專利名稱：固定化菌體的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及重金屬廢水生物修復技術，特別是一種固定化菌體的制備方法及其應用。
二
背景技術：
傳統的處理重金屬的物理化學方法很多，如化學沉淀法、離子交換法、電解法、反滲透法、萃取法、活性炭吸附法、膜分離法等。它們各有優點，但不同程度地存在著投資大、能耗高、操作困難、易產生二次污染等缺點，特別是在處理低含量重金屬污染時，其操作費用和原材料成本相對過高。隨著生物技術的發展，20世紀80年代以來重金屬廢水的微生物去除研究受到越來越多的關注。由于生物吸附劑具有制作簡單、可利用廉價的營養基質進行大量的生產、吸附量大、處理費用低、對環境友好、效率高等優點，越來越受到人們的廣泛關注。其中選擇高效的生物吸附劑是微生物修復重金屬廢水的關鍵。
然而吸附了大量金屬的游離菌體很難從水溶液中分離出來，在實際應用中受到限制。而固定化菌體則將微生物固定在固體多孔狀結構的材料上，使之具有適合在反應器中使用的一定直徑、機械強度和必要的孔隙率，像離子交換樹脂和活性炭一樣可以重復使用。生物固定化材料在吸附和解吸的過程中重復使用可以極大的提高生物技術應用的經濟價值。常用的固定化技術主要有吸附、包埋、交聯等；固定劑有硅膠、戊二醛、明膠等。通常這類材料固定化后會使菌株的活性降低20～30％，且固定化成本高、工藝復雜。
三
發明內容
本發明的目的在于提供一種能高效吸附廢水中重金屬的固定化菌體的制備方法。
實現本發明目的的技術解決方案一種固定化菌體的制備方法，包括以下步驟1.1絲瓜海綿體的制備，即成熟絲瓜曬干后除去外皮得到絲瓜海綿體纖維，然后將絲瓜海綿體纖維剪成圓盤，放入沸水中煮后，洗凈、在蒸餾水中浸泡，將充分浸泡的海綿體圓盤干燥，并保存在干燥器中；1.2孢子的制備，將木霉接種到斜面培養基上，在20～40℃培養3～5天，形成孢子備用；1.3菌懸液的制備，將孢子用塵理鹽水配制成菌懸液；1.4菌體的固定化，將菌懸液接種于錐形瓶中，錐形瓶中裝有利于菌絲體萌發的培養基和1.1步驟制備的海綿體圓盤，20～30℃下100～200rpm培養2～3天得到固定化菌體。
本發明固定化菌體的制備方法中，將木霉接種到斜面培養基后，在28～30℃下培養。
本發明固定化菌體的制備方法中，木霉為綠色木霉。
本發明固定化菌體的制備方法中，斜面培養基為馬鈴薯培養基。
本發明固定化菌體的制備方法中，利于菌絲體萌發的培養基為葡萄糖5～15g，Na2HPO40.5～5g，KaH2PO40.1～2g，MgSO4·7H2O0.1～0.5g，CaCl2·2H2O0.1～0.5g，加水至1000mL，pH自然，滅菌。
按上述方法制備的固定化菌體的應用，固定化菌體去除廢水中的重金屬。
本發明與現有技術相比，其顯著優點是(1)絲瓜海綿體孔隙率高、表面積大，菌絲體固定其上不產生致密纏繞，因而體系不存在擴散的限制，不會造成固定化后菌體吸附重金屬離子活性的大幅度下降，因此能高效吸附廢水中的重金屬；(2)絲瓜海綿體是一種天然多孔狀纖維，不含有害物質，不會對水體造成二次污染；(3)選用絲瓜海綿體作為菌體固定化載體，原料來源豐富，容易加工，價格低廉，固定化工藝簡單。
四
附圖是本發明去除廢水中重金屬的固定化菌體的制備方法的流程圖。
五
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明作進一步詳細描述。
結合附圖，本發明固定化菌體的制備方法，包括以下步驟(1)絲瓜海綿體制備將成熟絲瓜曬干后除去外皮部分，即可得到絲瓜海綿體。然后將海綿體纖維剪成直徑大約為2.5cm的圓盤，2～3mm厚，在沸水中煮30min，自來水沖干凈后，在蒸餾水中浸泡24h，換蒸餾水3～4次。將充分浸泡的海綿體圓盤于70℃烘干，并保存于干燥器中。
(2)斜面培養將綠色木霉接種到斜面培養基上，在28～30℃培養3～5天，待孢子形成備用。其中，斜面培養基為馬鈴薯培養基，用常規方法制備馬鈴薯培養基，即馬鈴薯去皮，切成小塊，煮沸30min，然后用紗布過濾，在上清液中加20g蔗糖，加15g瓊脂，加水至1000mL，pH自然，121℃下滅菌30min。
(3)菌懸液的制備將孢子用生理鹽水(蒸餾水或去離子水)配成孢子濃度約為106個/mL的菌懸液；(4)菌體的固定化菌懸液(5mL)接種于250mL的錐形瓶，錐形瓶中裝有100mL利于菌絲體萌發的培養基和(1)步驟制備的4個預稱重的海綿體圓盤。其中海綿體圓盤作為固定化的載體。接種后30℃，150rpm培養72h得到固定化菌體。收獲菌體或圓盤后用蒸餾水洗滌兩次，4℃保藏。將菌絲體生長后的海綿體圓盤于70℃烘干8h后稱重，減去絲瓜海綿體圓盤的重量，即為固定化的菌體干重。其中，利于菌絲體萌發的培養基的制備(單位g/L)，即葡萄糖10，Na2HPO40.25，KaH2PO40.2，MgSO4·7H2O0.5，CaCl2·2H2O0.1，加水至1000mL，pH自然，115℃滅菌30min。
將制備的上述固定化菌體用于重金屬吸附取一個固定化圓盤接種于250mL的錐形瓶(含100mL生長培養基，培養基組成同上)中，添加重金屬離子Pb2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+使濃度達100mg/L，30℃、150rpm，振蕩吸附6h，去除廢水中的重金屬；測定吸附后重金屬離子濃度，得到吸附量分別為743、187、358、134mg/g。連續流反應器處理分別含100mg/L的Pb2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+廢水反應器外徑30mm，內徑26mm，填料高度為60mm，有效容積31.83cm3，孔隙體積13.26cm3。其中，待處理廢水為人工配制廢水，水質特征如下(g/L)KH2PO41.0，Na2HPO40.50，MgSO4·7H2O0.01，CaCl20.002，Na2SO40.01，NaNO30.01，pH5.5～6.0。進水方式為升流式，流速約為3.2ml/h，運行1天后采樣。運行溫度為25℃左右。反應器運行16天，每隔24h采水樣5mL，測定Pb2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+濃度。
權利要求
1.一種固定化菌體的制備方法，其特征在于包括以下步驟1.1絲瓜海綿體的制備，即成熟絲瓜曬干后除去外皮得到絲瓜海綿體纖維，然后將絲瓜海綿體纖維剪成圓盤，放入沸水中煮后，洗凈、在蒸餾水中浸泡，將充分浸泡的海綿體圓盤干燥，并保存在干燥器中；1.2孢子的制備，將木霉接種到斜面培養基上，在20～40℃培養3～5天，形成孢子備用；1.3菌懸液的制備，將孢子用生理鹽水配制成菌懸液；1.4菌體的固定化，將菌懸液接種于錐形瓶中，錐形瓶中裝有利于菌絲體萌發的培養基和1.1步驟制備的海綿體圓盤，20～30℃下100～200rpm培養2～3天得到固定化菌體。
2.根據權利要求1所述的固定化菌體的制備方法，其特征在于將木霉接種到斜面培養基后，在28～30℃下培養。
3.根據權利要求1或2所述的固定化菌體的制備方法，其特征在于木霉為綠色木霉。
4.根據權利要求1所述的固定化菌體的制備方法，其特征在于斜面培養基為馬鈴薯培養基。
5.根據權利要求1所述的固定化菌體的制備方法，其特征在于利于菌絲體萌發的培養基為葡萄糖5～15g，Na2HPO40.5～5g，KaH2PO40.1～2g，MgSO4·7H2O0.1～0.5g，CaCl2·2H2O0.1～0.5g，加水至1000mL，pH自然，滅菌。
6.一種固定化菌體的應用，其特征在于固定化菌體去除廢水中的重金屬。
7.根據權利要求6所述的固定化菌體的應用，其特征在于固定化菌體吸附廢水中的重金屬離子pb2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+。
全文摘要
本發明公開了一種固定化菌體的制備方法。其步驟為絲瓜海綿體的制備，即成熟絲瓜曬干后除去外皮得到絲瓜海綿體纖維，然后將其剪成圓盤，放入沸水中煮后，洗凈、在蒸餾水中浸泡，將充分浸泡的海綿體圓盤干燥；孢子的制備，將木霉接種到斜面培養基上，在20～40℃培養3～5天，形成孢子備用；菌懸液的制備，將孢子用生理鹽水配制成菌懸液；菌體的固定化，將菌懸液接種于裝有利于菌絲體萌發的培養基和海綿體圓盤的錐形瓶中，20～30℃下100～200rpm培養2～3天得到固定化菌體。本發明的優點為絲瓜海綿體孔隙率高，菌絲體固定其上不產生致密纏繞，能高效吸附廢水中重金屬；絲瓜海綿體是一種天然多孔狀纖維，不含有害物質，不會對水體造成二次污染。
文檔編號C02F1/62GK1978639SQ20051012278
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月2日 優先權日2005年12月2日
發明者楊樹林, 沈薇, 寧長發, 高力虎, 孟廣榮, 李新柱, 梁廣, 陸曉, 曾亮亮 申請人:南京理工大學