專利名稱：一種同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種異養反硝化菌。
背景技術：
隨著石油化工、制藥、食品發酵、造紙等產業的迅猛發展，含硫含氮有機廢水污染 日趨嚴重。生物處理廢水技術相比物化處理具有高效、運行成本低、無有毒副產物等優勢， 故備受青睞。對于含硫含氮的有機廢水的生物處理，大多數都是將脫硫和脫氮在兩個分別 的反應系統將這類污染物得以去除，即含硫化物的污染物通過硫化物氧化菌的生物氧化作 用，將其氧化到單質硫從而實現硫化物的去除；而含有硝酸鹽類的含氮廢水，通過反硝化菌 的生物代謝，在有機碳源充足的條件下，通過反硝化過程將其轉化為氮氣；由此可見，傳統 的處理這類廢水的工藝具有運行成本高、占地面積大、一次性投資高、處理效果差等弊端。 隨著近些年來一類自養反硝化菌如(Thiobacillus denitrificans)逐漸得到了生物處理 廢水領域的重視，這類自養反硝化菌可以以硫化物作為電子供體，硝酸鹽作為電子供體進 行反硝化作用，將硫化物氧化到單質硫，硝酸鹽還原為氮氣，從而實現了硫化物和硝酸鹽類 污染物的同步去除，但是這類自養微生物存在生長周期長，耐水力沖擊能力差，處理能力低 等缺點，從而限制了這類功能微生物在處理含硫含氮廢水工藝的開發和應用潛力。因此，篩選到同步高效去除硫化物、硝酸鹽和有機碳源，并且處理能力強，生長周 期短的異養微生物對于改善目前含硫含氮有機廢水生物處理技術在生物脫硫脫氮理論和 工程實際應用等方面具有舉足輕重的意義。
發明內容
本發明目的是為了解決傳統方法處理含硫含氮的有機廢水存在運行成本高、占地 面積大、一次性投資高和處理效果差的問題；而采用自養反硝化菌則存在菌的生長周期長、 耐水力沖擊能力差和處理能力低的問題，而提供一種同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源 的異養反硝化菌。本發明一種同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌C27經鑒定屬于 假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)新種，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所，保藏日 期為2010年1月26日，保藏編號為CGMCCNo. 3612 ；同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的 異養反硝化菌為桿菌，寬為0. 5 1. 0 μ m，長為1. 0 2. 0 μ m，革蘭氏染色為陰性，無芽孢， 具有單極鞭毛，能運動，生長溫度范圍為15°C 40°C ；同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源 的異養反硝化菌在培養基上生長菌落為淡黃色，圓形，無突起，邊緣規則，菌落直徑為1 2mm ο本發明同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌接觸酶試驗為陽性， 接觸酶陽性，可利用乙酸、乙醇、丙酸、乳酸和葡萄糖作為有機碳源進行生長。本發明同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌的16S rDNA序列長度為1490bp，與其最相近的種屬是假單胞菌屬，相似性為98. 8%。本發明同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌代謝硫化物、硝酸 鹽和乙酸鹽的最快代謝速率分別為2. ImgS2- (mg蛋白質)-l·1，1 · 5mgCH3C00__C (mg蛋白 質)Ι-1，2. Omg NO3--N (mg 蛋白質)-l·1。C27屬于屬于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心中心，北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所，保藏 日期為2010年1月26日，保藏編號為CGMCC No. 3612。本發明同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌，能夠同時處理硫化 物、硝酸鹽和有機碳源，降低了成本、占地面積小、投資低，處理效果好且菌的生長周期短、 耐水力沖擊能力好。
圖1是具體實施方式
二中篩選所得同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反 硝化菌的掃描電鏡照片。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化 菌C27經鑒定屬于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)新種，保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微 生物研究所，保藏日期為2010年1月26日，保藏編號為CGMCC No. 3612 ；同步降解硫化物、 硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌為桿菌，寬為0. 5 1. 0 μ m，長為1. 0 2. 0 μ m，革蘭氏 染色為陰性，無芽孢，具有單極鞭毛，能運動，生長溫度范圍為15°C 40°C ；同步降解硫化 物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌在培養基上生長菌落為淡黃色，圓形，無突起，邊緣 規則，菌落直徑為1 2mm。本發明同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌的16S rDNA序列長度 為1490bp，與其最相近的種屬是假單胞菌屬，相似性為98. 8%。參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統鑒定手冊》對同步降解硫化物、 硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌進行生理生化鑒定同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳 源的異養反硝化菌接觸酶試驗為陽性，接觸酶陽性，可利用乙酸、乙醇、丙酸、乳酸和葡萄糖 作為有機碳源進行生長。本實施方式同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌代謝硫化物、硝 酸鹽和乙酸鹽的最快代謝速率分別為2. lmgS2_(mg蛋白質Γ 1. 5mgCH3C00__C(mg蛋白 質)Ι-1，2. Omg NO3--N (mg 蛋白質)-l·1。
具體實施方式
二本實施方式同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化 菌從同步脫硫反硝化EGSB反應器中的顆粒污泥中篩選得到的；篩選按以下步驟進行一、 采集同步脫硫反硝化EGSB反應器中的顆粒污泥，超聲波破碎后用無菌水稀釋，制得濃度 為IO1 IO9個/mL的菌懸液，然后按1 10 20的體積比將菌懸液接種于液體培養基 中，富集培養48h;二、按1 10 20的體積比將富集培養后的菌懸液接種于固體分離培 養基上，在25 35°C的條件下培養24h，得單菌落；三、挑取單菌落轉接于液體培養基中，在25 35°C的條件下富集培養至培養基出現混濁；四、挑取混濁的菌液接種于固體分離 培養基上，在25 35°C的條件下培養至有單菌落長成，然后挑取單菌落轉接于液體培養基 中；五、重復步驟二、三和四至分離出單菌落，即為同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異 養反硝化菌；其中步驟一、三和四中所用液體培養基相同，每升液體培養基均是由1. 5g的 Na2S · 9Η20、1· 63g 的 Na (CH3COO)、0· Ig 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5g 的 NaHCO3U. Og 的 NH4ClU. 75g 的KN03、1. 8g的KH2PO4U. 2g的K2HPO4UmL的微量元素液和余量的蒸餾水組成，液體培養 基PH值為7. 5 9. 0 ；步驟二和四中所用分離培養基相同，每升分離培養基均是由1. 5g的 Na2S · 9H20、1. 63g 的 Na (CH3COO)、0· Ig 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5g 的 NaHCO3> 1. Og 的 NH4ClU. 75g 的ΚΝ03、1. 8g的ΚΗ2Ρ04、1. 2g的K2HP04、ImL的微量元素液、2g瓊脂和余量的蒸餾水組成，液 體培養基pH值為7. 5 9.0。本實施方式中顆粒污泥是作為分離的菌源。本實施方式微量元素液的成分是每升微量元素液由50g的EDTAUlg的NaOH、 7. 34g 的 CaCl2 · 2Η20、3· 58g 的 FeCl2 · 4Η20、2· 5g 的 MnCl2 · 2Η20、1· 06g 的 ZnCl2,0. 5g 的 CoCl2 · 6H20、0. 5g 的(NH4)6Mo7O24 · 4H20、0. 14g 的 CuCl2 · 2H20 組成，固體培養基另加 2%瓊脂。本實施方式篩選得到的同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌，為 革蘭氏染色陰性，菌株的形態由圖1所示，細胞呈桿狀，無芽孢，具有單極鞭毛，菌體大小為 (0. 5 1. 0 μ m) X (1. 0 2. 0 μ m)。本實施方式篩選得到的同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌，進 行代謝能力的測試，步驟如下1、試驗采用250mL容量的血清瓶，在準備實驗時裝入200mL培養基經過滅菌后待 用。血清瓶口用橡膠塞密封，每瓶培養基在密封前用氦氣吹托10分鐘以去除培養基中上方 的氧氣。2、初始硫化物濃度分別為50mg/L、100mg/L、180mg/L和272mg/L，NO3^-N的濃度為 105. Omg/L, Ac-C 的濃度為 270mg/L。3、培養基采用磷酸鹽作為緩沖液，pH控制在8. O士0. 2，培養溫度為30°C，空氣浴 振蕩器設定在130rpm。4、當菌體被培養48h后，將其轉入到新的培養基中，接種量為10%，在轉入新的培 養基之前，將培養好的菌液在SOOOrpm下離心lOmin，之后再用無菌蒸餾水將菌體潤洗3遍， 除去接種菌液中的背景值，之后再接入新的培養基中進行試驗。5、試驗培養時間為48h，等試驗結束后，分析樣品中的硫化物、硝酸鹽，亞硝酸鹽， 硫酸鹽，硫代硫酸鹽，乙酸鹽，TOC和IC，氨氮濃度。6、空白試驗采用無菌蒸餾水作為接種體作為參照，每組試驗做兩個平行樣，試驗 結果采取兩個平行樣的平均值，每兩組數據的標準方差小于士5%。實驗結果如表1、2和3所示。表 權利要求
1. 一種同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌，其特征在于同步降解硫 化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌C27經鑒定屬于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.) 新種，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京 市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所，保藏日期為2010年1月26日，保藏 編號為CGMCC No. 3612 ；同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌為桿菌，寬為 0. 5 1. 0 μ m，長為1. 0 2. 0 μ m，革蘭氏染色為陰性，無芽孢，具有單極鞭毛，能運動，生長 溫度范圍為15°C 40°C ；同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌在培養基上 生長菌落為淡黃色，圓形，無突起，邊緣規則，菌落直徑為1 2mm。
全文摘要
一種同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌，它涉及一種異養反硝化菌。解決了傳統方法處理含硫含氮的有機廢水存在運行成本高、占地面積大、一次性投資高和處理效果差的問題；而采用自養反硝化菌則存在菌的生長周期長、耐水力沖擊能力差和處理能力低的問題。同步降解硫化物、硝酸鹽和有機碳源的異養反硝化菌屬于假單胞菌屬新種，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是中國科學院微生物研究所，保藏日期為2010年1月26日，保藏編號為CGMCC No.3612；本發明的菌能夠同時處理硫化物、硝酸鹽和有機碳源，降低了成本、占地面積小、投資低，處理效果好且菌的生長周期短、耐水力沖擊能力好。
文檔編號C02F3/34GK101993833SQ20101010680
公開日2011年3月30日 申請日期2010年2月5日 優先權日2010年2月5日
發明者任南琪, 何國領, 劉充, 周旭, 張莉, 徐熙俊, 李篤中, 王愛杰, 許繼飛, 陳川, 高靈芳 申請人:哈爾濱工業大學