專利名稱：水生叢毛單胞菌屬菌株及其在廢水生物脫氮中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域。具體涉及水生叢毛單胞菌屬菌株及其對含氮 工業廢水以及含氮生活污水的短程硝化一反硝化脫氮處理及應用。
二.
背景技術：
隨著工農業生產的發展和人民生活水平的提高，含氮化合物的排放量急劇增 加，已成為環境的主要污染源。水體氮素污染造成的環境危害日益嚴重，最主要 的后果是導致水體富營養化，引起水體藻類過渡繁殖并造成藻類水華暴發。水體 氮素污染還會引起水生生態系統以及對對生物健康方面的有害影響，最直接的影 響是氨對水生生物的毒害，進入水體的氨氮在硝化菌的作用下，可氧化成亞硝酸 鹽和硝酸鹽，消耗大量氧氣，降低水體質量，嚴重危害水生生態系統安全。另外， 亞硝酸鹽和硝酸鹽也是嚴重威脅人類健康的有害物質。
短程硝化一反硝化生物脫氮技術較傳統生物脫氮技術具有減少反應容積，節 省基建投資，減少曝氣量和碳源等優點，已成為生物脫氮領域研究的熱點之一。 目前，亞硝化控制技術主要是通過控制溫度、DO、 pH值、游離氨濃度(FA) 等條件篩選出氨氧化細菌，淘汰亞硝酸鹽氧化細菌，實現亞硝酸鹽積累。但這些 方法同時也存在控制條件苛刻和容易向全程硝化轉化的缺點，從而局限了其應 用。
三.
發明內容
本發明需要解決的問題是為含氮廢水的生物處理提供高效的短程硝化一反 硝化菌制劑，強化含氮廢水的脫氮處理。從自然界中分離出的一株水生叢毛單胞
菌屬菌，能夠以C02為碳源及能量或者以C02和有機物為混合碳源和能量、氨
氮或硝態氮為氮源生長，通過將氨氮轉化為亞硝酸鹽氮，再將亞硝酸鹽氮轉化為 氮氣實現短程硝化一反硝化，對含氮廢水具有高效的脫氮作用。在含氮廢水脫氮 中具有廣泛的應用前景。
本發明的技術解決方案是，本發明提供的水生叢毛單胞菌屬菌株為 Owwwo"cwLNL3，于2008年1月24日保藏于"中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心"，其保藏號CGMCCNo . 2 361。
該水生叢毛單胞菌屬菌株是從鎮江金山湖水體水生植物根區、金山湖水體敞 水區以及金山湖沉積物中采集、分離得到。
具體篩選步驟如下
用預先滅菌的針管(15cmxl.5cm)、底泥采樣器從鎮江金山湖水平面以下 30cm 50cm處的水體中，水生植物根區，金山湖表層底泥等處，分別采集水體、 植物根區以及底泥中的微生物樣，取樣后立即封口，作為菌源進行分離，富集培 養。在無菌條件下，將水樣加到氨氧化細菌富集培養基中(氨氧化細菌培養基成 分為(NH4)2SO4O.2g， K2HPO40.1g， MgSO40.05g， NaCl 0.2g， FeSO40.04g， CaC03 0.5g， H20 lOOml， pH值7.2，其中培養基在121。C濕熱滅菌20min后使用)，置 于搖床上在28。C條件下培養48h。然后再轉到氨氧化細菌的固體培養基中，固 體培養基成分為(NH4)2SO4 0.2g， K2HPO40.1g， MgSO40.05g， NaC10.2g， FeS04 0.04g， CaCO30.5g，瓊脂2g， H20 100ml， pH值7.2，將擴培后的菌種進行平板 劃線初步分離，平板在28i:培養48h。根據平板上長出的單個微生物，選擇其中 長勢較好的進行再次富集培養。最后在固體培養基上反復進行平板劃線分離，分 離出一株對氨氮和亞硝酸鹽氮具有高效降解能力的水生叢毛單胞菌屬菌株。
該水生叢毛單胞菌屬菌株在pH值6.5~8.5培養基介質中培養，適合的生長 溫度為25 35'C ;其細菌學形態特征為革蘭氏陰性菌，尺寸為0.5 1.0x l 4 pm，有鞭毛，好氧或厭氧，接觸酶陽性，氧化酶陽性，以C02為碳源及能量 或者以C02和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源生長。
該菌在固體培養基上28'C培養15 20天，菌落小，呈圓形，邊緣光滑， 表面光滑，菌體呈現無色，極易挑起。
依據該菌株形態學以及分子生物學分析，可鑒定其為水生叢毛單胞菌屬的菌 株。通過擴增該菌株的16SrDNA，得到了長度為1415bP的16S rDNA全序列。 PCR引物采用細菌16S rDNA的通用引物fDl( 5 ，- AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3 ')禾口 rDl ( 5 ，-AAGGAGGTGATCCAGCC - 3 ')。用PCR儀(GeneAmp ， PCR system 9700 )進行擴增反應。PCR反應體系總體積為40pL :其中10xPCR反
應緩沖液4pL，2.5mmol/L的dNTP溶液4^iL， lOpmol/pL的引物fDl和rDl各4pL， Taq酶2個單位，DNA模版40ng。提取的DNA稀釋后取2pL于反應體系中， 94。C預變性5min; 94。C變性lmin， 55"C退火30s， 72°<3延伸lmin， 33個循環； 72'C延伸7min。 1.5%的瓊脂糖凝膠，EB染色后紫外檢測。通過Blast程序進行 同源性比較，表明該菌株與Cowa附o加s叫w^/ca的相似度高達99%以上、可重 復性100% 。
本發明的水生叢毛單胞菌屬菌株既可在富營養培養基中生長，也可在以C02 為碳源及能量或者以C02和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源的 基礎培養基中生長。
該水生叢毛單胞菌屬菌株對氨氮的降解能力極強，經該菌株作用后，氨氮在 可見光區最大吸收峰(412nm)消失，從而降低廢水中的氨氮濃度。
該水生叢毛單胞菌屬菌株通過將亞硝酸鹽氮轉化為氮氣，使得亞硝酸鹽氮在 可見光區最大吸收峰(540nm)消失，從而降低廢水中的亞硝酸鹽氮。
本發明的水生叢毛單胞菌屬菌株，可以用新鮮培養的生長期菌種或是固定化 菌株對氨氮進行降解處理。
本發明的水生叢毛單胞菌屬菌株，可以用新鮮培養的生長期菌種或是固定化 菌株先將氨氮轉化為亞硝酸鹽氮，然后將亞硝酸鹽氮轉化為氮氣，通過短程硝化 一反硝化作用對含氮廢水進行高效降解處理。
本發明所達到的有益效果是本發明提供的水生叢毛單胞菌屬菌株對氨氮和 亞硝酸鹽具有較強的轉化能力，降解速度快，降解率高達90%以上。該菌株可作 為游離生物菌制劑或固定化菌株，投加到現有的廢水處理系統中，對含氮廢水進 行短程硝化一反硝化處理，提高原處理系統的反應效率，降低能耗，縮短反應時 間，增強原處理系統的處理能力和效率，在工業水處理和生活污水處理中具有廣 闊的應用潛力。
四.
圖l.水生叢毛單胞菌屬菌株去除氨氮能力，一A—進水氨氮濃度(mg/L)， 一口 一出水氨氮濃度(mg/L)， 一令一氨氮去除率(100%)
圖2.水生叢毛單胞菌屬菌株去除亞硝酸鹽能力，一A—進水亞硝酸鹽濃度 (mg/L), —口一出水亞硝酸鹽濃度(mg/L) ， 一V—亞硝酸鹽去除率(100%)
圖3水生叢毛單胞菌屬菌株硝化一反硝化去除氨氮能力
一畫一進水氨氮濃度(mg/L)， 一A —出水氨氮濃度(mg/L)， 一A —出水亞硝酸鹽 濃度(mg/L)， 一*一氨氮去除率(100%)
圖4.實驗反應裝置，(1).進水箱;(2).劑量泵;(3).反應器;(4).出水;(5) 空壓機；(6).氣體流量計；(7).循環水泵；(8).循環水箱；(9).加熱元件和溫 度傳感器
圖5不同氨氮負荷情況下氨氮去除率及亞硝化率
一翻一進水氨氮濃度，一A —出水氨氮濃度，一A —亞硝化率，一o—氨氮去 除率
圖6不同亞硝酸鹽進水濃度下亞硝酸鹽去除率
一A —出水硝酸鹽濃度，一令一進水亞硝酸鹽濃度，一B—出水亞硝酸鹽濃度，一
A—進水硝酸鹽濃度，一*一亞硝酸鹽去除率
圖7系統處理含氨氮和葡萄糖廢水能力
一畫一進水氨氮濃度，一V —出水氨氮濃度，一o—出水硝酸鹽濃度，一A —氨 氮去除率，一*一總氮去除率
五.
具體實施例方式
實施例1本發明提供的水生叢毛單胞菌屬菌株的篩選步驟
用預先滅菌的針管(15cmxl.5cm)、底泥采樣器從鎮江金山湖水平面以下 30cm 50cm處的水體中，水生植物根區，金山湖表層底泥等處，分別釆集水體、 植物根區以及底泥中的微生物樣，取樣后立即封口，作為菌源進行分離，富集培
養。在無菌條件下，將水樣加到氨氧化細菌富集培養基中(氨氧化細菌培養基成 分為(NH4)2SO4 0.2g， K2HPO40.1g， MgSO40.05g， NaCl 0.2g， FeSO40.04g， CaC03 0.5g， H20 100ml， pH值7.2，其中培養基在12rC濕熱滅菌20min后使用)，置 于搖床上在28'C條件下培養48h。然后再轉到氨氧化細菌的固體培養基中(固 體培養基成分為(NH4)2SO40.2g， K2HPO40.1g， MgSO40.05g， NaC10.2g， FeS04 0.04g， CaCO30.5g，瓊脂2g， H20 lOOml， pH值7.2)，將擴培后的菌種進行平 板劃線初步分離，平板在28X:培養48h。根據平板上長出的單個菌株，選擇其中 長勢較好的進行再次富集培養。最后在固體培養基上反復進行平板劃線分離，分 離出一株對氨氮和亞硝酸鹽氮具有高效降解能力的水生叢毛單胞菌屬菌株，并將 該菌株于2008年1月24日保藏于"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心"，其保藏號CGMCC No . 2 361 。
該水生叢毛單胞菌屬菌株在pH值6.5~8.5培養基介質中培養，適合的生長 溫度為25~35 °C ;其細菌學形態特征為革蘭氏陰性桿菌，尺寸為0.5 1.0 x 1 4 pm，有鞭毛，好氧或厭氧，接觸酶陽性，氧化酶陽性，以C02為碳源及能量 或者以C02和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源生長。 本發明提供的水生叢毛單胞菌屬菌株的16SrRNA擴增 通過擴增該菌株的16SrDNA，得到了長度為M15bP的16SrDNA全序列。 PCR引物采用細菌16S rDNA的通用引物fDl( 5 '- AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3 ')和rDl ( 5 ，-AAGGAGGTGATCCAGCC - 3 ')。用PCR儀(GeneAmp , PCR system 9700 )進行擴增反應。PCR反應體系總體積為40^L :其中10xPCR反 應緩沖液 L， 2.5mmol/L的dNTP溶液4piL， 1 Opmol/pL的引物fDl和rDl各4pL， Taq酶2個單位，DNA模版40ng。提取的DNA稀釋后取2pL于反應體系中， 94。C預變性5min; 94"C變性lmin， 55。C退火30s， 72。C延伸lmin， 33個循環; 72'C延伸7min。 1.5%的瓊脂糖凝膠，EB染色后紫外檢測。通過Blast程序進行 同源性比較，表明該菌株與Comamo"似agwarica的相似度高達99%以上、可重 復性100%。
制備水生叢毛單胞菌屬菌株的細胞液體培養物-
挑取固體培養基上的水生叢毛單胞菌屬菌株單菌落于裝有滅菌的液體培養 基中，于28°C, pH 7.5 , 80r/min，進行好氧培養48h，取培養好的菌液lml接種
在裝有100 ml含氨氮(100 mg/L)的基礎培養基的250 ml錐形瓶中，28。C, pH 7.5 , 80r/min，進行好氧培養48 h，即為水生叢毛單胞菌屬菌株的細胞液體培養 物。
制備固定化水生叢毛單胞菌-
采用親水性玻璃態單體甲基丙烯酸卩羥乙酯(HEMA)、丙烯酸羥乙酯(HEA) 與蒸餾水按照一定的體積比混合均勻，在-63'C -78'C溫度條件下，用劑量為 lxl03Gy lxl06Gy的高能射線輻照形成生物相容性固定化共聚物多孔載體，加 入經活化培養進入對數生長期的水生叢毛單胞菌屬菌液，使之吸附于固定化載體 表面并通過增殖進入多孔載體內部實現固定化。
實施例2
本發明在富營養培養基中對氨氮降解研究的應用，其步驟如下 [1]在250ml的錐形瓶中加入50ml富營養培養基(氨氮濃度為50mg/L)。 [2]將實施例1制得的水生叢毛單胞菌屬菌株的細胞液體培養物加入上述 [l]的錐形瓶中，28°C, 80r/min ，好氧培養。每隔2小時取樣測定。圖1為水生 叢毛單胞菌屬菌株在富集培養基中降解氨氮情況。從圖1可以看出，菌體少量的 生長足以使氨氮降解，接種6小時后，氨氮的降解率接近IOO %。 實施例3
本發明在以葡萄糖和C02為混合碳源，亞硝酸鹽為氮源培養基中對亞硝酸 鹽降解研究的應用，其步驟如下將實施例1中的培養基換為以葡萄糖和C02為混合碳源，亞硝酸鹽為氮 源的基礎培養基(亞硝酸鹽濃度為50mg/L)將實施例1制得的水生叢毛單胞菌屬菌株株的細胞液體培養物加入上 述[l]的錐形瓶中，28°C, 80r/min ,厭氧培養。每隔2小時取樣測定。圖2為水 生叢毛單胞菌屬菌株在富集培養基中降解亞硝酸鹽情況。從圖2可以看出，菌體 少量的生長足以使亞硝酸鹽降解，接種12小時后，亞硝酸鹽的降解率接近100 %。
實施例4
本發明在以葡萄糖和C02為混合碳源，氨氮為氮源培養基中對氨氮降解研 究的應用，其步驟如下將實施例1中的培養基換為以葡萄糖和C02為混合碳源，氨氮為氮源的 基礎培養基(氨氮濃度為50mg/L)將實施例1制得的水生叢毛單胞菌屬菌株的細胞液體培養物加入上述 [l]的錐形瓶中，28°C， 80r/min ,好氧一厭氧培養。每隔2小時取樣測定。圖3 為水生叢毛單胞菌屬菌株在富集培養基中降解氨氮情況。從圖3可以看出，菌體 少量的生長足以使氨氮降解，接種12小時后，出水中的氨氮濃度很低，亞硝酸 鹽濃度也低，系統脫氮率達到65.8%,實現短程硝化一反硝化，達到脫氮的目的。
實施例5
本發明在實驗室模擬流化床反應器中對含氨氮廢水降解的應用，其步驟如
下圖4為實驗室模擬的流化床反應器。將實施例1制備的水生叢毛單胞菌 屬菌株的固定化菌株投入反應器中，反應器中載體的填充率為10%。分別將含氨氮濃度為100mg/L、 150mg/L和200mg/L的廢水加入反應器 中，在3(TC，曝氣量為250ml/min條件下進行反應，24個小時后取樣測定。圖 5為水生叢毛單胞菌屬菌株的固定化菌株在模擬流化床系統中處理含氨氮廢水 的情況。從曲線可以看出，進行24個小時反應后，出水中的氨氮濃度很低，氨 氮去除率接近100%,降解的氨氮幾乎轉化為亞硝酸鹽氮，亞硝化率維持在90%以 上，短程硝化效果明顯。
實施例6
本發明在實驗室模擬流化床反應器中對含亞硝酸鹽氮廢水降解的應用，其步 驟如下圖4為實驗室模擬的流化床反應器。將實施例1制備的水生叢毛單胞菌 屬菌株的固定化菌株投入反應器中，反應器中載體的填充率為10%。分別將含亞硝酸鹽濃度為30mg/L、 60mg/L和90mg/L和一定量葡萄糖 (TOC=100mg/L)的廢水加入反應器中，在3(TC，曝氣量為60ml/min (保證一
定的混合作用)條件下進行反應，24個小時后取樣測定。圖6為水生叢毛單胞 菌屬菌株的固定化菌株在模擬流化床系統中處理含亞硝酸鹽氮廢水的情況。從曲 線可以看出，進行24個小時反應后，出水中的亞硝酸鹽氮濃度很低，亞硝酸鹽 氮去除率接近100%,實現了短程反硝化，達到脫氮的目的。
實施例7
本發明在實驗室模擬流化床反應器中對含氨氮和葡萄糖廢水降解的應用，其
步驟如下圖4為實驗室模擬的流化床反應器。將實施例1制備的水生叢毛單胞菌 屬菌株的固定化菌株投入反應器中，反應器中載體的填充率為10%。將含氨氮濃度為100mg/L和一定量葡萄糖(TOC=100mg/L)的廢水加入 反應器中，在30'C，曝氣量為250ml/min條件下進行反應，24個小時后取樣測 定。圖7為水生叢毛單胞菌屬菌株的固定化菌株在模擬流化床系統中處理含氨氮 和葡萄糖廢水的情況。從曲線可以看出，進行24個小時反應后，出水中的氨氮 濃度很低，亞硝酸鹽濃度也低，系統脫氮率達到75.2%，實現了短程硝化一反硝 化，達到脫氮的目的。
權利要求
1.一種水生叢毛單胞菌屬菌株，其特征在于水生叢毛單胞菌屬菌株為Comamonas aquatica LNL3，其細菌學形態特征為革蘭氏陰性桿菌，尺寸為0.5～1.0×1～4μm，有鞭毛，好氧或厭氧，接觸酶陽性，氧化酶陽性，以CO2為碳源及能量或者以CO2和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源的基礎培養基中生長，該菌株于2008年1月24日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC No.2361。
2. 根據權利要求1所述的水生叢毛單胞菌屬菌株篩選方法，其特征在于該 菌株是從鎮江金山湖水體的水生植物根區、金山湖水體敞水區以及金山湖沉積物 中采集、分離得到；該菌株在pH值6.5~8.5培養基介質中培養，適合的生長溫 度為25~35 °C。
3. 根據權利要求1所述的水生叢毛單胞菌屬菌株在廢水生物脫氮中的應用。
4. 根據權利要求3所述的水生叢毛單胞菌屬菌株在廢水生物脫氮的短程硝 化一反硝化中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域。具體涉及水生叢毛單胞菌菌株及其在廢水生物脫氮過程中短程硝化-反硝化脫氮中的應用。本發明涉及的水生叢毛菌菌株，為Comamonas aquatica LNL<sub>3</sub>，于2008年1月24日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC No.2361；是從鎮江金山湖水體水生植物根區、金山湖水體敞水區以及金山湖沉積物中采集、分離得到；該菌株可以以CO<sub>2</sub>為碳源及能量或者以CO<sub>2</sub>和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源的基礎培養基中生長。其菌液、休眠細胞以及固定化菌株均可以將氨氮分解為亞硝酸鹽氮，同時可以將氨氮轉化為氮氣，既能夠作為脫氮微生物將氨氮轉化為亞硝酸鹽氮，又能夠將氨氮轉化為氮氣，實現短程硝化-反硝化。該菌株的益處是具有對含氮廢水的硝化-反硝化作用，對氨氮的降解速度快，適用于含氮工業廢水、含氮生活污水的處理。
文檔編號C02F3/34GK101348772SQ200810020649
公開日2009年1月21日 申請日期2008年2月19日 優先權日2008年2月19日
發明者呂溢修, 張曉姣, 李正魁, 李芳捷, 楊竹攸, 石魯娜, 賴鼎東 申請人:南京大學