專利名稱：“植物－微生物”聯合定向修復五氯酚污染土壤的方法
技術領域：
本發明屬于濱海受損土壤改造方法，特別涉及一種“植物一微生物”聯合定向修復五氯酚污染土壤的方法。
背景技術：
天津渤海沿岸地區大部分為高鹽堿度的灘涂及濕地，近年來，受工業污染加劇的影響，主要由城市生活污水和工業污水匯入的南排污河對渤海沿岸土壤的污染也日趨嚴重。再加上周邊地區農田中大量農藥的不合理使用，使得土壤中所含的各種毒害性很強的有機物濃度和種類也大大增加。這其中，氯酚類化合物，尤其是五氯酚(簡稱PCP)在土壤中的積累成為破壞其原有生態環境的最主要因素。土壤中PCP主要來源于木材防腐劑、農藥、除草劑等，它作為一種應用廣泛、污染嚴重的含氯有機化合物，其毒性很強且化學性質穩定難降解，易在土壤中殘留從而造成嚴重的污染，因此許多國家都將其列入優先控制的污染物黑名單中。基于上述原因，對PCP污染土壤的生物修復一直都是近年來科學家研究的熱點，Saber和Crawford(1985)等從被PCP污染的土壤中篩選出屬于黃桿菌屬的菌體，用于降解氯酚類有較好的效果。還有研究者報道了不同的好氧菌純培養時其對PCP的降解作用(Edgehill，1983.Kiyohara，1992)。Miethling和Karlson(1996)的研究表明，未接種外來降解菌的污染土壤，PCP完全礦化需7個月，當接種兩種濃度為108個/g的降解菌時，1個月內其CO2的釋放量即可達到未接種土壤7個月的水平。
與上述研究成果不同，本發明中的土壤環境由于處于濱海地區，其含鹽量很高，單純的PCP降解菌很難存活，或者即使存活也會因為對環境的不適應而難以發揮作用，從而無法起到修復PCP污染土壤的作用。因此，我們有必要重新篩選一種抗鹽能力強，并且和環境土著植物聯合發揮作用的PCP降解菌，來構建一種全新的生態修復方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種“植物—微生物”聯合定向修復五氯酚污染土壤的方法。用于高含鹽環境地區，特別是濱海地區的，采用土著植物和篩選的PCP特異降解菌聯合修復受損土壤，以達到經濟效益、環境效益和社會效益的有機統一。
本發明具體方案為對于濱海地區被氯酚類有機污染物污染的大面積鹽堿土壤，本發明采用耐鹽堿的土著植物—堿蓬作為宿主植物，配合特異性降解五氯酚等氯酚類物質的優勢菌株，聯合作用于受污土壤，修復受損土壤。
一種“植物—微生物”聯合定向修復五氯酚污染土壤的方法，其特征在于(一)篩選特異性污染物降解菌Psendomonas sp.和Bacillus sp.
針對受損土壤的污染物為氯酚類物質中的五氯酚PCP，篩選降解菌的過程包括采樣、富集培養、馴化、分離；(1)富集培養取海沿岸受PCP污染嚴重地區的泥樣，接入PCP富集培養基中，富集培養；待培養基渾濁后，得到活化污泥原液；(2)馴化將活化的污泥原液接入PCP富集培養基中振蕩培養，在檢測到PCP降解后，加入無菌玻璃石棉，繼續培養一段時間后，靜置，棄去上清液；在下層污泥中再加入含PCP的富集培養基，同上培養，直至PCP降解；這樣反復馴化下層污泥，并逐漸增加培養基中PCP的含量，使得污泥中的PCP降解菌不斷被富集；(3)分離在以PCP為唯一碳源，含有溴百里酚藍的固體培養基上篩選周邊變成黃色的菌落，轉板劃線分離，再回接到添加了溴百里酚藍的PCP分離培養基中，經培養后，挑選培養基由藍色變成黃色，并且較為渾濁的培養樣品涂布于含高濃度PCP的平皿中；重復以上過程，獲得高效降解PCP的菌株；最終篩選出兩株高效PCP降解菌P5、P9，其P5和P9名稱為Psendomonas sp.和Bacillus sp.；在篩選的起始階段培養基中添加的PCP濃度較低，為50mg/l，馴化階段逐漸增加PCP濃度，直至500mg/l，并且為了適應高含鹽環境，在篩選的無機鹽培養基中添加1％的氯化鈉；在平板分離過程中，選取長勢較快并且經回試仍有較強PCP降解能力的菌種；以上其中無機鹽培養基K2HPO41.73g； KH2PO40.68g；NH4NO31.0g； CaCl2·2H2O 0.02g；MnSO4·H2O 0.03g； MgSO4·7H2O 0.1g；FeSO40.03g； NaCl 10g；水 1000ml；PH 7.4富集培養基在無機鹽培養基中添加一定濃度的PCP作碳源，另加入0.5g/l的酵母粉作生長因子和補充碳源；分離培養基在無機鹽培養基中添加一定濃度的PCP作唯一碳源；(二)堿蓬——特異性PCP降解菌聯合修復污染土壤將PCP高效降解菌的混合菌液與濱海高含鹽含PCP土壤混合，并在其混合土壤上栽種堿蓬灰綠堿蓬suaeda.glanca bunge和鹽地堿蓬S.salsa(L.)Pall，即可達到修復污染土壤。
堿蓬種植時，將其種子經PCP降解菌菌液浸泡。
本發明的特點是本方法適用于含鹽量很高的PCP污染土壤的修復。PCP降解菌抗鹽能力強，并且和環境土著植物堿蓬聯合發揮作用共同修復的污染土壤，是一種全新的生態修復方法。它適用于一切含鹽量很高的PCP污染土壤的修復，尤其適用于渤海濱海地區含鹽量很高的PCP污染土壤的修復。
有堿蓬種植并且其種子經PCP降解菌菌液浸泡，土壤中混有菌液的PCP降解率最高，低濃度PCP(5mg/kg)的降解率可達94.73％。接種特異性PCP降解菌對土壤修復作用的功效要大于單純種植堿蓬，將兩者結合，則可以達到最佳的PCP降解效果。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明進行進一步詳細的說明。應該理解的是，所述的實施例僅僅是用于說明而不是限制本發明。
1.PCP降解菌Psendomonas sp.和Bacillus sp.的分離選取適當泥樣接種到PCP富集培養基中培養，初始PCP濃度為50mg/l，30℃，180rpm搖床培養24hr。本實驗中所使用的基礎無機鹽培養基中NaCl的含量為1％，這是為了適應沿海土壤的高含鹽而有針對性的篩選耐鹽的PCP降解菌而設置的。待培養基渾濁后，得到活化污泥原液。將活化污泥原液轉接到500ml富集培養基中進行馴化。污泥經不斷增加PCP濃度的培養基的多次馴化，其降解PCP的時間大大縮短。在馴化至PCP含量為400～500mg/l時，48hr內可將PCP降解；但當PCP含量在550mg/l左右時，則降解不穩定，易出現紅色物質，此時降解率雖達到90％左右，但不穩定，易喪失降解特性；當PCP含量超過600mg/l時，菌體大量死亡，PCP幾乎沒有降解。因此，本實驗馴化污泥中的PCP降解菌能穩定降解的PCP最大濃度為500mg/l。
從馴化污泥液中經反復分離篩選，分離到2株能高效降解PCP的菌株，分別命名為P5和P9。其中P5菌落圓形，白色，表面隆起，邊緣整齊，濕潤光滑；鏡檢為短桿狀，大小0.6～0.8μm×0.9～1.2μm，無芽孢，能運動，一端生單鞭毛；革蘭氏染色陰性，好氧，氧化酶、接觸酶陽性；糖發酵、VP反應、甲基紅反應、吲哚實驗、水解明膠、硝酸鹽還原為陰性，經鑒定P5為Psendomonas sp.。P9菌落白色，邊緣不整齊呈鋸齒狀，表面干燥；鏡檢為桿狀，大小0.4～0.6μm×2.4～3.0μm，有芽孢，運動能力強，周生鞭毛；革蘭氏染色陽性，好氧，接觸酶陽性，能水解明膠、淀粉；能還原硝酸鹽和亞硝酸鹽；VP反應、甲基紅反應、吲哚實驗陰性。經鑒定P9為Bacillus sp.。
2.PCP降解菌的降解特性使用的培養基為以PCP為唯一碳源的分離培養基(其中NaCl濃度為1％)，培養條件為30℃，180rpm搖床培養48hr，PCP使用濃度為500mg/l和200mg/l。受試菌種分別為P5、P9混合菌、P5單菌、P9單菌。待培養結束后，采用藏紅T分光光度法測定培養基上清液中的PCP含量，具體實驗結果為當PCP濃度為200mg/l時，混合菌、P5、P9在48hr內對PCP的降解率分別為98.87％、97.74％、96.96％；當PCP濃度為500mg/l時，它們相應的降解率分別為95.05％、92.56％、90.27％。可見，低濃度的PCP比高濃度PCP有更高的降解率，并且混合菌比單菌的降解效率高。混合菌種在24hr左右即可將PCP降解到最低水平，無論是降解速度還是最終的降解率均優于單菌。
為了進一步考察混合菌對PCP降解的最佳條件，我們還分別在不同的鹽度、溫度、PH值的條件下研究了其對PCP的降解性能。結果表明，PCP降解混合菌對高鹽濃度(5％)的耐受性很差，幾乎沒有使PCP得到降解。菌體在5％的鹽濃度下大量死亡，顯示出其對高鹽環境的敏感。對于2％的中等鹽濃度該混合菌尚能表現出一定的耐受性，但與篩選濃度(1％)相比，降解率還是下降了很多。混合菌株降解PCP的最佳條件為溫度30～35℃，PH7.0～8.0，180rpm搖床培養48hr。
3.栽培試驗先將土壤在121℃的高溫下滅菌40min，以殺死土壤中的真菌菌絲和孢子。試驗設計3個PCP濃度處理，其濃度分別為5、50、200mg/kg(分別表示低、中、高3種處理濃度)。加入PCP的方法為先用95％的乙醇溶解所需的PCP量，加入到少部分試驗土壤中，待乙醇完全揮發后(1～2d)，再逐級擴大地將其拌入全部試驗土壤中，充分攪勻，放置2d后裝盆，每盆裝土200g。先向盆中裝150g供試土壤，在土壤表面均勻灑入10％的篩選出的PCP降解菌P5、P9混合菌液(每種菌液各10ml)，然后再在上面裝50g土壤(所裝土壤應較疏松，保證通氧)。對于菌液空白對照則按相同的方法接入相同劑量的滅菌菌液。裝盆后稱重加水使土壤含水量為田間持水量的70％，過夜后在盆中播種經表面消毒及包覆菌液處理的堿蓬種子15粒(不接PCP降解菌的對照樣所用的種子表面只消毒，不包覆菌液)，出苗后定苗為10株；盆栽試驗在控溫生長室中進行，土壤水分維持田間持水量的70％，日間溫度25℃，夜間20℃，光照強度為4000～7000lx，生長過程中在30、60、90、120d時分別取樣，同一PCP濃度處理每次取12盆，分別為接菌種植物、接菌不種植物、不接菌種植物、不接菌不種植物四種情況，每種情況3個平行樣。
4.土壤中可提取態PCP濃度的測定土壤取樣后經風干、去除植物根并過20目篩后待分析。每份待測土樣稱取10g，然后分別加入蒸餾水10ml，12M的H2SO41ml，振蕩混合均勻，室溫放置，使土樣中的PCP充分被溶出。然后采用蒸餾法收集溜出液，用藏紅T分光光度法測定樣品中PCP的含量。
5.栽培結果對于接入特異性PCP降解菌的土壤而言，當種植堿蓬時，土壤中可提取態的低、中、高三個濃度PCP在120d內的降解率分別為94.73％、91.09％、30.60％；而不種植堿蓬的相應各樣的降解率只有67.3％、57.74％、25.22％。以上數據充分說明了種植堿蓬促進了土壤中PCP可提取態濃度的下降，在3個濃度處理水平下，有植物處理時PCP可提取態濃度的降低明顯高于無植物的。
對于不接種特異性PCP降解菌的各樣來說，種植堿蓬時，土壤低、中、高三個濃度PCP在120d內的降解率分別為55.59％、32.60％、5.40％；而不種植堿蓬的相應各樣的降解率為17.49％、11.27％、5.77％。上述的各個數值都明顯低于相應的接菌的各樣的降解率。這是因為特異性PCP降解菌的加入對在較短時間內降解土壤中的高濃度PCP起著很大的作用，從而有效地減低了其對堿蓬的毒性。另外，凡是接菌種植物的各樣其種子都經過了降解PCP菌液的浸泡，這在很大程度上降低了PCP對種子萌發的抑制，保證了堿蓬的順利生長。
比較接菌與不接菌兩種情況可以看出，接種特異性PCP降解菌對土壤修復作用的功效要大于單純種植堿蓬。但是如果將兩者結合，則可以達到最佳的PCP降解效果。這一方面是因為堿蓬本身對微量PCP有一定的吸收轉化作用，或是可以利用降解菌降解PCP的代謝產物，從而促進了降解反應的進行；另一方面，結合PCP降解菌P5、P9對高鹽環境的耐受度不高的特點，堿蓬的種植也起到了積聚鹽分，從而降低土壤中可溶態鹽濃度，以保證P5、P9正常的生理代謝活動的作用。
權利要求
1.一種“植物—微生物”聯合定向修復五氯酚污染土壤的方法，其特征在于(一)篩選特異性污染物降解菌Psendomonasa sp.和Bacillus sp.針對受損土壤的污染物為氯酚類物質中的五氯酚PCP，篩選降解菌的過程包括采樣、富集培養、馴化、分離；(1)富集培養取沿海岸受PCP污染嚴重地區的泥樣，接入PCP富集培養基中，富集培養；待培養基渾濁后，得到活化污泥原液；(2)馴化將活化的污泥原液接入PCP富集培養基中振蕩培養，在檢測到PCP降解后，加入無菌玻璃石棉，繼續培養一段時間后，靜置，棄去上清液；在下層污泥中再加入含PCP的富集培養基，同上培養，直至PCP降解；這樣反復馴化下層污泥，并逐漸增加培養基中PCP的含量，使得污泥中的PCP降解菌不斷被富集；(3)分離在以PCP為唯一碳源，含有溴百里酚藍的固體培養基上篩選周邊變成黃色的菌落，轉板劃線分離，再回接到添加了溴百里酚藍的PCP分離培養基中，經培養后，挑選培養基由藍色變成黃色，并且較為渾濁的培養樣品涂布于含高濃度PCP的平皿中；重復以上過程，獲得高效降解PCP的菌株；最終篩選出兩株高效PCP降解菌P5、P9，P5為Psendomonas sp.P9為Bacillus sp.；在篩選的起始階段培養基中添加的PCP濃度較低，為50mg/l，馴化階段逐漸增加PCP濃度，直至500mg/l，并且為了適應高含鹽環境，在篩選的無機鹽培養基中添加1％的氯化鈉；在平板分離過程中，選取長勢較快并且經回試仍有較強PCP降解能力的菌種；以上其中無機鹽培養基K2HPO41.73g；KH2PO40.68g；NH4NO31.0g； CaCl2·2H2O 0.02g；MnSO4·H2O0.03g；MgSO4·7H2O 0.1g；FeSO40.03g；NaCl 10g；水1000ml； PH 7.4富集培養基在無機鹽培養基中添加一定濃度的PCP作碳源，另加入0.5g/l的酵母粉作生長因子和補充碳源；分離培養基在無機鹽培養基中添加一定濃度的PCP作唯一碳源；(二)堿蓬——特異性PCP降解菌聯合修復污染土壤將PCP高效降解菌的混合菌液與濱海高含鹽含PCP土壤混合，并在其混合土壤上栽種堿蓬灰綠堿蓬suaeda.glanca bunge和鹽地堿蓬S.salsa(L.)Pall，即可達到修復污染土壤。
2.根據權利要求1所述的“植物——微生物”聯合定向修復五氯酚污染土壤的方法，其特征在于堿蓬種植時，將其種子經PCP降解菌菌液浸泡。
全文摘要
“植物－微生物”聯合定向修復五氯酚污染土壤的方法，首先篩選出特異性的能高效降解PCP污染物的降解菌，然后對其菌種及降解特性進行實驗研究，選擇最適條件培養。培養后菌液與滅菌并且添加了不同濃度污染物的受試土壤混合后，作為盆栽堿蓬的實驗用土。在堿蓬的不同生長時期取土樣測定其中PCP殘留量。特點是有堿蓬種植并且其種子經PCP降解菌菌液浸泡，土壤中混有菌液的受試樣的PCP降解率最高，低濃度PCP(5mg/kg)的降解率可達94.73％。接種特異性PCP降解菌同時種植堿蓬，兩者結合，對土壤修復作用的功效要大于單純接種特異性PCP降解菌或種植堿蓬效果，可以達到最佳的PCP降解效果。
文檔編號B09C1/10GK1970179SQ20051001630
公開日2007年5月30日 申請日期2005年11月22日 優先權日2005年11月22日
發明者李小寧, 鄭先強, 孫貽超, 孫靜, 張征云, 李紅柳, 邵曉龍, 侯曉珉 申請人:天津市環境保護科學研究院