專利名稱：工業廢水生物脫氮的反硝化假單胞菌sh12及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于環境微生物技術領域，具體涉及一株反硝化假單胞菌SH12的篩選及其在工業廢水中 生物脫氮的用途。
背景技術：
隨著工農業的飛速發展，環境污染問題日益成為人們關注的焦點。在環境問題中最為突出的是水 污染問題。氮和磷是廢水中常見的無機營養物，由工業排放的含氮廢水，農業便用氮肥的沖淋流失以 及城市生活污水的排放引起的氮的富營養化現象，破壞了自然界的生態平衡。特別是工業廢水，如造 紙、皮革、食品加工、化肥、煤炭化工等外排的工業廢水富含氮磷元素很高，是富營養化污染的源頭。 它不僅消耗水中的溶解氧，而且在轉化過程中產生亞硝酸鹽或亞硝酸銨，對人和牲畜的健康產生多方 面的危害。水環境污染和水質富營養化問題的尖銳化迫使越來越多的國家和地區制定嚴格的排放標 準。如何有效處理這些工業廢水，同時減少環境資源的消耗和二次污染，已成為人們關注的問題。
針對氮元素污染，國外從20世紀60年代末開始研究開發廢水的生物脫氮工藝技術，80年代開 始廣泛應用于城市污水和部分工業廢水中營養物質的去除。我國從20世紀80年代也開始了脫氮方面 的研究工作，并取得了一定的進展。近年來新興一種微生物脫氮技術，主要是培養微生物菌群，加入 曝氣池混合液以達到對硝態氮的代謝作用。該法作為一種最有前景的水體脫氮方法，具有成本低、出 水水質好，旦運行過程安全穩定可靠、操作管理方便等優點，得到了世界各國廣泛采用。但是目前國 內市場尚無可有效治理水體硝態氮及亞硝態氮污染的微生物制劑產品，其主要原因是沒能開發出高效 的反硝化菌種，而且在反硝化作用過程中，由于環境中能量物質的不足，經常會導致亞硝態氮和氨氮 的積累，這也給微生物制劑的使用帶來巨大風險。所以處理含氮廢水時有必要開發出高效的反硝化菌 種，能夠耐受環境能量供給的不足，減少有毒中間產物的積累，實踐中迫切需要解決這一技術瓶頸， 這對已開發和未開發的反硝化菌提出了更高的要求。
發明內容
本發明的目的在于克服現有環境富營養污染生物脫氮技術的一些缺陷，分離得到一株高效的反硝 化菌SH12，該菌株可以將水體環境中硝態氮成亞硝態氮還原為氣態的氮氣'同時幾乎沒有亞硝態氮 和氨氮的積累。本發明還涉及其用途。
本發明通過以下技術方案實現
本中諾人分離、篩選到一株高效的反硝化齒'該菌株被命名為SH12'屬假單胞幽(尸seWw"o"必W)。本發明的假單胞菌(尸sewfomo"os5p) SH12于2008年11月25日送交湖北省武漢市武漢大學內 的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏，其保藏號為CCTCCNO: M208238。
假單胞菌SH12的篩選方案先采集中國湖北省武漢市石油化工廠排水車間廢水池底淤泥樣品， 加一定濃度KN03 (見后面的詳細描述，下同)進行富集培養，再對富集培養的樣品進行稀釋并涂布 硝酸鹽固體培養基平板，培養長出硝酸鹽還原菌，挑取不同形態的菌落劃線得單克隆，再用格里斯試 劑法(見后描述)檢測出反硝化菌，再對檢測出的反硝化菌做16S核糖體RNA基因(16S rDNA)、 形態學等相關鑒定工作，最終得到本發明所需要的假單胞菌SH12。
更詳細的技術步驟如下
(1) 樣品采取2005年8月中旬采集湖北省武漢市石油化工廠排水車間廢水池底淤泥樣品。
(2) 樣品富集精確稱取淤泥樣品100g于250ml滅菌三角瓶中，加5ml 2g/L的KN03，輕輕攪勻 置3i:溫箱中培養一周，注意補加無菌水，確保樣品不干。
(3) 硝酸鹽還原菌分離精確稱取KN03富集樣品10 g于裝有90 ml無菌生理鹽水的三角瓶中，置 37X:搖床中振蕩半小時，再依次取1 ml到9 ml無菌生理鹽水中逐步稀釋至l(T3， IO"4， 10—5，分別取 O.lml涂布硝酸鹽固體培養基平板，每個稀釋度涂布3個平板，置37'C溫箱中培養一周，長出的菌株 為硝酸鹽還原菌，將平板置4'C冰箱中待用。硝酸鹽固體培養基配方如下2gKN03， 0.2gK2HPO4, 0.5gMgSO4*7H2O， 20g酒石酸鉀鈉，補加到1.5%滅菌并熔解的瓊脂中，加蒸餾水使其終體積為1 L, 調pH至7.2-7.6，在121'C滅菌20分鐘。
(4) 劃線分離將步驟(3)中得到的硝酸鹽還原菌挑取不同的菌落劃線，確保得到單克隆，劃線用 TSA培養基平板，待菌長出后放4'C冰箱中待用并用甘油冷凍管保存一份于-8(TC冰箱。TSA培養基 配方如下，稱取40gSCD瓊脂(Soybean-CaseinDigest)補加去離子水至1 L, 121'C滅菌15分鐘。
(5) 反硝化菌篩選將步驟(4)中得到的硝酸鹽還原菌單克隆轉接到硝酸鹽液體培養基中，置37'C 溫箱中靜置培養，待菌長濃后篩選產生氣泡較多者，并用格里斯試劑檢測。所述的格里斯試劑檢測方 法如下，各取400 ul格里斯試劑A和B到1.5 ml離心管中，再補加1 ml上述培養的菌液，若培養液 由無色變為粉紅或紅色說明有亞硝酸積累(格里斯試劑與亞硝酸發生反應變紅色)，若培養液仍為無 色說明無亞硝酸，有沒有發生還原則需加入過量Zn粉進一步確認，如仍不變色說明還原反應完全' 硝酸鹽均被還原成氣態氮氣；如培養液由無色變為紅色說明未發生還原。(Zn粉可以將硝酸鹽還原為 亞硝酸鹽，菌液中如存在硝酸鹽，與Zn粉反應后'格里斯試劑與亞硝酸發生反應變色)。硝酸鹽液體 培養基配方同硝酸鹽固體培養基，只是不含瓊脂。
(6) 反硝化菌的分類鑒定利ffl 16SrDNA鑒定，即采W原核生物16S rDNA通用引物27F (正向引 物)5，AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3'和1492R(反向引物)5'GGYTACCTTGTTACGACTT3，做PCR。擴增其16S rDNA并測序，再與國際NCBI GenBankfwww.ncbi.nlm.nih.gov、核苷酸數據庫比對， 其核苷酸同源性為99%，舉定為假單胞菌尸WMrfo附o"as; 二是利用革蘭氏染色分析和生長特性鑒定。 本發明的假單胞菌SH12菌學特征如下
菌體直桿狀，革蘭氏陰性菌，適宜生長溫度30-37。C,適宜pH 7.0-7.5，兼性好氧，在LB、 TSA 和硝酸鹽固體培養基上均為黃色、木規則形、粗糙的菌落。 假單胞菌SH12的保藏
本發明的假單胞菌SH12可以在常用的LB或TSA固體培養基上在28-37。C培養，培養后可在4 'C下作短期保藏。若長期保藏，可使用甘油冷凍管或冷凍干燥管(參見趙斌，何紹江.微生物學實 驗.第一版.科學出版社.2002: 202—205)保藏菌株比較合適。
本發明的積極效果是
本發明分離篩選到的假單胞菌SH12可以在兼性厭氧的條件下將工業廢水中的硝態氮或亞硝態氮 還原成氣態的氮氣， 一般2-3天即可達到國家排放標準，在不外加能量物質的情況下，過程中幾乎沒 有亞硝態氮和氨氮的積累，而且還可以配合新興的微生物固定包埋法，達到對富營養污染環境的有效 凈化。本發明菌株是從工業廢水環境中分離篩選到的，對工業廢水環境具有較強的抗性和適應性，有 望在工業廢水生物脫氮方面發揮重要作用。
圖1:是本發明的技術路線圖。
圖2:是本發明的假單胞菌SH12的革蘭氏染色光學顯微鏡觀察圖，放大倍數為100倍。 圖3:是本發明的假單胞菌SH12的反硝化曲線圖，X軸代表時間(天)，Y軸代表離子態氮的濃 度(mg/L)。
圖4:是本發明的假單胞菌SH12的硝態氮去除效果圖，X軸代表時間(天)，Y軸代表離子態氮 的濃度(mg/L)。
具體實施方式
實施例l:從工業廢水池底淤泥中分離假單胞菌SH12
實驗樣品取自中國湖北省武漢市石油化工廠排水車間廢水池底淤泥，具體操作步驟如下，見圖1: (1 )樣品富集精確稱取淤泥樣品100 g于250 ml滅菌三角瓶中，加5ml 2g/L的KN03,輕輕 攪勻置37'C溫箱中培養一周，注意補加無菌水，確保樣品不干。
(2)硝酸鹽還原茵分離精確稱取KN03富集樣品10 g于裝冇90 ml無菌生理鹽水的二角瓶中， 置37。C搖床中振蕩半小時，再依次取1 ml到9ml無菌生理鹽水中逐步稀釋至10-3, 10-4， 10-5，分 別取O.l ml涂布硝酸鹽向體培養基平板，每個稀釋度涂布3個平板，置37'C溫箱中培養一周，L《出200810236658.7
說明書第4/5頁
的菌株為硝酸鹽還原菌，將平板置4'C冰箱中待用。硝酸鹽固體培養基配方如下2g KN03, 0.2g K2HP04, 0.5gMgS04'7H20， 20g酒石酸鉀鈉，補加到1.5%滅菌并熔解的瓊脂中，使其終體積為1 L，最終pH為7.2-7.6， 12rC滅菌20分鐘。
(3) 劃線分離將步驟(2)中得到的硝酸鹽還原菌挑取不同的菌落劃線，確保得到單克隆，劃 線用TSA培養基平板，待菌長出后放4'C冰箱中待用并用甘油冷凍管保存一份于-8(TC冰箱。TSA培 養基配方如下，稱取40 g SCD瓊脂(Soybean-Casein Digest)補加去離子水至1 L, 121'C滅菌15分 鐘。
(4) 反硝化菌篩選將步驟(3)中得到的硝酸鹽還原菌單克隆轉接到硝酸鹽液體培養基中，置 37'C溫箱中靜置培養，待菌長濃后篩選產生氣泡較多者，并用格里斯試劑檢測。方法如下，各取400 ul格里斯試劑A和B到1.5 ml離心管中，再補加1 ml上述培養的菌液，若培養液由無色變為粉紅或 紅色說明有亞硝酸積累(格里斯試劑與亞硝酸發生反應變紅色)，若培養液仍為無色說明無亞硝酸， 有沒有發生還原則需加入過量Zn粉進一步確認，如仍不變色說明還原反應完全，硝酸鹽均被還原成 氣態氮氣；如培養液由無色變為紅色說明未發生還原。(Zn可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，菌液中如 存在硝酸鹽，與Zn反應后，格里斯試劑與亞硝酸發生反應變色)。硝酸鹽液體培養基配方同硝酸鹽固 體培養基，只是不含瓊脂。
(6)反硝化菌的分類鑒定利用16S rDNA鑒定，即采用原核生物16S rDNA通用引物 27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3')做PCR。擴增其 16SrDNA并測序，再與國際NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸數據庫比對，核苷酸同源性 為99%，鑒定為假單胞菌Pseudomonas; 二是利用革蘭氏染色分析和生長特性鑒定。
菌學特征如下菌體直桿狀，革蘭氏陰性菌，適宜生長溫度30-37'C,適宜pH 7.0-7.5,兼性好氧， 在LB、 TSA和硝酸鹽固體培養基上均為黃色、不規則形、粗糙的菌落(見圖2).
實施例2:假單胞菌SH12的反硝化曲線
挑取假單胞菌SH12單克隆接種到10 ml硝酸鹽液體培養基中，置37'C溫箱中靜置培養48小時， 此時細胞密度OD600為1.00左右，保存在4'C冰箱，作為種子菌液用于接種。以1%的接種量吸取1 ml到100ml新鮮硝酸鹽液體培養基中，間隔12個小時設置一個監測點，每個監測點做3個重復，置 37。C溫箱中靜置培養。每間隔12個小時取出相應監測點的菌液，其中5ml用于測定pH值，5ml用于 測定細胞密度OD600,其余液體于12000rpm離心10min，將上淸通過大孔樹脂吸附柱預處理后'用
紫外-可見光分光光度法測定濾液中硝態氮'亞硝態氮，氨氮的含量。；i體做法如下 一是硝態氮濃
皮(OD220-2XOD275)，用常W的雙波長紫外分光光度法(可參照常用的教科書或技術手冊或生產該儀器廠家的使用說明書操作)測定稀釋后的樣品在波長220和275nm處的吸光值，并用OD220-2 XOD275得到校正吸光值，再根據標準曲線的公式和相應的稀釋度計算硝態氮的濃度。二是亞硝態氮 濃度(OD540),用N- (l-萘基)-乙二胺法測定稀釋后的樣品在波長540111 處的吸光值，再根據標準 曲線的公式和相應的稀釋度計算硝態氮的濃度。三是氨氮濃度(OD420)，用納氏試劑法測定稀釋后 的樣品在波長420nm處的吸光值，'再根據標準曲線的公式和相應的稀釋度計算硝態氮的濃度。繪制 假單胞菌SH12的反硝化曲線(圖3)。
實施例3:假單胞菌SH12在造紙工業廢水中對硝態氮的去除效果
采用湖北省武漢地區造紙廠未處理的廢水(該廢水的采集時間為2007年10月，采集時水溫 為30-40'C, pH為7.2-7.6。其硝態氮的起始濃度為18.94mg/L，而亞硝態氮和氨氮的濃度很低)加入 KN03使硝態氮終濃度為200mg/L，來考察假單胞菌SH12對硝態氮的去除效果。具體做法如下將 采集的造紙廠廢水經過簡單的單層濾紙過濾后,接入預先活化了的反硝化菌(OD600-1.0 ) lml每100ml 廢水，37'C靜置培養。每間隔12個小時取出菌液，對樣品的處理方法和檢測方法同上，培養6-15天 后觀察硝態氮的實際去除效果，同時檢測亞硝態氮和氨氮的積累量(圖4)。
由圖4看出，在不外加能量物質的情況下，加入本發明的假單胞菌SH12后，硝態氮的濃度在最 初的12小時內直線下降，降解率達到85%以上，且全過程中幾乎沒有亞硝態氮和氨氮的積累。本發 明菌株是從工業廢水環境中分離篩選到的，對工業廢水環境具有較強的抗性和適應性，有望在工業廢 水生物脫氮方面發揮重要作用。綜上所述，假單胞菌SH12對工業廢水環境具有較強的抗性和適應性， 在低營養、與其它微生物共存的情況下對硝態氮有很好的去除效果，顯示本發明具有較好的應用前景。
權利要求
1、一株反硝化假單胞菌SH12(Pseudomonassp.)SH12保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC NOM208238。
2、權利要求1所述的反硝化假單胞菌SH12在工業廢水生物脫氮方面的應用。
全文摘要
本發明屬于環境微生物技術領域，具體涉及一株有反硝化作用的假單胞菌SH12選育及其在工業廢水生物脫氮方面的應用。本發明的特征是從石油工業廢水中分離得到一株有反硝化作用的假單胞菌SH12。該菌株可以將富營養化污染環境中的硝酸鹽還原為氮氣，極大地降低了環境中硝態氮的濃度并減少了硝態氮轉化為有毒的亞硝態氮和氨氮的可能性。本發明菌株被命名為假單胞菌SH12(Pseudomonas sp.)SH12，其保藏號為CCTCC NOM208238。初步研究表明，本發明的菌株在工業廢水生物脫氮方面具有較好的應用前景。
文檔編號C02F3/34GK101418273SQ200810236658
公開日2009年4月29日 申請日期2008年12月4日 優先權日2008年12月4日
發明者露 俞, 劉顏軍, 王革嬌 申請人:華中農業大學