專利名稱：特效菌ypc－ta2及處理廢水的方法
技術領域：
本發明創造涉及特效微生物菌及處理化工廢水的方法。
背景技術：
對苯二甲酸(以下簡稱PTA)作為石油化工企業的重要產品之一，相應產生的廢水排放量也相當大，其廢水中COD高達幾千甚至上萬。由于PTA廢水中的污染物多為芳香族化合物，同時PTA也是一種毒害性污染物，而且廢水的處理難度較大，屬于難生物降解的廢水。因此深入研究開發高效廉價大規模工業化降解處理PTA廢水的技術及裝備具有十分重要的意義。
PTA廢水中主要含有對苯二甲酸、甲基苯甲酸、對二甲苯、苯甲酸、鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、4-羧基苯甲醛、醋酸甲酯、醋酸、乙醛、揮發酸及生產過程中是所用原料、中間產物、副產物等40余種有機污染物質，排出的廢水具有水溫高、COD高、水量、水質變化大、污染物組分復雜等特點。
現有各種處理PTA廢水的技術均有一定的缺陷和不足。總的來說有的工藝復雜，構筑物多，基建投資大，出水質量一般；有的污泥產量大，占地面積大，運行費用高。其主要的原因之一就是處理裝置中有效菌含量低，雜菌含量過高，即缺少對污水中污染物具有高效降解作用的有效菌，尤其是針對PTA廢水中具有的高效降解菌。
本發明采用微生物篩選、純化技術，從自然環境中獲得原始菌株，以芳香羧酸為碳源進行純化培養，獲得對芳香羧酸具有高效降解作用的菌株，并測定其對COD及芳香羧酸的降解性能。測定結果，該菌降解性能優良，對芳香羧酸廢水的生物處理有很大的應用價值。
三、發明的內容本發明目的為了提供對芳香羧酸，特別是對苯二甲酸具有高效降解作用的特效菌YPC-TA2，所述特效菌為YPC-TA2(Pseudomonas mosselii，保藏在CGMCC，保藏編號No.1202，保藏日期2004年8月3日)本發明另一目的是一種利用上述特效菌YPC-TA2處理廢水的方法。所述特效菌為YPC-TA2(Pseudomonas mosselii，保藏在CGMCC，保藏編號No.1202，保藏日期2004年8月3日)。
本發明的技術構思從自然環境中獲得原始菌株樣本，進行篩選培養，獲得初步菌株樣本，接種后進行芳香羧酸降解性能測試，選取性能最好的為目標樣本既特效菌。
以下對本發明作進一步描述一、菌株分離篩選方法(一)試劑配制1.芳香羧酸貯備液稱取40g純對苯二甲酸(或鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、苯甲酸)溶于1000ml蒸餾水中，用Na2CO3調節在7.2～7.7之間。
2.富集培養液I牛肉膏0.1g，蛋白胨0.2g，NaCl 0.2g，溶于100ml蒸餾水中。
3.富集培養液II牛肉膏0.5g，蛋白胨0.5g，NaCl 0.2g，溶于100ml蒸餾水中。
4.篩選培養基瓊脂4g，Na2HPO40.1g，(NH4)2SO40.2g，對苯二甲酸(或鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、苯甲酸)貯備液20ml，加蒸餾水至100ml。
5.模擬廢水Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，對苯二甲酸(或鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、苯甲酸)貯備液5ml，加蒸餾水至100ml。
6.富集培養基瓊脂0.6g，牛肉膏0.6g，蛋白胨0.6g，NaCl 0.4g，溶于100ml蒸餾水中。
7.保存培養基Na2HPO40.1g，(NH4)2SO40.2g，瓊脂2g，對苯二甲酸(或鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、苯甲酸)貯備液1ml，溶于100ml蒸餾水中。
(二)篩選方法1、初篩第一步 取芳香羧酸堆場上某處土壤約1g，用50ml富集培養液I室溫搖床培養24小時。
第二步 將第一步獲得的菌懸液稀釋至10-5～10-6，在篩選培養基上涂布，培養48小時，進行馴化。
第三步 配制摸擬廢水，測其COD，記為初始COD。
第四步 從第二步所制篩選培養基上生長的菌落中挑出18個，移入18瓶各含50ml富集培養液II的瓶中，室溫搖床培養24小時。
第五步 將第四步獲得的菌懸液各取10ml，離心12min，棄上清液，將沉淀物移入模擬廢水中，在660nm波長處測定其吸光度，確定其菌體濃度。培養48小時，離心12min，取上清液做COD，記為終了COD。
降解率＝(1-終了COD/初始COD)*100計算，降解率大于80％的進行保存。
COD測定方法見GB11914-892、復篩先后使用了兩種方法，對初篩獲得的菌株作進一步篩選與純化。
方法一與初篩過程基本相同，區別在于用冰箱中保存的菌株代替芳香羧酸堆場的土壤。
方法二取冰箱保存的菌株，從第四步開始與初篩各步驟相同。
二、菌株YPC-TA2的生物學特性YPC-TA2菌株鑒定菌株鑒定依據為《伯杰氏細菌分類手冊》(第八版)，鑒定到屬。
對菌株進一步鑒定采用16s rRNA基因全序列分析1.16s rRNA基因全序列分析(1)菌體培養與收集干菌片在含1000mg/L的對苯二甲酸基本液體培養基中(以芳香羧酸為碳源)富集活化，涂布相同的固體平板，待菌落長出后，檢查菌落的純度與形態，YPC-TA2菌落小，呈半透明白色；挑取單菌落，接種于LB平板中。
菌株經LB平板活化后，挑取單菌落接種于20mlLB培養液中，28℃恒溫振蕩(200r/min)培養，在對數生長期離心(4℃，12000rpm，10min)收集菌體。
(2)總DNA的小量提取取1.5ml菌液5000rpm離心4min，去除上清，用1mlTE緩沖液清洗菌體，5000rpm離心4min，去除上清，以270μl TE緩沖液懸浮菌體。加入15μl溶菌酶溶液，于37℃水浴15min。加15μl 10％SDS，混勻。加10μl蛋白酶K，混勻，37℃水浴1h。加200ul 5M保存于4℃的Nacl，劇烈振蕩。加500μl酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，輕輕振蕩均勻，10000rpm離心10min，吸取上清液至新離心管中。加400ulTE緩沖液后，加500ul異丙醇混勻，置于-20℃過夜以充分沉淀DNA。取出后以10000rpm于4℃離心10min，去除上清，用70％于4℃預冷的乙醇洗沉淀3次，風干，溶于50μl TE(PCR反應專用)緩沖液中。
(3)16s rDNA擴增體系的設計用于擴增供試菌株16s rDNA的PCR引物為P1和P6，它們來源于E.coli 16s rRNA基因序列的保守區域。引物P1和P6的序列如下正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′為Ecoli 8-27。
反向引物5′-TACCTTGTTACGACTT-3′，下游序列位于1492-1507堿基位置。
上述引物由上海博亞公司合成。根據該公司產品說明，用無菌重蒸水將引物溶解至終濃度為100μM，于-20℃下保存。
(4)PCR擴增反應依次于0.5ml PCR管中加入ddH2O、擴增緩沖液、dNTP、Taq酶、Mg2+、P1、P6和模板DNA。瞬間離心后置于PCR儀(Biorad icycle)中進行預變性(95℃，10min)，再進行擴增循環。本實驗采用的循環條件為94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，循環35次，循環結束后72℃延長10min，4℃保存。
(5)PCR產物的檢測、回收與純化取2μl擴增產物與3μl無菌水、1μl上樣緩沖液混勻后，在0.75％的瓊脂糖凝膠板上進行電泳(5v/cm)。以DNA marker DL2000為標準分子量對照。電泳后經EB染色，于紫外燈下觀察，檢測擴增片段的長度和濃度，保存擴增成功的樣品。
PCR產物的回收純化采用TaKaRa公司的PCR Fragment Recovery Kit試劑盒。
(6)連接載體采用購自TaKaRa公司的PMD 18-T Vector。構建以下體系pMD 18-T Vector 1ulInsert DNA1ulLigation Solution 5uldH2O 補足到10ul于16℃反應過夜。
(7)培養DH5a感受態細胞接種單菌落至5ml LB試管中，于37℃劇烈振蕩培養7h，以1％接種量接種至100ml LB三角瓶中繼續培養，隨時檢測OD值，待OD600為0.35時，迅速將搖瓶冰浴10min，使培養物冷至0℃，4℃于4000rpm離心3min，去除上清，以10ml冰預冷的0.1mol/l CaCl2重懸細胞，冰浴30min，4℃于5000rpm離心3min，去除上清，回收細胞。每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1mol/l CaCl2重懸細胞沉淀，冰浴4h，得到感受態細胞。
(8)轉化DNA入感受態細胞用冷卻的無菌吸頭吸取200ul感受態細胞懸液至無菌2ml離心管，每管加10ul DNA，輕輕混勻，冰浴30min。在預加溫至42℃的水浴鍋中放置正好90s后，快速轉管至冰盒上冰浴1-2min，每管加預熱至37℃的LB培養基800ul，在搖床上以低于50rpm速度溫育60min，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。配置如下含相應標記平板每100mlLB中含x-gal(20mg/ml)200ul、IPTG(200mg/ml)12ul、Amp(100mg/ml)100ul。在每塊以上平板上涂布200ul已轉化的感受態細胞，置于室溫直至液體被吸收，倒置于37℃培養，待12-16h后出現菌落。
(9)檢測挑取白斑菌落，提取質粒，以HindIII和EcoRI進行雙酶切(體系外源DNA 5ul，Buffer1ul，dH2O 3ul，HindIII和EcoRI各1ul)，在0.75％的瓊脂糖凝膠板上進行電泳(5v/cm)，檢測片斷大小。
2 16S rRNA基因序列的測定和分析將質粒菌株交由Takara公司測序。所測序列進入GenBank數據庫進行相似性分析。
3.基于16s rDNA比較的系統發育圖所測序列進入GenBank數據庫進行相似性分析，并與GenBank中的已知序列在ClustalX(1.8)程序包中進行多重序列匹配排列(Multiple Alignments)分析，最后形成一個多重序列匹配排列陣，其中形成的缺口用橫杠“-”填補，在MEGA2程序包中用Neighbor-Joining法構建系統進化樹。
從N-J法建立的系統發育樹(圖)上可以看出YPC-TA2菌株與Pseudomonas mosselii位于同一分支內，且16s rDNA同源性高達100％，因此鑒定該菌為Pseudomonas mosselii的又一菌株。
在不同地點取苯甲酸或苯二甲酸堆場上的不同土壤進行該菌株的篩選，結果基本相同。證明本菌株的篩選具有再現性。
三、菌株YPC-TA2對苯二甲酸的降解本發明的特效菌對芳香羧酸有良好的降解作用，特別是苯二甲酸，如對苯二甲酸、鄰苯二甲酸、間苯二甲酸，本課題組對此作了反復研究1、COD/苯二甲酸降解曲線測定自冰箱保存的斜面各接一環菌苔至50ml培養液II，共四瓶，室溫180rpm搖床培養24小時，混合后4000rpm離心15min，將所得菌泥平均分配至9瓶模擬廢水(50ml)中，使初始吸光度(660nm)在0.4～0.6之間，室溫180rpm搖床培養，每4-6小時，取少量菌懸液，4000rpm離心15min，取上清液測定COD及對苯二甲酸，直至COD降到300mg/l(對苯二甲酸在50mg/l左右)以下，做出COD及對苯二甲酸與時間的關系曲線，即為COD、對苯二甲酸降解曲線。
在對苯二甲酸濃度為3550mg/L的模擬廢水中，按0.5g/L的接種量接入活化的特效菌。在室溫下培養，定時測定對苯二甲酸降解率及菌體濃度，特效菌的對苯二甲酸降解曲線如圖1。
特效菌的COD降解曲線如圖2COD降解至0后有上升現象，而對苯二甲酸降解則無此現象，這可能是由于對苯二甲酸碳源被利用完后的菌體破碎所致。
2、菌株的COD/對苯二甲酸耐受性方法基本同降解曲線，但改變了模擬廢水中的初始對苯二甲酸濃度，測試不同濃度下對苯二甲酸、COD的降解情況。
1)表1 不同初始COD的降解情況時間(小時) COD(mg/L)
0641413.5 23003639220442)表2 不同初始對苯二甲酸的降解情況時間(小時) 對苯二甲酸(mg/L)0355010 25031922.5 600由表可知1)初始對苯二甲酸與降解時間有相關性，初始對苯二甲酸高，降解時間長，反之亦然。
2)隨著初始對苯二甲酸升高后，細菌的降解速度及去除率有所下降。
3)在初篩過程中，曾試驗過高于7000mg/L對苯二甲酸模擬廢水，菌株亦可承受，經96小時降解后，對苯二甲酸為140mg/L。
3、不同pH值對對苯二甲酸降解菌的降解能力影響對苯二甲酸降解菌對pH有較寬的適應范圍，pH在5.5-9的范圍內，都有很好的降解能力。pH5.5-8是對苯二甲酸降解菌的最適范圍。在低pH時，對苯二甲酸降解過程中，降解菌能提高培養液的對處理pH值，當初始的培養液pH為5.5時，通過微生物處理以后，最終的pH達到9.5，因此，對于正常的廢水處理中，沒有必要使進水的pH調到中性，而且可以使用出水對進水PH進行調節，減少進水PH調節的原料損耗。不同pH對YOC-TA2菌株降解對苯二甲酸的影響程度較一致，無顯著差異。
4、不同生物量對對苯二甲酸降解菌降解能力的影響方法基本同COD、對苯二甲酸降解曲線，但在將菌泥分配給模擬廢水時，形成菌液的初始濃度梯度，觀察不同投加量下降解曲線的變化。大量培養對苯二甲酸菌，分別測定培養液中微生物的數量和生物量，然后以一倍，二倍和三倍的生物量加入到培養液中，36小時后觀察培養液中對苯二甲酸、TOC濃度和pH值。
YPC-TA2菌株在營養肉湯中培養后，生物量為1.070g/L。取不同的生物量加入的30ml的對苯二甲酸液體中，進行培養。
不同生物量對相同濃度的對苯二甲酸廢水產生不同的影響，加入的對苯二甲酸降解菌的數量多，在單位時間內對對苯二甲酸的降解效率高，對TOC降低也有同樣的結果。但是，不同生物量對處理后最終出水的pH影響不大，都維持在9.0左右。
5、不同溫度對對苯二甲酸降解菌降解能力的影響選擇的溫度為25、30、35、39℃，在相同的36小時時間、生物量、pH7和震蕩速率時進行試驗。開始的對苯二甲酸濃度一致。
不同溫度對對苯二甲酸降解菌的影響比較大，在25-35℃時都能生長，并隨溫度升高，對苯二甲酸的去除率提高，對TOC也時同樣的結果。在25℃，對苯二甲酸的去除率比TOC的去除率要高。
6、不同振蕩速率對對苯二甲酸降解菌降解能力的影響選擇0、50、100、150r/Min的振蕩速率，在相同的對苯二甲酸濃度，在相同的生物量、pH7時，36小時后觀察最后溶液中對苯二甲酸、TOC的濃度和pH值。
不同振蕩速率對對苯二甲酸降解菌的處理效果影響較大，提高振蕩速率，增加液體的供氧量，使對苯二甲酸的處理效率提高。由于對苯二甲酸降解菌是嚴格的好氧菌，如果在厭氧狀態下，對對苯二甲酸不起降解作用。在相同條件下，最后處理后的培養液中pH都在8.9左右。因此，可以從pH的變化反映對苯二甲酸處理的效果。
以上方法不限于對苯二甲酸，本課題組還試驗了間苯二甲酸、鄰二苯甲酸、苯甲酸，本發明的特效菌對他們都有良好的降解作用。
7、保存方法依據簡單可靠的原則，我們先后試驗了兩種方法。
1)液體石蠟保存法將保存培養基做斜面，菌株劃線培養24小時，注入已滅菌的液體石蠟，保持液面高于斜面上端1cm，置于冰箱4℃保存。
2)Stamp保存法取富集菌體0.5ml，將等體積已滅菌的A、B液混合，然后將混合液與菌體混合成菌懸液，按1∶100加入C液，用滅菌注射器滴加在聚乙烯膜上，置無菌工作臺上吹淋48小時，膠帶封口，置冰箱4℃保存。
發明創造的效果芳香羧酸是較難降解的化合物，本發明的特效菌YPC-TA2對芳香羧酸具有較強的降解能力，在對苯二甲酸濃度為3550mg/L、pH為7的模擬廢水中，按0.5g/L的接種量接入活化的高效降解菌，室溫下搖瓶培養，經過20-25小時，.對苯二甲酸濃度降為0mg/L，降解時間短，降解效率高。
四
圖1 YPC-TA2對對苯二甲酸的降解曲線。圖中縱坐標代表對苯二甲酸濃度，橫坐標代表降解時間。
圖2 YPC-TA2對COD的降解曲線。圖中縱坐標代表COD濃度，橫坐標代表降解時間。
本發明的微生物保藏保藏日2004年8月3日，保藏編號No.1202，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址北京海淀區中關村北一條13號中國科學院微生物研究所。
五具體實施例方式
實施例1菌種采集篩選取對苯二甲酸堆場上某處土壤約1g，置于含50ml富集培養液I的錐形瓶中，室溫搖床培養24小時，培養溫度25℃；pH為7。
第二步 將第一步獲得的菌懸液稀釋至10-5～10-6，在篩選培養基上涂布，培養48小時，進行馴化。
第三步 配制摸擬廢水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，對苯二甲酸貯備液5ml，加蒸餾水至100ml測其COD，記為初始COD。
第四步 從第二步所制篩選培養基上生長的菌落中挑出18個，移入18瓶各含50ml富集培養液II的錐形瓶中，室溫搖床培養24小時。
第五步 將第四步獲得的菌懸液各取10ml，離心12min，棄上清液，將沉淀物移入模擬廢水中，在660nm波長處測定其吸光度，確定其菌體濃度。培養48小時，離心12min，取上清液做COD，記為終了COD。
降解率大于80％的進行保存。
配制培養基，瓊脂4g，Na2HPO40.1g，(NH4)2SO40.2g，對苯二甲酸0.8克，加蒸餾水至100ml。倒入培養皿制成固體培養基，涂布培養24小時(培養溫度30℃)，即可出現白色菌落。
配制模擬廢水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，對苯二甲酸濃度為3550mg/L，用Na2CO3調節pH為5.5，加蒸餾水至100ml。高溫滅菌，按0.5g/L的接種量接入活化的高效降解菌，室溫下搖瓶培養，經過20-25小時，對苯二甲酸濃度降為0mg/L。
利用該菌種處理對苯二甲酸化工廢水的方法，是將上述處理模擬廢水的方法簡單放大對苯二甲酸石油化工工業廢水，對苯二甲酸濃度為3550mg/L，加入營養鹽Na2HPO40.05g/L，(NH4)2SO40.1g/L。用Na2CO3調節pH為5.5，加水一倍，高溫滅菌。按0.5g/L的接種量接入活化的高效降解菌，室溫下利用風機曝氣加氧培養，經過20-25小時，對苯二甲酸濃度降為0mg/L。
實施例2菌種采集篩選步驟及處理化工廢水的方法同實施例1，區別在于用苯甲酸替代對苯二甲酸。培養溫度25℃；pH為5.5。
實施例3菌種采集篩選步驟及處理化工廢水的方法同實施例1，區別在于培養溫度35℃；pH為9；配制模擬廢水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，對苯二甲酸濃度為7000mg/L，用Na2CO3調節pH為9，加蒸餾水至100ml。高溫滅菌，按0.5g/L的接種量接入活化的高效降解菌，室溫下搖瓶培養，經96小時降解后，對苯二甲酸為140mg/L。
實施例4菌種采集篩選步驟及處理化工廢水的方法同實施例1，區別在于培養溫度30℃；pH為8；配制模擬廢水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，間苯二甲酸濃度為4020mg/L，用Na2CO3調節pH為7的，加蒸餾水至100ml，高溫滅菌，按0.5g/L的接種量接入活化的高效降解菌，室溫下搖瓶培養，經96小時降解后，間苯二甲酸為20mg/L。
實施例5菌種采集篩選步驟及處理化工廢水的方法同實施例1，區別在于配制模擬廢水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，鄰苯二甲酸濃度為3850mg/L，用Na2CO3調節pH為7的，加蒸餾水至100ml，高溫滅菌，按0.5g/L的接種量接入活化的高效降解菌，室溫下搖瓶培養，經96小時降解后，鄰苯二甲酸為18mg/L。
實施例6菌種采集篩選步驟及處理化工廢水的方法同實施例1，區別在于配制模擬廢水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，苯甲酸濃度為4010mg/L，用Na2CO3調節pH為7的，加蒸餾水至100ml。高溫滅菌，按0.5g/L的接種量接入活化的高效降解菌，室溫下搖瓶培養，經96小時降解后，苯甲酸為32mg/L。
權利要求
1.一種降解廢水中芳香羧酸，特別是降解苯二甲酸的特效菌株，其特征在于所述菌株為YPC-TA2，pseudomonas mosselii，保藏在CGMCC，保藏編號No.1202，保藏日期2004年8月3日。
2.按權利要求1所述的特效菌株YPC-TA2，其特征在于從含芳香羧酸的堆場中分離得到；該菌株適宜在溫度25～35℃，PH值5.5～9條件下培養；以芳香羧酸為碳源。
3.按權利要求1或2所述的特效菌株YPC-TA2，其特征在于從含芳香二羧酸堆場中分離得到；該菌株適宜在35℃，PH值5.5～8條件下培養；好氧，以芳香二羧酸為碳源。
4.一種利用利用權利要求1所述特效菌YPC-TA2降解含芳香羧酸廢水的方法，步驟如下加入營養鹽Na2HPO4，(NH4)2SO4，調節pH為5.5～9，加水一倍，高溫滅菌，按0.5g/L的接種量接入活化的高效降解菌，室溫下曝氣加氧培養，經過20～25小時，即可。
5.按照權利要求4所述的特效菌YPC-TA2降解含芳香羧酸廢水的方法，其特征在于所述芳香羧酸至少包括苯二甲酸。
6.按照權利要求4所述的特效菌YPC-TA2降解含芳香羧酸廢水的方法，其特征在于所述芳香羧酸至少包括對苯二甲酸。
全文摘要
本發明屬于處理廢水中芳香羧酸的微生物菌株發明及利用該菌株處理廢水的用途發明，本發明包括篩選純化降解芳香羧酸的特效菌YPC－TA2，以芳香羧酸為碳源的培養基篩選獲得，為好氧菌，該菌株可降解廢水中芳香羧酸，特別是苯二甲酸。本發明的特效菌降解時間短，降解效率高。
文檔編號C02F3/34GK1605624SQ20041004180
公開日2005年4月13日 申請日期2004年8月27日 優先權日2004年8月27日
發明者陳俊, 鄭國洋, 黃勇, 朱建忠, 章曉春, 王桂林, 周立進, 王洪麗, 陸建華, 羅翔, 喻敬周 申請人:揚子石油化工股份有限公司