專利名稱：一種細菌漆酶基因及其表達與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說一種細菌漆酶及其表達，以及該細菌漆酶蛋 白在工業上的應用。
背景技術：
漆酶(Laccase，EC 1. 10. 3. 2)是一類含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類和非 酚類化合物氧化，同時伴隨有分子氧還原成水。漆酶作用底物廣泛、催化效率高，在生物制 漿和漂白、食品風味改良、飼料營養改善、人工合成染料脫色、紡織纖維軟化細化、新型藥物 開發、生物傳感器制造及新型能源開發等領域具有潛在重要應用價值，近年來成為國際酶 工程學和環境科學交叉領域研究的一個熱點。漆酶廣泛存在于高等真菌(特別是擔子菌)中。近年來，部分真菌漆酶已經應用 于工業生產，如DeniLite 、Zylite等。然而，真菌漆酶受羥基離子的影響較大，在堿性條 件下活性迅速降低，嚴重影響了其在工業中的應用。隨著全基因組測序技術的迅速發展， 人們發現，漆酶在細菌中同樣廣泛存在。細菌漆酶可以克服真菌漆酶的缺點，其在堿性條 件下具有良好的催化活性并具有較高的穩定性。目前，已經在地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等微生物中發現漆酶，但被系統研究 的細菌漆酶基因不超過20個，需要進一步開發與研究，且目前還沒有細菌漆酶在工業方面 應用的報道。
發明內容
本發明是為避免上述現有技術所存在的不足之處，提供一種細菌漆酶及其表達該 細菌漆酶基因的工程菌株。本發明的細菌漆酶，其原始來源于中國南海海洋海水未培養微生物，其基因編碼， 具有如下核苷酸序列之一(1)序列表中的 SEQ ID No 1 ；(2)序列表中的SEQ ID No :1經取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸且編碼相同 功能蛋白質的核苷酸序列；(3)編碼序列表中SEQ ID No 2蛋白質序列的多核苷酸序列。本發明的細菌漆酶，具有下列氨基酸序列之一(1)序列表中的 SEQ ID No 2 ；(2)序列表中的SEQ ID No :2經取代、缺失或添加一個或幾個氨基殘基且編碼相 同功能蛋白質的氨基酸序列。含有上述細菌漆酶基因的重組表達載體、宿主菌也是本發明的保護范圍。含有上述細菌漆酶基因的重組表達載體的構建方法，以包含細菌漆酶基因的 BAC(Bacterial Artificial Chromosome)載體 DNA 為模板，以 Pl 和 P2 為引物進行 PCR 擴 增，得到PCR擴增產物，并與pMDlS-T質粒連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質粒，獲得含有細菌漆酶基因 (lacl5)的pMD18-T重組質粒，用Nde I和Xho I雙酶切所得的pMD18_T重組質粒和表達質 粒載體，然后用T4連接酶將酶切后的lacl5與表達質粒載體連接，得到連接產物；連接產物 轉化宿主菌，篩選陽性克隆，得到含有本發明lacl5基因的工程菌株；其中所述引物為Pl 5' -CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3‘P2 5' -CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3‘上述構建方法中所述表達質粒載體指pCold、pET15、pET22或pET28等。上述構建方法中所述宿主菌是指E. coli BL21(DE3)、E. coli DH5a、E. coli JM109 或 Ε. coli Rosetta 等。下面以表達質粒載體pET22b(+)、E. coli BL21(DE3)為例，具體介紹含有本發明細 菌漆酶基因的重組表達菌株的構建方法，具體包括以下步驟(1)以包含細菌漆酶基因的BAC載體DNA為模板，以Pl和P2為引物進行PCR擴 增，得到PCR擴增產物；所述引物為Pl 5' -CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3‘
P2 5' -CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3‘(2)將步驟(1)所得PCR擴增產物和pMDIS-T質粒連接，得連接產物；將連接產物 轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取 質粒，獲得含有細菌漆酶基因(lacl5)的pMD18-T重組質粒；(3)用Nde I和Xho I雙酶切步驟(2)所得的pMD18_T重組質粒和pET22質粒， 然后用T4連接酶將酶切后的lacl5與pET22b(+)質粒連接，得到連接產物；連接產物轉化 大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，篩選陽性克隆，得到含有本發明lacl5基因的工程菌株 BL21(DE3)。與現有的細菌漆酶相比，本發明具有的優點為(1)本發明細菌漆酶基因來自于 海洋未培養微生物；2)本發明細菌漆酶在PH6-8范圍內具有好的穩定性，45°C半衰期為73 分鐘；(3)本發明細菌漆酶對偶氮染料的脫色作用強，可用于工業染料的脫色。保藏說明本發明的菌株Escherichia Coli BL21 (DE3)/pET22b (+) _lacl5 已送 往中國典型培養物保藏中心(China Center for Type CultureCollection, CCTCC)保藏， 保藏中心地址中國湖北省武漢市武昌珞珈山；保藏編號CCTCC NO :M2010160，保藏日期 2010年6月25日。
圖1為本發明PCR擴增產物的電泳圖譜；圖1中1為分子量標準；2為PCR擴增產物。圖2為本發明表達載體pET22b(+)/lacl5質粒的鑒定電泳圖譜圖2中1為分子量標準；2為pET22b (+)/lacl5質粒；3為經過Nde I/Xho I雙酶 切的 pET22b(+)/lacl5 ；4 為經過 Ndel/Xho I 雙酶切的 pET22b (+) ；5 為重組 pET22b (+) / lacl5質粒PCR擴增產物。圖3為以丁香醛連氮為底物時測定的Lacl5催化的最適pH和pH穩定性。圖3中〇為最適pH，·為pH穩定性。
圖4為以丁香醛連氮為底物時測定的Lacl5催化的最適穩定和溫度穩定性。圖4中〇為最適pH，·為pH穩定性。
具體實施例方式下列實施例中的實施方法，如無特別說明，均為常規方法。(一 )、含有本發明細菌漆酶基因的表達菌株的構建1、含有本發明細菌漆酶基因的陽性克隆的篩選及全長基因的獲得從中國南海海洋表層海水100L (24° 21' 17N，118° 08' 59E)，分離微生物并提 取基因組，分離和提取方法同申請號為CN200810024342. 1，按照試劑盒(購自Epicentre公 司)提供的說明構建宏基因組文庫。(Chu XM, He HZ,Guo CQ, Sun BL, 2008. Identification of two novel esterases from a marine metagenomic library derived from South China Sea. Appli. Microbiol. Biotechnol. 80，615-625.)得到的單克隆放置于 384 孔板并 于-70°C保存。將每個384孔板中的菌株混合接種在同一 LB液體培養基中培養，抽提混合質粒作 為模板(薩姆布魯克等著，黃培堂等譯.2002，科學出版社，349-350.)，以 CulS :ACMWCKGTTCAYTGGCACGG ；Cu2A GGCTGTGGTACCAGAAKGT 為引物，擴增本發 明細菌漆酶基因Cul和Cu2之間的DNA序列。PCR擴增程序如下第一階段變性94°C，3min ； 第二階段變性94°C，30sec，退火50°C，30sec,延伸72°C，80sec,共進行35個循環；第三階 段延伸72°C，IOmin。得到的PCR產物用3%瓊脂糖電泳檢測，在140bp左右出現條帶的初步 認為是陽性克隆。利用上述方法將陽性克隆定位到單克隆。抽提上述得到陽性單克隆的質 粒作為模板，以 CulS :ACMWCKGTTCAYTGGCACGG,Cu4A TGNTCNAGNAffGTGRCARTG 為引物，擴增 Cul和Cu4之間的DNA序列。PCR擴增程序如下第一階段變性94°C，3min ；第二階段變性 940C，30sec,退火48°C，30sec,延伸72°C，150sec,共進行30個循環；第三階段延伸72°C， IOmin0得到的PCR產物用1 %瓊脂糖電泳檢測，將得到的IlOObp左右的片段送到上海生工 生物工程公司測序，獲得編碼序列。選取Nde I(TaKaRa)對陽性克隆質粒進行單酶切，建立如下酶切體系10ul 10XHbuffer，4ug陽性克隆質粒，20U內切酶，補水至100ul。反應體系于37°C溫育4h。常 規的酚氯仿(25 24，v/v)抽提和75%乙醇沉淀，60ul無菌水溶解DNA片段，-20°C保存在5ml EP管中建立如下自身環化連接體系IOul IOXligation buffer，5ul (約 0. 2ug)上述單酶切回收產物，Iul T4DNA連接酶(TaKaRa)，補水至IOOul。反應體系在16°C 保溫16h。常規的酚氯仿(25 24, ν/ν)抽提和75%乙醇沉淀，60ul無菌水溶解自身環 化連接DNA片段，_20°C保存備用。以上述自身環化連接產物為模板，以得到的IlOObp左右的DNA序列為基礎，設計 反向 PCR 引物 D15IS :5’ -TACACTTGTGGATGCGGGTG,D15IA :5，-AGACCCTTCGCAACTTGTTCCCAT-3，，擴增已知 IlOObp 左右的 DNA 序列的 側翼序列。PCR程序如下第一階段變性94°C，5min ；第二階段變性94°C，Imin,退火54°C， 30sec，延伸72°C，5min，共進行30個循環；第三階段延伸72IOmin0得到的PCR產物用
瓊脂糖電泳檢測，將得到的3. Skb左右的片段送到上海生工生物工程公司測序，獲得側翼編碼序列，結合前期得到的IlOObp長度片段，獲得本發明細菌漆酶全長基因編碼序列。 2、細菌漆酶基因的擴增設計一對寡核苷酸引物Pl和P2，其序列為Pl 5' -CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3‘P2 5' -CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3‘在引物的5'分別引入Nde I和Xho I酶切位點，以步驟1抽提的BAC DNA為模 板，擴增細菌漆酶基因。PCR反應程序如下第一階段變性94°C，5min ；第二階段變性94°C， lmin,退火520C，30sec,延伸72°C，2min,共進行30個循環；第三階段延伸72°C，IOmin0得 到的PCR產物用瓊脂糖電泳檢測，結果見圖1。得到的細菌漆酶的核苷酸序列如SEQ IDNo 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。3、表達載體的構建將步驟2中得到PCR擴增產物，與pMD18-T質粒連接(TaKaRa)，建立如下酶切體 系25ng pMD18-T 載體，50ngPCR 擴增產物，5ul ligation mix,補水至 10ul，16°C連接 lh。 連接產物熱激轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，得到的轉化子測序驗證是否突變；挑選序 列正確的克隆提取質粒，獲得含有細菌漆酶基因(lacl5)的pMD18-T重組質粒；用Nde I 和XhoI雙酶切所得的pMDIS-T重組質粒和pET22b(+)載體，然后用T4連接酶將酶切后的 lacl5與表達質粒載體連接，建立如下酶切體系25ng pET22b (+)載體，50ng lacl5酶切片 段，3ullOXligation buffer, Iul T4DNA 連接酶(TaKaRa)，補水至 30ul，16°C 連接 8h，得到 連接產物；連接產物轉化宿主菌，得到的轉化子測序驗證是否突變，挑選序列正確的轉化子 得到含有本發明lacl5基因的工程菌株E. coli BL21 (DE3)/lacl5。( 二)、含本發明細菌漆酶基因工程菌的表達與蛋白純化將(一)中獲得的基因的工程菌株E. coli BL21(DE3)/lacl5接種于含有氨芐青霉 素的200ml LB液體培養基中，放置于37°C、250rpm條件下培養至OD6qq = O. 6(UNIC0 UV2102 紫外可見分光光度計，以培養LB培養基為空白)；加入終濃度為1. OmM的IPTG進行誘導， 并于16°C、ISOrpm條件下繼續培養20小時；4°C、8000g離心收集菌體，加入0. 1倍菌液體 積的Binding buffer, 350W冰浴條件下超聲40min破碎細胞，30000g離心收集上清，得到粗 酶液。粗酶液經過Ni-NTA柱層析進行純化。洗脫液中咪唑濃度分別為60mM、70mM、80mM、 90mM、100mM，每個濃度洗脫3個柱體積。在咪唑濃度為90_100mM時，得到的蛋白經過檢測 達到SDS-PAGE純度。以丁香醛連氮為底物，純化的細菌漆酶Lacl5的最適pH為7. 5，酶在pH5. 5-8. 0范 圍內有較高的穩定性，能夠維持原酶活力的60%以上。以ABTS為底物，細菌漆酶Lacl5的 最適PH為4. 5-5.0。Lacl5在15°C _55°C范圍內均能顯示催化活性，其最適溫度為45°C， 45°C時酶的半衰期為73min。(三)、含本發明細菌漆酶蛋白脫色偶氮染料能力檢測在pH7. 5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中加入終濃度為0. 4g/L的偶氮類染料(活性深 藍M-2GE、活性艷橙K-7R、活性紅KM-8B、活性紅KD-8B)，加入終濃度為100ug/L的介體丁香 酸甲酯、丁香醛或ABTS (2，2’-連氮基-雙-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]，并加入終濃度 為5U/L的經M-NTA柱層析純化的細菌漆酶蛋白，40°C條件下反應1小時，測定不同染料在各自最大光吸收下的光吸收值(Al)，以失活的細菌漆酶蛋白為對照(AO)0脫色率通過下述 公式計算
躕色率％ = ^^ X 100%Lac 15對各種染料的脫色能力如下表所示(表1)表1不同介體存在條件下Lacl5對各種染料的脫色能力(％ )
權利要求
一種細菌漆酶的基因編碼，其特征在于，具有如下核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID No1；(2)序列表中的SEQ ID No1經取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；(3)編碼序列表中SEQ ID No2蛋白質序列的多核苷酸序列。
2.含有權利要求1基因編碼的細菌漆酶，其特征在于，具有下列氨基酸序列之一(1)序列表中的SEQID No 2 ；(2)序列表中的SEQID No :2經取代、缺失或添加一個或幾個氨基殘基且編碼相同功 能蛋白質的氨基酸序列。
3.含有權利要求1所述的細菌漆酶基因的重組表達載體。
4.含有權利要求1所述細菌漆酶基因的宿主菌。
5.含有權利要求1所述細菌漆酶基因的重組表達載體的構建方法，其特征在于，包括 如下步驟(1)以包含細菌漆酶基因的細菌人工染色體載體(BacterialArtificial Chromosome,BAC)DNA為模板，以Pl和P2為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，所述引 物為Pl 5' -CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3‘P2 5' -CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3‘(2)將步驟(1)所得PCR擴增產物和PMD18-T質粒連接，得連接產物；將連接產物轉 化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質 粒，獲得含有細菌漆酶基因(lacl5)的pMD18-T重組質粒；(3)用NdeI和Xho I雙酶切步驟⑵所得的pMD18-T重組質粒和pET22質粒，然 后用T4連接酶將酶切后的lacl5與pET22b(+)質粒連接，得到連接產物；連接產物轉化 大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，篩選陽性克隆，得到含有本發明lacl5基因的工程菌株 E.coliBL21(DE3)/lacl5。
6.含有權利要求1或2所述基因編碼的細菌漆酶蛋白在偶氮染料脫色方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種細菌漆酶及其表達及其應用，其基因編碼序列如SEQ ID No1所示，該細菌漆酶是具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列的多肽，本發明還公開了含有該細菌漆酶的表達菌株。本發明所述細菌漆酶來自海洋未培養微生物，在pH6-8范圍內具有好的穩定性，45℃半衰期為73分鐘，且對偶氮染料的脫色作用強，可用于工業染料的脫色。
文檔編號C02F3/00GK101955952SQ201010248218
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月2日 優先權日2010年8月2日
發明者張學成, 彭惠, 房偉, 方澤民, 李同亮, 洪宇植, 肖亞中 申請人:安徽大學