污染物脅迫的響應要比同一環境中的動物和植物更加靈敏。重金屬污染的微生物修復 是利用微生物的生物活性對重金屬的親合吸附或轉化為低毒產物，從而降低重金屬的污染程度。目前應用微生物的高效降解、轉化能力在治理重金屬污染方面已經取得了良好效果。然而，利用植物、微生物修復技術還存在一定的局限性超富集植物雖具有較強的 重金屬吸收能力，但植物種類少，通常植株矮小、生物量低、生長緩慢，因而修復效率低 ’另 外，微生物對環境變化較為敏感，某些環境中物質會對微生物產生毒性，降解轉化過程所涉 及的生化反應受到抑制而影響處理效果。解決這些問題的根本途徑在于研究這類生物的耐 受重金屬的分子機制，克隆各類重金屬耐受的相關基因，通過基因工程手段獲得可直接用 于修復污染的轉基因生物。在申請人之前遞交的中國專利申請200810045667. 8中記載了 分離自油菜的新基因，命名為TT1。綜上可知，重金屬污染已成為世界各國共同關注的問題。對于植物抗重金屬機制 的研究和抗重金屬基因工程方面的工作已有表明通過生物技術手段，將抗重金屬機制中相 關基因導入植物體內得到抗重金屬轉基因植株將會成為植物抗重金屬改良的一種新的育 種途徑，對于作物的生產和抗重金屬種質的篩選具有重要的意義。但是目前本領域很少有 可供選用的抗重金屬基因。
發明內容
本發明要解決的技術問題是為提高植物和微生物抗重金屬能力的轉基因技術領 域提供一種新的有效選擇。本發明解決該技術問題的技術方案是提供了 TTl基因在提高植物或微生物抗重 金屬能力中的用途。其中，上述TTl基因的核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。也能提高植物或 微生物的抗重金屬能力。本發明同時提供了 TTl基因編碼的多肽在提高植物或微生物的抗重金屬能力中 的用途。上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。本發明還提供了一種培育具有更強抗重金屬能力的植物或微生物的方法。該方法 包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連于載體上的表達調控序列后，形成所述TTl基因的重組 載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉入植物細胞或微生物中；(3)經篩選獲得轉化細胞，然后將轉化細胞培育成轉基因抗重金屬植株或抗重金 屬微生物株系及其后代，所述植物的后代包括植物種子及植物組織。其中，上述植物可為一般的各種農作物，如常見禾本科或十字花科植物。其中，上述微生物可為一般的各種微生物，如大腸桿菌或酵母菌。
本發明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，該 基因來源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥屬(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)。在本發明中，“在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列經過取代、缺失或添加至少一個核 苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID NO. 1所編碼的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指所述序列中有一個或多個密碼子被編碼相同 氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 1同 源性低至約89%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 1所述的序列。另外，“在SEQ ID NO. 1 中的核苷酸序列經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生序列”的含義還包括能在中度 嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQ ID NO. 1核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該 術語還包括與SEQ IDN0. 1中的核苷酸序列的同源性至少80 %，較佳地至少89 %，更佳地至 少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。在本發明中的相同功能是指提高植物或微生物的 抗重金屬能力。該術語還包括能編碼具有與天然的SEQ ID N0. 2相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1 中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1 90個，較佳地1 60個，更佳地1 20個，最佳地1 10個)核苷酸的缺失、插入和/或 取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為 10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其編碼的 多肽也能提高植物或微生物的抗重金屬能力。本發明所述重組載體，是將TTl基因插入到載體中獲得，上述載體可選用本領域 已知的各種載體，尤其是真核表達載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發明用上述重組載 體轉化宿主植物細胞或微生物細胞，篩選獲得轉化細胞。然后將轉化細胞培育成轉基因抗 重金屬植株或抗重金屬微生物株系及其后代，所述植物后代包括植物種子及植物組織。本發明中所述的“可操作地連于”表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠 影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽 的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動子控制序 列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位 置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前 導序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發明的有益效果在于本發明提供了 TTl基因在提高植物和微生物抗重金屬能 力方面的用途，在本發明的實施例中也通過實驗證明轉入了 TTl基因并過表達的植物和微 生物對重金屬的抵抗能力有了顯著的提高。本發明培育出抗重金屬植物和微生物的方法也 簡便而有效，為提高植物和微生物抗的重金屬能力提供了新的有效選擇，具有好的應用前旦O
圖1為TTl基因過量表達甘藍型油菜的檢測結果，1、2、3、4為TTl基因過量表達甘 藍型油菜，M :marker。圖2為轉TTl基因大腸桿菌抗重金屬實驗結果，橫坐標為時間，縱坐標為0D600值。
具體實施例方式下面通過實施例并結合附圖，進一步說明而不限定本發明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的 常規條件，例如Sambrook，Russell的分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實施 例中，所用農桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌株；大 腸桿菌(E. coli)采用大腸桿菌JM109菌株、BL21菌株，菌株均購自于Qiagen公司。載體 PBI121、pED8均購自于Clontech公司。其余化學實際均為市售分析純。下述實施例中， "SEQ IDNO :1”單獨出現時，本領域技術人員可理解1其為“SEQ ID NO :1所示核苷酸序列” 的簡稱實施例一、TTl基因的克隆及獲取以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因為誘餌蛋白，根據酵母雙雜交方 法(見Clontech公司所公開的資料)，篩選到油菜中的一個EST序列(SEQ ID N0:2所示)， 再根據這段篩選到的序列，通過5’ RACE(見Takara公司所公開的資料)的方法獲得本發 明所述提高植物抗重金屬能力的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。根據 SEQ IDN0. 1所示核苷酸序列設計引物，上游引物(SEQID N0. 5) :5，-ATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3，；下游引物(SEQID N0. 6) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。 然后經PCR從油菜cDNA中擴增SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。對PCR產物純 化(見Qiagen公司所公開的PCR產物純化資料)，經測序驗證，得到SEQ ID NO. 1的基因序 列。實施例二、轉TTl基因油菜的制備及其對重金屬抗性的測定1、目的基因過量表達重組質粒構建根據SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設計引物，上游引物(SEQID N0. 7) :5，-CGC GGATCCATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3，；下游引物(SEQID N0. 8) :5，-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。經PCR，從油菜cDNA中擴增完整的SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，對PCR產物純 化(見Qiagen公司所公開的資料)，然后用BamHl與Mcl酶切，膠回收，與載體pBI121連 接(連接位點=BamHl與Mel)，獲含SEQ ID NO 1的過量表達重組質粒。將含SEQ ID NO 1的過量表達重組質粒轉入農桿菌中，利用下胚軸浸染的方法轉化甘藍型油菜(見步驟2)。2、胚軸浸染的方法轉化甘藍型油菜2. 1、無菌苗的獲取選取籽粒飽滿的甘藍型油菜種子，4°C過夜春化(保持種子發芽同步)，然后取出， 用70%乙醇浸泡30s，0. 的升汞(HgC12)溶液浸泡8-lOmin，無菌水沖洗5次，濾紙吸干， 接種于MS固體培養基上。置培養室中M°C，暗培養2-3天，然后取出光照16h/d繼續萌發。 取5 7cm(約7-8天)無菌苗下胚軸作為轉化受體。2. 2、下胚軸的預培養
將油菜下胚軸切成7mm左右小段，分散均勻置于預培養基(MS+^ig/L 6_BA，lmg/ L2，4-D，2. 5mg/L AgN03,19. 62mg/L乙酰丁香酮)中進行2 3天的預培養(可見下胚軸變 粗)。2. 3、下胚軸的浸染及共培養挑取含SEQ ID NO 1的過量表達重組質粒的農桿菌，接種于含20mg/L鏈霉素， 50mg/L卡那霉素，40mg/L利福平的LB液體培養基中，28°C搖菌過夜后收集菌體，重懸于含 100mg/L乙酰丁香酮的MS液體培養基中至0D600 = 0. 4-0. 6J8°C搖菌l_2h。將經預培養的健壯的油菜下胚軸分別浸入含SEQ ID NO :1的過量表達重組質粒 的農桿菌菌液中30s-lmin，此期間不斷振蕩使菌液與油菜下胚軸充分接觸。用無菌濾紙迅 速吸干多余的菌液，將油菜下胚軸平放于共培養基(MS+ang/L 6-BA, lmg/L 2，4_D，2. 5mg/ LAgN03,19. 62mg/L乙酰丁香酮)上，共培養2d。2. 4、篩選培養與芽的誘導將共培養后的兩種油菜下胚軸分別接入分化培養基(MS+ang/L 6-BA, lmg/L2, 4-D, 2. 5mg/L AgN03,19. 62mg/L乙酰丁香酮)中繼續培養。每2周更新培養基一次，培養4 周，得到愈傷芽。2. 5、生根在篩選培養基(MS+2mg/L6-BA, 2. 5mg/L AgN03, 500mg/L 羧芐青霉素，lOmg/L 卡 那霉素)上待兩種愈傷芽長至有4-6片真葉時，將芽從愈傷組織中切下，移入生根培養基 (1/2MS，0. 15mg/L NAA，250mg/L頭孢霉素)中。待再生苗根系生長發達時，將培養罐移至室 外2-3d，然后將培養罐蓋揭開，在培養室中煉苗2-3d。2. 6、盆栽培養將含SEQ ID NO 1的過量表達轉基因植株分別在生根培養基上發育出完整根系， 將其轉入盆栽。3、轉基因油菜的PCR檢測待土壤中兩種再生植株長大后，各取葉片少量抽提總DNA，以提取的DNA做模板， 分別進行PCR檢測。目的基因過量表達甘藍型油菜轉基因株系檢測上游引物(SEQID NO. 9) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，；下游引物(SEQID NO. 10) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后瓊脂糖電泳檢測，檢測結果見圖1，若有目標條帶出現則代表目的基因已轉入 甘藍型油菜。所檢測出目的條帶的大小和預期SEQ ID N0:1大小一致，約為860bp。制得 SEQ IDNO 1核苷酸序列過量表達甘藍型油菜植株和種子備用。供試土壤取自四川涼山州甘洛縣鉛鋅礦區附近種植區的土壤，取轉TTl基因和非 轉基因甘藍型油菜種子，播種于重金屬污染土壤中，進行溫室培養(光照強度10000LX，光 照時間14h/d)。觀察其生長狀況，待長至5-6片真葉時，進行各項生理指標的檢測。4、重金屬抗性測定4.1、電導率測定取干凈試管，加入IOml去離子水，測定本底電導率值E0，記錄數據。取2g植物材 料，每組10個重復，分別放入加有去離子水的試管中，在室溫條件下置于恒溫振蕩培養箱 中勻速振蕩浸泡過夜。
振蕩完畢，搖勻試管中的浸泡液，測定電導率值，記錄電導率E1。再將各個試管 (浸泡液及材料)加蓋，沸水浴8min，冷卻至室溫后，測定浸泡液的電導率E2。相對電導率計算公式為相對電導率(％ ) = (El-EO)/(E2-E0) X 100%。
實驗結果得知，野生型油菜相對電導率平均45. 38%，而轉TTl基因油菜相對電導 率平均21. 03%。相對電導率低，表明受外界逆境的影響小，抵抗逆境的能力強。轉基因植 株的電導率均比野生型低，說明TTl基因具有改變細胞透性的功能，提高細胞膜在有害重 金屬脅迫下的穩定性，減少重金屬離子的吸收。4. 2、原子吸收分光光度法測定油菜葉片中Pb、Cd、Cr、Zn含量選取轉TTl基因型及野生型油菜葉片，自來水洗滌干凈，蒸餾水潤洗，潔凈紗布擦 干，置于恒溫干燥箱內于殺青30min，然后烘干，置于干燥器中待用。將樣品置于玻璃研缽反復研磨，直至全部通過40目尼龍篩孔，貯存于牛皮紙袋 內，再置于干燥器中備用。準確稱取上述已制備樣品2 3g，放入150ml三角瓶中，加濃硝酸15ml、高氯酸 5ml，放置于電熱板(150°C )上加熱，當溶液清澈無色時，降低溫度并加熱至近干，離開電熱 板于室溫下冷卻，用去離子水溶解并定容到IOOml容量瓶中，上機分析(AA-6800原子吸收 分光光度計)。植物樣品中重金屬含量(mg/kg) = CXX (V/m)，其中CX 從標準曲線上查找 的濃度mg/kg，V 定容體積ml，m 樣品質量g。結果如表1 :表1油菜葉片中重金屬含量測定結果
權利要求
1.TTl基因在提高植物或微生物抗重金屬能力中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
3.TTl基因編碼的多肽在提高植物或微生物抗重金屬能力中的用途。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
5.根據權利要求1或3所述的用途，其特征在于所述的植物為禾本科或十字花科的植物。
6.一種培育抗重金屬植物或抗重金屬微生物的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連于載體上的表達調控序列后，形成所述TTl基因的重組載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉入植物細胞或微生物中；(3)經篩選獲得轉化細胞，然后將轉化細胞培育成轉基因抗重金屬植株或抗重金屬微 生物株系及其后代，所述植物的后代包括植物種子及植物組織。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體涉及TT1基因在提高植物和微生物抗重金屬能力中的用途。本發明要解決的技術問題是為提高植物和微生物抗重金屬能力的轉基因技術領域提供一種新的有效選擇。本發明解決技術問題的技術方案是提供了TT1基因在提高植物和微生物抗重金屬能力方面的用途，經實驗證明轉入了TT1基因并過表達的植物和微生物對重金屬離子濃度高的逆境表現出了良好的抗性。本發明培育出抗重金屬植物和微生物的方法也簡便而有效，在本領域有很好的應用前景。
文檔編號B09C1/10GK102134578SQ201010300570
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月22日 優先權日2010年1月22日
發明者楊毅 申請人:四川貝安迪生物基因工程有限公司