專利名稱：：大寶山伯克霍爾德菌及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于微生物
技術領域：
，特別是涉及一種能耐重金屬鎘的新的細菌大寶山伯克霍爾德菌及其應用。
背景技術：
：在珠江三角洲地區，重金屬污染是土壤污染的重要構成，嚴重地威脅著農產品的安全性和人體的健康。土壤的重金屬污染具有隱蔽性或潛伏性、不可逆性和長期性，造成的后果很嚴重，影響對象廣泛，影響區域廣、危害人口多。研發經濟高效的污染土壤修復技術是改善我國環境質量的迫切要求，也是世界科技的研究熱點。重金屬污染土壤的修復包括兩種策略一是改變重金屬在土壤中的存在形態使其固定從而降低其在環境中的遷移性和生物可利用性(stabilization)，二是從土壤中去除重金屬(extraction)。微生物在重金屬污染土壤的修復中具有重要的意義，篩選能夠耐受重金屬的微生物菌種資源成為目前重金屬污染修復的熱點之一。
發明內容本發明的目的是提供一種能夠耐受重金屬鎘的新的菌種——大寶山伯克霍爾德菌。該菌命名為大寶山伯克霍爾德菌(5wttoWm'aJaZ;acw/w"em/sGIMN1.004)，編號為CCTCCNo.M209109。本發明所述的大寶山伯克霍爾德菌是從廣東翁源大寶山礦區的重金屬污染土壤中分離培養獲得。該菌培養條件為-(1)培養基MGY具體配方如下KCIO.01%;MgS(V7H200.025%;(NH4)2S040.2%;K2HP040.025o/o;葡萄糖0.1%;酵母膏0.01%;瓊脂2.0%;ddH201000ml;pH4.0;(2)培養溫度28°C。本發明大寶山伯克霍爾德菌CSw狄o她由fl^ao^a"e"^GIMN1.004)的分子分類地位的確定。該菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示。本發明所述大寶山伯克霍爾德菌具有以下有益效果-本發明所述大寶山伯克霍爾德菌具有耐受重金屬鎘的能力，其耐受能力強，可以耐受22ramol/L即2640mg/L鎘離子濃度，在對重金屬污染的土壤修復中起著重要作用。本發明所述大寶山伯克霍爾德菌(萬",MoWm'arfakzo^uwCTw/sGIMN1.004)已于2009年4月18日保藏于國家知識產權局指定的保藏單位中國典型培養物保藏中心(CCTCC，地址武漢大學)，保藏編號為No.M209109。圖1是本發明大寶山伯克霍爾德菌的透射電子顯微鏡照片(A，3000倍；B:6000倍)；圖2是本發明大寶山伯克霍爾德菌及部分相關菌株依據16SrDNA序列構建的系統發育樹。具體實施例方式以下通過具體實施例來詳細說明本發明。實施例l:本發明大寶山伯克霍爾德菌的分離從廣東大寶山重金屬污染區采集0-30cm土樣，取10g土壤放入裝有90mL無菌水的三角瓶中(帶玻珠)，在180rpm轉速下振蕩30分鐘，靜置10分鐘后取上層液稀釋10倍后取O.lmL均勻涂布在MGY瓊脂培養基板上，翻轉平板置于28"C培養箱中培養2天，即可獲得本發明所述的大寶山伯克霍爾德菌(5"Wt/wWe"arfa&jas/w"eH^GIMNI.004)。所述大寶山伯克霍爾德菌(Swtto她n'adfl^as/w"m^GIMN1.004)已于2009年4月18日保藏于國家知識產權局指定的保藏單位中國典型培養物保藏中心(CCTCC，地址武漢大學)，保藏編號為No.M209109MGY瓊脂培養基KCIO.01%;MgS04.7H200,025%;(NH4)2S040.2%;K2HP040.025%;葡萄糖0.1%;酵母膏0.01%;瓊脂2.0%;ddH201000ml;pH4.0:本發明的大寶山伯克霍爾德菌CBw狄o她riacfa6aos/!OTOT^GIMN1.004)具有下述性質1.形態特征大寶山伯克霍爾德菌在MGY瓊脂培養基平板上能產生紫色顆粒；在加有重金屬的MGY土音養基中的菌落先呈淡粉色后逐漸轉為乳白色，菌落圓形，表面皺縮。在NA培養基中菌落圼藍灰色；菌株GIMN1.004革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀；通過投射電鏡'菌體內可觀察到顆粒狀物質。如圖1所示。.2.生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>通過Bk)log試驗，本發明的大寶山伯克霍爾德氏菌能利用一下碳源AdonitolAmygdalinArbutinD-Cellobiosea-CydodextrinB-Cyclodextrini-ErythritolD-FructoseL-FucoseD-GalacturonicAcidGertibioseGlucose-1-PhosphateGlucose-6-Phosphatea-D-LactoseLactuloseMaltoseMaltotrioseD-MetezitoseD-Melibiose3-Methyl-D-GlucoseB-Methyl-D-GalactosideB-Methyl-D-GlucosideL-RhamnoseStachyoseSucroseTuranoseFormicAcida-HydroxybutyricAcidItaconicAcida-KetobutyricAcida-KetovalericAcidD，L-LacticAcidL丄acticAcidD-LacticAcidMethylEsterD-MalicAcidPropionicAcidPyruvicAcidMethylEsterD-SaccharicAcidSuccinamicAcidSuccinicAcidSuccinicAcidMono-MethylEsterUrocanicAcidL-AlaninamideL-Alanyl-LThreonineL-AsparagineL-GlutamicAcidGlycyl-L-AsparticAcidGlycyl-L-GlutamineGlycyl-L-Proline2ADeoxyAdenosineThymidineUridineUridine-5/-Monophosphatem-Inositola-Methyl陽D-Galactosidea-Methyl-D-GlucosideD-RaffinoseSalicinAceticAcidFumaricAcidL-Alanyl-L-GlutamineL-MethionineN-Acetyl-D-GlucosamineN-Acetyl-B-D-MannosamineD-GluconicAcidD-GlucosaminicAcidPyruvicAcidL-Alanyl-L-HistidineInosinea-D-LactosePalatinoseL-Alanine]L-Serine。3.其他性質甲基萘醌的主要類型為MK-8，細胞壁脂肪酸種類和含量如表1。表1細胞壁脂肪酸種類和含量PercentCommentlComment212:01.77ECLdeviates0.002Reference0.00213:1at12-130.91ECLdeviates-0.00214:04.18ECLdeviates-0.007Reference-0.00813:0iso3OH2.40ECLdeviates0.00715:1isoF2.14ECLdeviates0.010SumInFeature11.34ECLdeviates-0.00413:03OH/15:liH15:1anteisoA0.81ECLdeviates0.00515:0iso0.15ECLdeviates-O扁Reference-0.00215:0—ECLdeviates0.00016:0iso0.14ECLdeviates0,005ReferenceO細16:025.05ECLdeviates0.001Reference0.00017:1anteisow9c0.09ECLdeviates-0.00317:0cyclo5.52ECLdeviates0.00317:00.67ECLdeviates0.001Reference0.00116:120HO.卯ECLdeviates0.00416:020H0.90ECLdeviates0.00416:030H1.76ECLdeviates0.00118:3w6c(6，9，12)0.38ECLdeviates0.005SumInFeature50.58ECLdeviates-0.00218:0ante/18:2w6,9c18:1w9c5.23ECLdeviates0.001SumInFeature817.76ECLdeviates0.00118:1w7c18:010.57ECLdeviates-O扁Reference-0.00219:0iso0.47ECLdeviates-O扁Reference-0.00119:0cyclow8c4.55ECLdeviates0.00118:120H0.73ECLdeviates0.00320:4w6,9，12,15c2.35ECLdeviates0.003SummedFeature11.3415:1isoH/13:03OH13:03OH/15:liHSummedFeature22.7412:0aldehydeunknown10.928SummedFeature35.9316:1w7c/16:lw6c16:1w6c/16:lw7cSummedFeature50.5818:2w6,9c/18:0ante18:0ante/18:2w6,9cSummedFeature817.7618:1w7c18:1w6c實施例2:本發明大寶山伯克霍爾德氏菌16SrDNA的序列測定1、PCR模板DNA的快速制備將細菌劃線接種在NA培養基的平板上，3(TC培養過夜。取單一菌落懸浮于10nl無菌蒸餾水中，于沸水中加熱5min，離心，取上清作為PCR模板DNA.2、16SrRNA基因PCR擴增PCR引物由上海英駿公司合成。PrimerA:5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'PrimerB:5'-AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3'PCR反應體系(總體積50^1):10倍緩沖液5)al,dNTP(2mmo1/1)4[al，PrimerA(10pmo1/1)1^1，PrimerB(10pmo1/1)l(J，Taq酶(2U/1)0.4|al，DNA模板lial,滅菌ddH2037.~1。6PCR擴增條件94。C5min:94。Clmin，58。Clmin,72。C2min,30個循環；72。C7min。3、序列測定PCR產物純化后，送上海英駿公司用3730全自動測序儀測序，測試結果見附圖2。其16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示(登錄號FJ210816.1)，測序結果與GenBank數據庫中的己知序列進行BLAST比較，確定與本發明的菌株親緣關系最近的種屬。從數據庫獲得相關種屬的16SrDNA序列，構建系統發育樹。大寶山伯克霍爾德菌的基因序列與Swv^oWeW^TO//sp.nov.(KACC11589)的同源性為99.0%,但是兩株菌在菌落形態以及生理生化方面都有較大差異。從系統發育樹可以看出，大寶山伯克霍爾德菌與KACC11589和SwrttoWer/asp.A6.2兩株菌關系密切，聚成一類構成一個分支，但又獨立兩株菌。通過DNA-DNA雜交顯示，大寶山伯克霍爾德菌與親緣關系最近的模式菌株KACC11589的DNA-DNA雜交結果為25.0%。本發明的大寶山伯克霍爾德菌與其同源性最高的^/"狄o/c/m'asp.nov.(KACC11589)菌株微生物學特性的比較見表2。表2大寶山伯克霍爾德菌與其同源性最高的Swrtt;/o/c/en'aw//菌株微生物學特性比較特征GIMN1據接觸酶一+厭氧生長—一V-P測定一一D-葡萄糖產酸+一L-阿拉伯糖++D-木糖+NDD-甘露醇++明膠水解+一淀粉一一檸檬酸鹽利用ND一硝酸鹽還原++生長溫度最適30°c最適28°C脂肪酸C16:0C18:lw7c醌型泛醌-8ND注+:陽性；-:陰性；ND:表示沒有測定綜合16SrDNA序列分析和DNA-DNA雜交結果(1987年國際系統細菌學委員會ICSB規定，DNA同源性小于70%或雜交分子的熱解鏈溫度差小于或等于2'C為細菌種的界線，Wayneetal,19S7)，本發明的伯克霍爾德氏菌是一種新的細菌，命名為大寶山伯克霍爾德菌(丑wr^2o/c/er/"Z)"Zaas^"wew^s7^GIMN1.004)。實施例3:本發明所述大寶山伯克霍爾德氏菌耐重金屬能力測定通過測定微生物對重金屬的最大耐受濃度(Maximaltolerantconcentration,MTC)，來確定細菌對某種金屬離子的極限耐受濃度。挑取本發明的大寶山伯克霍爾德氏菌菌株的單菌落，接種至裝有50mL液體NA培養基的三角瓶中，在28'C的搖床上培養(180轉速)至對數生長期，然后將培養好的菌液用接種針劃線接種到一系列包含不同濃度的鎘離子的NA固體平板上，翻轉平板置于28'C培養箱中培養4d后觀察菌落的生長。如果在某個濃度只能細微地觀察到有菌落的生長，并且在略微高于這個濃度的平板上觀察不到菌落的生長，這一濃度便是本發明大寶山伯克霍爾德氏菌菌株對這種金屬的最大耐受濃度MTC。測試結果表明，本發明大寶山伯克霍爾德氏菌菌株耐受鎘的能力達到22隱ol/L即2640mg/L。序列表〈110〉廣東省微生物研究所〈120〉大寶山伯克霍爾德菌及其應用<160>1〈170〉Patentlnversion3.1<210>1〈211〉1437〈212〉醒〈213>^/rA力cJcferz'at/a630s力a"e/357's〈400〉1acacatgcaagtcgaacggcagcacgggggcaaccctggtggcgagtggc50gaacgggtgagtaatacatcgg33CgtgtCCtgg3gtgggggatagcccg100gCg333gCCggattaataccgcatacgctctacggagga33gCggggg3t150cttcggacctcgcgctcaaggggCggCCgEltggcggattagctagttggt200agggtaa鄉cctaccaaggcgacgatccgtagctggtctg3g3gg3Cg3250CC3gCC3CaCtgggactgagacacggcccagactcctacggg3ggC3gC3300gtggggaattttggacaatgggggcaaccctgatccagcaatgccgcgtg350tgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcacttttgtccggaaagaaatcc400tttgggctaatacctcggaggg3tg3Cggtaccggaagaataagcsccgg450ctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttaatc500gg犯tt3Ctgggcgtsaagcgtgcgcaggcggttcgctaagaccgatgtg550aaatccccgggcttaacctgggsactgcattggtg3Ctggcgagctagag600tgtggcagaggggggt卿attccacgtgt3gC3gtg333tgcgtag3ga650tgtggaggaataccgatggcgsaggcagccccctgggctaacactgacgc700tcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtcc750acgccctaaacgatgtcaactagttgttggggattcatttccttagtaac800gt3gct犯cgcgtg33gttgaccgcctgggg3gt3CggtCgcaagattaa850aactc犯agg犯ttgacgggasttcgatgc33cgcg犯a3cctgctg卿ggtgagagtgatggctgtcgtcagctcgtgagcgcaacccttgtctctagCCggtg3C333ccggagg犯ttatgggtagggcttcacacaacccgcg3ggggg3gCt33actctgcaetctcgagtgcatgcatgccgcggtgsatacgtccatgggsgtgggtttt3CCggtcaccacggtaggattcagacccgcac3agcggtggstaccttacctacccttgacatctcga犯gag3accgtcgcatCgtg卿tgttgggtt33gttgctacgaaagggcactctggtggggatgacgtcaagtcgtc3tac3atggtcgg犯C3tcccaga犯accgatcgtaggaagctggaatcgctagtaatcccgggtcttgtacacacc3gaagtggct3gtcta3ccgtgsctggggtgaagtcgg3tgtgg3tt■ggacggaatc950C3ggtgCtgC1000tcccgcaacg1050agagag2ictg1100ctcatggccc1150gsgggttgcc1200tccggattgc1250tcgcggatca1300gcccgtcaca1350C33gg3gg3C1400143權利要求1.大寶山伯克霍爾德菌(BurkholderiadabaoshanensisGIMN1.004)，其特征在于其保藏編號為CCTCCNo.M209109。2.根據權利要求1所述的大寶山伯克霍爾德菌(^/nWwWm"i/aMayfejTKTO:"G1MN1.004),其特征在于該大寶山伯克霍爾德菌Ow狄。/血riacfo&aas/w朋m^GIMN1.004)的16SrDNA序列如SEQIDNO:l所示。3.根據權利要求1或2所述的大寶山伯克霍爾德菌(S"7^。Wen'aifaZ)ao^朋era"GIMN1.004)，其特征在于具有以下的微生物學特征-a)形態特征所述大寶山伯克霍爾德菌在MGY瓊脂培養基平板上能產生紫色顆粒；在加有重金屬的MGY培養基中的菌落先呈淡粉色后逐漸轉為乳白色，菌落圓形，表面皺縮；在NA培養基中菌落呈藍灰色；菌株GIMN1.004革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀；通過投射電鏡，菌體內可觀察到顆粒狀物質；b)生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>C)其他特征所述大寶山伯克霍爾德菌甲基萘醌主要類型為MK-8。4.權利要求1-3任一項所述的大寶山伯克霍爾德菌(5w狄oWeh"(foZ)ao^a"e"^'GIMN1.004)在耐重金屬鎘中的應用。全文摘要本發明公開了一種大寶山伯克霍爾德菌(BurkholderiadabaoshanensisGIMN1.004)，該菌已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期為2009年5月10日，保藏編號為CCTCCNo.M209109。本發明大寶山伯克霍爾德菌具有耐重金屬鎘的能力，其耐重金屬能力強，在對重金屬污染的土壤修復中起著重要作用。文檔編號B09C1/10GK101684452SQ200910040518公開日2010年3月31日申請日期2009年6月24日優先權日2009年6月24日發明者朱紅惠,俊郭,郭建華,黎志坤申請人:廣東省微生物研究所