專利名稱：一種白腐真菌的產(chǎn)酶方法
技術領域：
本發(fā)明專利涉及一種白腐真菌持續(xù)高效產(chǎn)酶方法，屬于環(huán)境生物技術領域，能夠應用在難降解有機廢水處理及環(huán)境修復中。
背景技術：
包括染料化工廢水在內(nèi)的難降解有機工業(yè)廢水具有色度高、鹽度高、毒性強、污染物含量高且成分復雜、難以降解等特點，是工業(yè)廢水污染治理的重點和難點，這些工業(yè)廢水如不妥善處理而排放到環(huán)境中以后，將造成嚴重的生態(tài)破壞和人類健康問題。
白腐真菌在木質(zhì)素降解酶催化作用下通過自由基鏈式反應對染料廢水中各種有機污染物等具有廣譜、高效的降解功能。白腐真菌分泌的木質(zhì)素降解酶主要有木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)，它們是難降解有機工業(yè)廢水快速、高效處理的功能核心。如何實現(xiàn)白腐真菌木質(zhì)素降解酶的持續(xù)高效產(chǎn)出，是白腐真菌環(huán)境生物技術的工程化應用中急需解決的問題，對建設大規(guī)模酶反應器處理系統(tǒng)、降低工業(yè)廢水處理的運行費用具有重大意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利提供一種白腐真菌持續(xù)高效產(chǎn)酶的方法。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明所述的白腐真菌持續(xù)高效產(chǎn)酶方法包括保證持續(xù)產(chǎn)酶和降低產(chǎn)酶成本的玉米芯填料、孢子液制備和發(fā)酵參數(shù)控制方法。
本發(fā)明的主要內(nèi)容為利用玉米芯作為白腐真菌的生長載體和補充營養(yǎng)基質(zhì)，利用氣升式發(fā)酵設備并優(yōu)化發(fā)酵條件，實現(xiàn)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶的持續(xù)高效產(chǎn)出，同時降低產(chǎn)酶成本。具體包括以下步驟 (1)玉米芯的前處理將玉米芯處理成尺寸為0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方體，在115℃、0.1Mpa下滅菌15分鐘，放至于無菌室內(nèi)冷卻，后于無菌室內(nèi)將其放至裝有限氮培養(yǎng)基的搖瓶中，使每個搖瓶中玉米芯載體的數(shù)量保持在10個/100ml； (2)白腐真菌孢子液配制平板內(nèi)注入無菌水，加入白腐真菌孢子粉，經(jīng)過4層擦鏡紙過濾，濾去菌絲體，得白腐真菌孢子液； (3)將玉米芯載體和白腐真菌孢子液通入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內(nèi)溫度保持在37℃，進氣量為1.0vvm，往發(fā)酵罐內(nèi)加入限氮培養(yǎng)基，實現(xiàn)白腐真菌的產(chǎn)酶方法。
本發(fā)明提供的白腐真菌的產(chǎn)酶方法，其中限氮培養(yǎng)基成分為(L-1)葡萄糖10g，酒石酸銨0.2g，苯甲醇0.54g，KH2PO4 2.56g，MgSO4·7H2O0.71g，維生素B10.001g，微量元素液70mL，10mmol/L醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5；其中微量元素液(L-1)的成分為氨基乙酸0.6g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·H2O 0.19g，CaCl2·2H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.1g，KAl(SO4)2·12H2O 0.01g，HBO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g。
本發(fā)明專利的顯著效果為(1)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶的持續(xù)高效產(chǎn)出；(2)產(chǎn)酶成本下降。
具體實施例方式 下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細說明 (1)玉米芯的前處理、尺寸、投料量和投加時間將玉米芯先用清水洗凈，后處理成尺寸為0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方體，將其在115℃、0.1Mpa下滅菌15分鐘，放至于無菌室內(nèi)讓其冷卻，后于無菌室內(nèi)將其放至裝有限氮培養(yǎng)基的搖瓶中，使每個搖瓶中玉米芯載體的數(shù)量保持在10個/100ml。
(2)白腐真菌孢子液配制平板內(nèi)注入少量無菌水(實驗室無菌水將100mL水加入200mL或250mL三角瓶中，加棉塞，包扎，121℃、0.1Mpa下滅菌30分鐘)，以推棒刮下孢子粉，經(jīng)過4層擦鏡紙過濾，濾去菌絲體。所得濾出液用血球計數(shù)板計數(shù)。
菌體計數(shù)步驟1)取清潔干燥的血球計數(shù)扳，在計數(shù)室上面加蓋玻片。2)取菌液搖勻，用滴管由蓋玻片邊緣滴一小滴，則菌液自行滲入，計數(shù)室不得有氣泡。3)樣品濃度要求每小格有5-10個菌體為宜。4)計數(shù)時，按對角線取左上、左下、右上、右下及中央方格(即80小格)。5)每個樣品重復計數(shù)2-3次，取平均數(shù)，按公式計數(shù)細胞數(shù)/(mL)＝(80小格內(nèi)的細胞數(shù)/80)×400×10000×稀釋倍數(shù)。發(fā)酵參數(shù)的控制通過調(diào)節(jié)溫度控制閥，使發(fā)酵罐內(nèi)溫度保持在37℃；通過調(diào)節(jié)進氣閥門，使進氣量為1.0vvm；通過前期檢測到的酶活變化曲線定期往發(fā)酵罐內(nèi)加入一定的限氮培養(yǎng)基，使黃孢原毛平革菌在發(fā)酵罐內(nèi)能持續(xù)高效的產(chǎn)酶。
蒸汽進入發(fā)酵罐進行加熱和消毒；使發(fā)酵罐溫度維持在115℃，罐壓維持在0.1Mpa，保溫15分鐘；停止蒸汽進入，發(fā)酵罐自然冷卻至38℃；將無菌空氣通入發(fā)酵罐以提供發(fā)酵所需的氧氣；加入限氮培養(yǎng)基15L至發(fā)酵罐中。將白腐真菌孢子和玉米芯填料放入發(fā)酵罐；發(fā)酵過程中需要檢測酶活和總糖含量及其變化規(guī)律；當發(fā)酵液中酶活達到峰值時，可以排出粗酶液，或經(jīng)提純制成酶制劑產(chǎn)品。培養(yǎng)液采用限氮培養(yǎng)基，其成分為(L-1)葡萄糖10g，酒石酸銨0.2g，苯甲醇0.54g，KH2PO4 2.56g，MgSO4·7H2O 0.71g，維生素B1 0.001g，微量元素液70mL，10mmol/L醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5。其中微量元素液(L-1)的成分為氨基乙酸0.6g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·H2O 0.19g，CaCl2·2H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O0.1g，CuSO4·5H2O 0.1g，KAl(SO4)2·12H2O 0.01g，HBO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g。
權利要求
1、一種白腐真菌的產(chǎn)酶方法，以玉米芯作為菌體的生長載體和產(chǎn)酶的補充基質(zhì)，其特征在于
(1)玉米芯的前處理將玉米芯處理成尺寸為0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方體，在115℃、0.1Mpa下滅菌15分鐘，放至于無菌室內(nèi)冷卻，后于無菌室內(nèi)將其放至裝有限氮培養(yǎng)基的搖瓶中，使每個搖瓶中玉米芯載體的數(shù)量保持在10個/100ml；
(2)白腐真菌孢子液配制平板內(nèi)注入無菌水，加入白腐真菌孢子粉，經(jīng)過4層擦鏡紙過濾，濾去菌絲體，得白腐真菌孢子液；
(3)將玉米芯載體和白腐真菌孢子液通入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內(nèi)溫度保持在37℃，進氣量為1.0vvm，往發(fā)酵罐內(nèi)加入限氮培養(yǎng)基，實現(xiàn)白腐真菌的產(chǎn)酶方法。
2.如權利要求1所述的白腐真菌的產(chǎn)酶方法，其特征在于限氮培養(yǎng)基成分為(L-1)葡萄糖10g，酒石酸銨0.2g，苯甲醇0.54g，KH2PO4 2.56g，MgSO4·7H2O 0.71g，維生素B1 0.001g，微量元素液70mL，10mmol/L醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5；其中微量元素液(L-1)的成分為氨基乙酸0.6g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·H2O0.19g，CaCl2·2H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.1g，KAl(SO4)2·12H2O 0.01g，HBO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白腐真菌持續(xù)高效產(chǎn)酶方法，屬于環(huán)境生物技術領域，能夠應用在難降解有機廢水處理及環(huán)境修復中。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明所述的白腐真菌持續(xù)高效產(chǎn)酶方法利用玉米芯作為白腐真菌的生長載體和補充營養(yǎng)基質(zhì)，利用氣升式發(fā)酵設備并優(yōu)化發(fā)酵條件，實現(xiàn)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶的持續(xù)高效產(chǎn)出，同時降低產(chǎn)酶成本。
文檔編號C02F3/00GK101260389SQ200810036038
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月15日 優(yōu)先權日2008年4月15日
發(fā)明者黃民生, 尚 高, 芳 陶 申請人:華東師范大學