專利名稱：大孔聚合物的干燥方法和使用該方法制備的大孔聚合物的制備方法和用途的制作方法
背景技術：
本發明涉及可以產生具有選擇的孔隙率和滲透特性的新型大孔聚合物的干燥方法，該新型大孔聚合物提供了適用于中壓和高壓反相液相色譜法(RPC)的剛性高性能聚合物填料。這里公開的使用本文所述的干燥方法制備的聚合物尤其可用于生物分子比如胰島素和類胰島素化合物的色譜分離和精加工。
使用本發明制備的聚合物樹脂克服了現有技術的關鍵缺陷。現有技術的一個缺陷是聚合物樹脂的填充效率一般低于反相二氧化硅填料。為了非常有效地用于生物分子的精加工，聚合物填料應該可以填充到色譜柱中，達到與反相二氧化硅填料一樣高或更高的水平。另外，填料的孔徑必須足以使生物分子不受限制地擴散到材料內和從材料中擴散出來。使用采用機械壓力來分離珠粒的干燥技術使孔和內部孔結構受到損壞。
可用于大規模加工的填料的粒度必須充分的小，以便能夠以可能的最高收率和最短的周期時間從混合物中回收高度純化的產物。然而，粒度必須不至于小得在色譜柱中產生極限壓降。在RPC生產色譜法中滿足這些要求的粒度典型地是5-50微米，最典型地為10-20微米。
重要的是，為了在生產工藝中經歷的條件下有效，RPC填料必須具有耐受在色譜柱(即，典型地具有2-100厘米內徑的那些)內產生的高操作壓力的機械剛性。這些柱子通常在20-100巴的壓力下操作，它是由于小粒度、高流速和在色譜法中使用的粘性有機溶劑的結合所導致的高反壓力。在工業高壓液相色譜法中，通常使用裝有將動力直接施加于樹脂的活塞的柱子。優選在施加等于或高于色譜柱中的流體壓力的力(壓力)的條件下保持活塞活動。例如，由Novasep制備的動態軸向壓縮(DAC)柱(購自法國Novasep，BP-50 54340 Pompey)在大規模的HPLC方法中使用。
以合成聚合物為基礎的色譜填料對強堿性條件是化學不滲透的。這些材料一般可以在非常寬的pH條件范圍內操作，在生物分子分離中提供了比二氧化硅類材料更高的功用。聚合物樹脂可以使用高pH溶液進行侵蝕性清洗，從而提高了柱子的使用壽命和因此改進了生物藥物制造工藝總的經濟效益。另外，因為聚合物填料可以應用高pH流動相，而二氧化硅類填料卻不能這樣做，所以研發的科學家在設計有效的生物藥物制造工藝中有了更多的手段可供利用。某些分子可以在高pH條件下具有改進的溶解性，而且該方法中的柱子的填充能力和色譜選擇性也可以被改進。
然而，現有聚合物材料的缺陷是它們不同時具有由現有技術RPC硅膠所提供的優異的色譜性能和壓力穩定性的結合。“優異的色譜性能”在這里表示在最短的周期時間中以高的通過量達到高的收率-純度。“壓力穩定性”是指填料在工藝中遇到的高壓條件下抵抗顯著變形的能力。如果凝膠顆粒顯著變形，填充床的空隙體積(和因此介質的滲透性)降低，引起反壓力的增高和可允許通過柱子的溶劑流速的降低。這引起了工藝的周期時間和通過量的降低。
化合物比如胰島素的最終精加工的色譜性能常常被描述或看作是四面體，其中四個頂點代表高收率、高純度、快周期時間和高通過量(通過量是收率、柱子載荷和周期時間的結合)。本發明所要解決的問題是提供一種聚合物樹脂，其通過滿足上述四個標準在最終精加工步驟中實現色譜性能，同時顯示出當經受高達100巴的壓力時抵抗顯著變形的能力。
本發明所要解決的問題是提供一種容易填充的大孔聚合物材料。該材料和其中填充了該材料的柱子適合于生物分子，例如，胰島素和類胰島素化合物的色譜法和最終精加工。
本發明提供了一種制備大量大孔色譜樹脂珠粒的改進方法。該改進包括以不干擾珠粒的內部孔結構的方式從珠粒周圍除去溶劑。常規干燥技術導致了對珠粒的內部孔結構的損害，因此導致珠粒在柱子內的性能低劣和填充不良。本發明通過快速除去在其中含有珠粒的溶劑比如水而解決了該問題。實際上，許多珠粒被溶劑(例如水)所包圍和霧化，使得許多珠粒被包含在水滴中。在本發明的一個變型中，水滴內的珠粒然后經受快速干燥的條件，使得珠粒周圍的水被閃蒸出。水可以在小于約1秒的時間內被閃蒸出。珠粒然后從水滴中脫離，而沒有損害它們的內部孔結構。相反，如在以下實施例中所示，使用常規干燥技術干燥的珠粒結餅，并必須進行機械攪拌或其它機械技術，以便從所得餅中釋放出珠粒。該機械攪拌還導致了珠粒孔結構的破壞。
在本發明的一個變型中，溶劑包括水。在該變型中，從珠粒中急驟干燥出水(或其它溶劑)。如表6所示和如下文所述，急驟干燥賦予了改進的性能特性。
在仍然另一個變型中，去除步驟包括微波干燥珠粒。提供微波給珠粒，使得溶劑從珠粒中快速地被去除，而不損害珠粒的內部孔結構或珠粒表面。在仍然另一個變型中，去除步驟包括冷凍干燥珠粒。珠粒的冷凍干燥用于快速除去溶劑，使得珠粒的孔結構不被損壞。
可以理解，本發明提供了使用采用以不干擾珠粒的內部孔結構的方式從珠粒周圍除去溶劑的步驟的方法制備的大孔珠粒。
這些類型的珠粒具有許多用途。一種示例性用途包括色譜法。例如，改進的色譜法包括使用采用以不干擾珠粒的內部孔結構的方式從珠粒周圍除去溶劑的步驟的方法制備的許多大孔珠粒。去除步驟選自閃蒸出溶劑、冷凍干燥去除溶劑和微波去除溶劑。可以理解，除了這里提供的實例以外，還可以使用閃蒸溶劑(例如水)的其它方法。
在另一個方面，本發明提供了使用本文所述的色譜法從其它化合物中分離出的生物分子或藥物。
可以使用本發明干燥的大孔聚合物的實例包括含有以下聚合單體單元的聚合物50-100wt％的一種或多種多乙烯基芳族單體和0-50wt％的一種或多種單不飽和乙烯基芳族單體。在本發明的一個變型中，該聚合物具有(i)0.7-2立方厘米/克的總孔隙率；(ii)0.7-1.9立方厘米/克的操作的中孔隙率；(iii)以直徑計5-50微米的平均粒度；(iv)200-1500平方米/克的表面積；(v)在100巴的壓力下低于2,000的流阻值；(vi)60-150克胰島素/升聚合物的總胰島素容量和50-150克胰島素/升聚合物的動態胰島素容量。在該聚合物用于加工生物分子比如胰島素或類胰島素分子的情況下，該聚合物能夠獲得70-99.9％的所述胰島素或類胰島素分子的收率，和任選的95-100％的所述胰島素或類胰島素分子的純度。在本發明的另一個變型中，大孔聚合物是種子發泡聚合物。
在本發明的一個變型中，種子發泡聚合物或其它聚合物包括選自二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽和二乙烯基二甲苯中的一種或多種多乙烯基芳族單體。單不飽和乙烯基芳族單體選自苯乙烯和(C1-C4)烷基取代的苯乙烯中的一種或多種。
在另一個變型中，該聚合物具有下列特性的一種或多種(a)400-1000平方米/克的表面積；(b)0.9-1.4立方厘米/克的操作中孔隙率；(c)以直徑計5-20微米的平均粒度；(d)在100巴的壓力下低于2,000的流阻值；(e)60-150克胰島素/升聚合物的總胰島素容量和50-150克胰島素/升聚合物的動態胰島素容量。
在仍然另一個變型中，該聚合物包括以下聚合單體單元(a)75-100wt％的一種或多種多乙烯基芳族單體，和(b)0-25wt％的一種或多種單不飽和乙烯基芳族單體。任選地，該聚合物選自二乙烯基苯共聚物、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、二乙烯基苯-乙基乙烯基苯共聚物和苯乙烯-乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物中的一種或多種。
在另一個變型中，這里的干燥材料的填料同時提供了當經受高達100巴壓力時的壓力穩定性和低變形能力；對于高分辨率的小粒度，和對于最小壓降的均勻粒度分布；目標分子的高填充能力；和以最短的周期時間獲得目標分子的高收率-純度的能力。高達100巴的壓力穩定性也有利于小的均勻粒度的填料，因為小粒度的填料-它獲得了高收率-純度-固有地產生高的反壓力。
在一個變型中，樹脂的孔徑是200-800埃和孔體積是0.8-2.4cc/cc。用填充床的“流阻”衡量的樹脂的壓力穩定性在100巴的壓力下低于或等于2,000。(術語“流阻”是介質滲透性的倒數，并在后面的部分中定義)。
在本發明的仍然另一個變型中，色譜法用通過種子發泡(seed-expansion)方法制造的小的、均勻粒度的、壓力穩定的反相聚合樹脂進行。該技術可以用于制備0.5微米到大于200微米的均勻聚合物珠粒。粒度5-50微米的顆粒是尤其有用的，而且粒度5-20微米的顆粒最有效地用于最終精加工。在柱色譜法應用中，窄粒度珠粒顯著改進了柱子分辨率(即，收率-純度)。與使用本文所述方法干燥的單分散粒度有關的其它優點包括柱子的有效填充、均勻流動、和低的反壓力。顆粒形態、孔徑和表面積是使用本文所述的技術可以有利地控制的另一組重要的物理性能。這些技術可以形成具有優異的用于最終精加工步驟的色譜分離能力、在高壓力條件下的抗變形性和對于低反壓力和高分辨率的均勻粒度的聚合物樹脂。使用本文所述的技術形成小的、單粒度、壓力穩定的顆粒是本發明的重要優點。
在種子發泡聚合方法中，可溶脹的單分散種子首先用穩定劑懸浮在連續水相中。然后添加含單體的引發劑(通常以乳液形式)，以便將種子溶脹到較大的尺寸。因為種子大小均勻和具有相同的組成，所以它們具有相同的溶脹能力，而且對各個單獨的種子而言，它們以相同的量熱力學地吸收單體。因此，獲得了均勻的單體液滴。在升高的溫度下懸浮聚合之后，形成了均勻的聚合物顆粒。
種子用作模板，并且是能夠容易吸收單體的含有聚合物和/或低聚物的均勻顆粒。最終聚合物的所得粒度主要由初始種子的下列特性來決定粒度、粒度分布和溶脹能力。種子顆粒具有許多要求。首先，因為種子用作模板，它的粒度分布必須是均勻的，以便使最終擴大的聚合物顆粒的粒度分布同樣是均勻的。第二，該種子應當能夠快速和均勻地吸收還含有溶劑(成孔劑)的單體。尤其需要快速溶脹，因為溶脹過程常常是在整個聚合物方法中最耗時的步驟。第三，該種子應該與吸收的單體和最終的聚合物在化學上都相容，否則在聚合反應過程中種子可能被逐出，在最終產物中留下孔穴。最后，該種子必須對最終聚合物樹脂產物的化學、物理或性能特性沒有不利影響。在本發明的一個變型中，該種子是單分散、低聚物組成、還具有最佳粒度和高溶脹能力以使得以最小膨脹值來滿足目標聚合物樹脂產物的粒度要求的種子。在本發明的另一個變型中，制備在本發明中使用的樹脂的方法包括使用硫醇作為鏈轉移劑。
有數種種子發泡聚合方法來生產聚合物顆粒，它們各自能夠與這里公開的本發明結合使用。一種這樣的方法被稱為兩步“活化”種子發泡聚合(“Ugelstad方法”)。美國專利No.4,336,173。該方法用聚合物組成的種子起始。該聚合物種子必須首先使用水高度不溶的有機化合物或溶脹劑“軟化”或預溶脹，以便增加總的溶脹能力。所得種子(其含有溶脹劑)然后可以吸收比純聚合物種子本身更大體積的單體。
在本發明的另一個變型中，利用低聚物組成的種子，使用改進的一步溶脹/聚合方法制備樹脂。如果低聚物種子容易獲得-如由本發明所教導的-那么與Ugelstad的兩步溶脹方法相比，該溶脹方法是更容易的而且周期時間是更短的。本發明使用低聚物種子的一步溶脹/聚合方法是合成具有上述性能特性的、適于最終精加工的、反相聚合物顆粒的關鍵實現因素。
這些技術在一個方面通過提供適合于最終精加工純化的大孔反相聚合物樹脂來解決由本發明所提出的問題。該聚合物樹脂在最終精加工步驟中獲得了比得上高質量RPC硅膠的色譜特性，同時顯示出當接觸高達100巴的壓力時在DAC柱中抵抗顯著變形的能力。
在該方面，本發明提供了包括以下聚合單體單元的大孔聚合物(a)50-100wt％的一種或多種多乙烯基芳族單體，和(b)0-50wt％的一種或多種單不飽和乙烯基芳族單體；其中該聚合物具有(i)0.7-2立方厘米/克的總孔隙率；(ii)0.7-1.9立方厘米/克的操作的中孔隙率；(iii)以直徑計2-50微米的平均粒度；(iv)200-1500平方米/克的表面積；(v)在100巴的壓力下低于2,000的流阻值；(vi)50-150克胰島素/升聚合物的總胰島素容量和50-150克胰島素/升聚合物的動態胰島素容量；和(vii)能夠獲得70-99.9％的所述胰島素或類胰島素分子的收率，和任選的95-100％的所述胰島素或類胰島素分子的純度。(可以理解，來自不同來源的胰島素混合物具有不同的雜質分布-其本身能夠產生收率-純度差別-所以高質量硅膠作為參考標準示出，用于與本發明對比。)
本發明還提供了一種用于制備大孔聚合物的種子發泡聚合方法，包括將0-50％的單乙烯基芳族單體和50-100％的多乙烯基芳族單體在40-100％的成孔劑和0.5-10％的自由基聚合引發劑存在下在水懸浮液中聚合；其中所有百分含量是以單體的總重量為基準計。
本發明進一步提供了一種對生物分子混合物(比如胰島素或類胰島素分子)的水溶液進行最終精加工的方法，包括讓該水溶液與使用本文所述的方法干燥的上述大孔聚合物在具有2-100厘米內徑的液相色譜柱中接觸，其中該柱在10-100巴的壓力下操作。
除非上下文明顯另有規定，否則在整個說明書中使用的下列術語具有下列含義。
術語“(甲基)丙烯酸烷基酯”是指相應的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯；類似地，術語“(甲基)丙烯酸類”是指丙烯酸或甲基丙烯酸和相應的衍生物，比如酯或酰胺。所有提到的百分數以重量百分數(wt％)表示，以所涉及的聚合物或組合物的總重量為基準，除非另有規定。術語“共聚物”是指含有兩種或多種不同單體(包括位置異構體)單元的聚合物組合物。在本文中使用以下縮寫g＝克；ppm＝百萬分率(重量/體積)，cm＝厘米，mm＝毫米，ml＝毫升，L＝升。除非另有規定，以上列舉的范圍被認為包括端值和可以組合，溫度按攝氏度(℃)計。
經由高效反相液相色譜法(比如在直徑2-100cm的柱中)用于生物分子最終精加工的本發明的聚合物典型地具有以直徑計2-150，優選5-100，更優選10-75和最優選5-20μm的平均粒度。然而，這些聚合物的其它用途也在這里被考慮。
本發明的大孔聚合物典型地通過種子發泡聚合來生產，并且具有200-1500，優選300-1200和更優選400-1000平方米/克(m2/g)的表面積。大孔聚合物優選是在美國專利No.4,382,124中所述類型的那些，例如，其中孔隙率通過存在成孔劑(還稱為“相增量劑”或“沉淀劑”)，即單體的溶劑、但是聚合物的非溶劑而引入到聚合物珠粒中。常規大孔聚合物，比如根據美國專利No.4,382,124制備的那些，一般包括使用各種各樣的成孔劑類型、相對于單體相的成孔劑濃度、單體類型、交聯單體類型、交聯劑水平、聚合引發劑和引發劑濃度。然而，本發明以下列發現為基礎使用與某些選擇的成孔劑類型和相對于單體相的濃度、特定的單體和選擇的交聯水平、以及選擇的聚合引發劑濃度結合的下述種子發泡聚合技術制備的大孔聚合物具有出乎意料的剛性聚合物結構，對應于經由高效反相液相色譜法分離和純化生物分子的性能的改進。
可以用于制備在本發明中有用的大孔聚合物的適合的多乙烯基芳族單體例如包括選自二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽和二乙烯基二甲苯中的一種或多種單體；可以理解，上述交聯劑各自的任何位置異構體是適合的；優選地，多乙烯基芳族單體是二乙烯基苯。典型地，大孔聚合物包括50-100％，優選65-100％和更優選75-100％的多乙烯基芳族單體單元。
任選地，除了多乙烯基芳族交聯劑以外，還可以使用脂族交聯單體，比如二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三羥甲基丙烷三丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、二甘醇二乙烯基醚和三乙烯基環己烷。當使用時，脂族交聯單體一般作為聚合單元占大孔聚合物的0-20％，優選0-10％，和更優選0-5％，以用于形成大孔共聚物的全部單體重量為基準計。
可以在制備用于本發明的大孔共聚物中使用的適合的單不飽和乙烯基芳族單體例如包括苯乙烯、α-甲基苯乙烯、(C1-C4)烷基取代的苯乙烯、鹵代苯乙烯(比如二溴苯乙烯和三溴苯乙烯)、乙烯基萘和乙烯基蒽；優選地，該單不飽和乙烯基芳族單體選自苯乙烯和(C1-C4)烷基取代的苯乙烯中的一種或多種。屬于適合的(C1-C4)烷基取代的苯乙烯的是例如乙基乙烯基苯、乙烯基甲苯、二乙基苯乙烯、乙基甲基苯乙烯和二甲基苯乙烯；可以理解，上述乙烯基芳族單體各自的任何位置異構體是適合的；優選地，該單不飽和乙烯基芳族單體是乙基乙烯基苯。典型地，大孔聚合物包括0-50％，優選0-35％和更優選0-25％的單不飽和乙烯基芳族單體單元。
任選地，除了乙烯基芳族單體以外，還可以使用非芳族乙烯基單體，比如脂族不飽和單體，例如氯乙烯、丙烯腈、(甲基)丙烯酸和(甲基)丙烯酸的烷基酯((甲基)丙烯酸烷基酯)。當使用時，非芳族乙烯基單體一般作為聚合單元占大孔共聚物的0-20％，優選0-10％，和更優選0-5％，以用于形成大孔共聚物的全部單體重量為基準計。
優選的大孔聚合物選自二乙烯基苯共聚物、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、二乙烯基苯-乙基乙烯基苯共聚物和苯乙烯-乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物中的一種或多種；更優選的是二乙烯基苯-乙基乙烯基苯和苯乙烯-乙基乙烯基苯-二乙烯基苯聚合物。
用于制備本發明的大孔聚合物的成孔劑包括疏水成孔劑，比如(C7-C10)芳族烴和(C6-C12)飽和烴；和親水成孔劑，比如(C4-C10)鏈烷醇和聚亞烷基二醇。可以使用單一成孔劑或混合的成孔劑體系。適合的(C7-C10)芳族烴包括例如甲苯、乙基苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯中的一種或多種；可以理解，上述烴各自的任何位置異構體是適合的。優選地，該芳族烴是甲苯或二甲苯或二甲苯的混合物或甲苯和二甲苯的混合物。適合的(C6-C12)飽和烴包括例如己烷、庚烷和異辛烷中的一種或多種；優選地，該飽和烴是異辛烷。適合的(C4-C10)鏈烷醇例如包括異丁醇、叔戊醇、正戊醇、異戊醇、甲基異丁基甲醇(4-甲基-2-戊醇)、己醇和辛醇中的一種或多種；優選地，該鏈烷醇選自一種或多種(C5-C8)鏈烷醇，比如甲基異丁基甲醇和辛醇。優選地，成孔劑混合物包括選自一種或多種(C5-C8)鏈烷醇的親水成孔劑和選自一種或多種(C7-C10)芳族烴的疏水成孔劑。
典型地，使用本文所述的技術，用于制備本發明聚合物的成孔劑的總量最優選是基于單體重量的45-100％。成孔劑含量超過100％時，聚合物在DAC柱中的高壓條件(100巴的活塞壓力)下具有差的流阻值(高變形能力)。成孔劑含量低于45％時，可以看出，聚合物具有通過牛胰島素結合試驗(參看表1)所測定的差的色譜性能。
用于制備本發明聚合物的聚合引發劑包括單體可溶的引發劑，比如過氧化物、氫過氧化物和相關引發劑；例如過氧化苯甲酰、過氧化氫叔丁基、過氧化枯烯、過氧化1，2，3，4-四氫化萘、過氧化乙酰、過氧化己酰、過辛酸叔丁酯(還被稱為過氧-2-乙基己酸叔丁酯)、過辛酸叔戊基酯、過苯甲酸叔丁酯、二過鄰苯二甲酸叔丁酯、過氧二碳酸二環己酯、過氧二碳酸二(4-叔丁基環己基)酯和甲基乙基酮過氧化物。還可使用偶氮引發劑，比如偶氮二異丁腈、偶氮二異丁酰胺、2，2’-偶氮-雙(2，4-二甲基戊腈)、偶氮-雙(α-甲基丁腈)和二甲基-、二乙基-或二丁基的偶氮-雙(甲基戊酸酯)。優選的過氧化物引發劑是二酰基過氧化物，比如過氧化苯甲酰，和過氧化酯，比如過辛酸叔丁酯和過苯甲酸叔丁酯；更優選地，該引發劑是過氧化苯甲酰。過氧化物引發劑的適合用量是0.5-10％，優選1-9％，更優選2-7％和最優選3-5％，以乙烯基單體的總重量為基準計。最優選地，自由基引發劑以基于單體的總重量的2-7％存在，并且選自一種或多種二酰基過氧化物和過氧化酯。
用于制備本發明的大孔聚合物的分散劑和懸浮劑是具有羥烷基纖維素骨架、含有1-24個碳原子的疏水烷基側鏈、以及用平均1-8、優選1-5個氧化乙烯基團取代羥烷基纖維素骨架的各重復單元的非離子型表面活性劑，烷基側鏈以0.1-10個烷基/100個在羥烷基纖維素骨架中的重復單元的水平存在。羥烷基纖維素中的烷基可以含有1-24個碳，并且可以是線性、支化或環狀的。更優選的是含有0.1-10個(C16)烷基側鏈/100個葡糖酐單元和用大約2.5-4個氧化乙烯基團取代各葡糖酐單元的羥乙基纖維素。分散劑的典型用量是基于水相總重量的大約0.01％到大約4％。
用于制備本發明的大孔聚合物的其它分散劑和懸浮劑是含有親水骨架的聚合物，這使得在兩相界面上它們的親脂部分向單體相取向和它們的親水部分向水相取向。這些聚合物分散劑包括纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、淀粉等。還可以使用分散劑的混合物。這些其它分散劑往往是較不優選的，因為它們傾向于形成較大量的聚集的或不希望有的材料。
任選地，可以對大孔聚合物進行涂布或通過已知方法比如常規磺化、氯甲基化和胺化，用各種常規的可電離官能團(弱酸官能團，比如羧酸基團；弱堿官能團，比如伯、仲或叔胺官能團；強酸官能團，比如磺酸基團；強堿官能團，比如季銨氯化物或氫氧根基團)進行后官能化。
本發明的大孔聚合物以由于增強的剛性聚合物結構和在聚合過程中引入到聚合物中的選擇的孔隙率而導致的改進的滲透性(低流阻)為特征。滲透性(K)通過達西定律(方程式1)與在柱中產生的反壓力相關ΔP/L＝μV/[K(dp)2]方程式1其中μ＝粘度(毫帕斯卡·秒或厘泊)V＝線速度(cm/hr)ΔP＝壓降(巴)L＝床高(cm)dp＝聚合物的平均粒度(微米)上述變量的單位以它們的常用形式表示；可以理解，需要單位換算來使等式1無量綱。聚合物的剛性越高(即，可壓縮性越低)，聚合物的滲透性越高，對于溶劑粘度、線速度和粒度的任何給定結合轉化為較低的反壓力。在層流條件下(這是色譜分離和純化應用的典型特征)，柱中的反壓力還可以用卡曼-康采尼方程(方程式2)來表示ΔP/L＝150·[(1-ε)2/ε3]·μV/(dp)2方程式2其中ε＝顆粒間空隙體積(cm3/cm3)關于達西定律和卡曼-康采尼方程(方程式1和2)的進一步的一般和具體細節，可以查閱參考文獻，比如“Fundamentals of Preparativeand Nonlinear Chromatography”(G.Guiochon，S.Goshan Shirazi和A.Katti；Academic出版社(1994))和“Unit Operations in ChemicalEngineering”(W.L.McCabe，J.C.Smith和P.Harriott；McGraw Hill(1985))。
通過結合方程式1和2，可以看出，色譜柱中的滲透性(或流阻)與聚合物樹脂床的顆粒間空隙體積(即，聚合物顆粒之間的體積)相關；ε表示為空隙的體積/單位體積的聚合物床。該關系用方程式3來表示1/K＝150·[(1-ε)2/ε3] 方程式3對于本發明的目的來說，我們將聚合物的特性“流阻”值定義為滲透性的倒數。該特性“流阻”值是聚合物在中壓到高壓條件下表現如何的指標低流阻值表示低的可壓縮性和高流阻值表示差的可壓縮性。
另外，根據達西定律，滲透性或流阻的表達式通常包括粒度效應(在方程式1中的dp)。本發明的一個目的是通過增加的聚合物剛性提供改進的流阻，與粒度效應無關。可以理解，對于給定的聚合物而言，單獨的減小的粒度將產生如由方程式1和2給出的更高的反壓力。
典型地，在本發明的一個變型中，大孔聚合物在10巴(中壓)的操作壓力下具有700到低于1,800，優選700到低于1,500和更優選低于1,300的流阻值(即，1/K)。在更高的操作壓力(用60巴來表示)下，大孔聚合物具有1,500到低于7,000，優選1,500到低于5,000和更優選低于4,500的流阻值。在最高的操作壓力(用100巴來表示)下，大孔聚合物具有1,500到低于7,000，優選1,500到低于5,000和更優選低于4,500的流阻值。適合用于RPC的大孔聚合物具有(i)在10巴的壓力下低于1,800和(ii)在60巴的壓力下低于7,000的流阻值。流阻值高于上述界限的聚合物在工業RPC柱中存在的中壓到高壓條件下沒能提供充分的耐壓縮性，因此導致通過量降低和在操作過程中柱壓增高。
本發明的大孔聚合物通過由用于制備聚合物的成孔劑類型和比率所產生的選擇的孔隙率和孔徑分布來表征。孔隙率使用MicromereticsTMASAP-2400氮氣孔隙率測定儀來測定。根據IUPAC命名法的孔隙率如下所示微孔隙率＝小于20埃單位的孔中孔隙率＝20-500埃單位的孔大孔隙率＝大于500埃單位的孔對于本發明的目的來說，“操作”的微孔隙率被定義為直徑小于50埃單位的孔和“操作”的中孔隙率被定義為直徑在50-500埃單位之間的孔。在如本文所使用的“操作”的孔隙率和根據IUPAC命名法定義的孔隙率之間的輕微差別歸因于下列事實50埃單位是更適合和適當的截止點(與20埃單位相比)，以便適應感興趣的生物分子在本發明的大孔聚合物中的吸附。
在一個變型中，本發明的大孔聚合物具有0.7-2，0.9-1.8和1.0-1.7cm3/g的總孔隙率。在仍然另一個變型中，大孔聚合物具有0.7-1.9，0.8-1.7和優選0.9-1.4cm3/g的操作的中孔隙率。該大孔聚合物具有0-0.5，0-0.3，0-0.2和從0到小于0.1cm3/g的操作的微孔隙率。該大孔聚合物可以任選地具有0-0.6，優選0-0.5和更優選0-0.3cm3/g的大孔隙率。
胰島素純化能力是聚合物基質作為適合介質用于大規模分離和純化類似尺寸和分子構型的生物分子的能力的指標。在以下實施例中詳細描述了本發明的一些實施方案。除非另有規定，所有比率、份數和百分率按重量計，而且除非另有規定，所用全部試劑具有良好的商品質量。以下用相應的說明列舉了在實施例和表中使用的縮寫MIBC＝甲基異丁基甲醇(4-甲基-2-戊醇)DVB＝二乙烯基苯(間/對異構體的混合物)EVB＝乙基乙烯基苯(間/對異構體的混合物)BPO＝過氧化苯甲酰rpm＝轉/分鐘v/v＝體積/體積w/v＝重量/體積μm＝微米nm＝納米g/L＝克/升cm3/g＝立方厘米/克μl＝微升NA＝未分析實施例1使用以下過程制備在本發明中使用的單粒度、亞微米聚苯乙烯顆粒和單粒度的3.0微米低聚物種子。使用由Frazza等人開發的乳液聚合方法(美國專利No.5,147,937)來合成0.25微米聚苯乙烯顆粒。該方法涉及使用表面活性劑AEROSOL MA-80(二己基磺基琥珀酸鈉)來穩定膠束和水溶性引發劑(過硫酸銨)。該反應在惰性氣氛下進行，其中在反應開始時將單體和引發劑的總進料加入到釜內。二己基磺基琥珀酸鈉在水中具有有限的溶解度，但充分分散于水相中，結果，在濃度達到1％時觀察到了稍微不透明的含水混合物。在聚合反應之后，以幾乎100％的收率獲得了粒度0.25微米的穩定的淺藍色膠乳。粒度通過BI-90或BI-90和/或CHDF-2000(毛細管流體動力分級)來測定。
0.6μm低聚物種子的合成以種子乳液聚合(美國專利No.5,846,657)為基礎，由0.25微米聚合物種子來合成0.5微米低聚物種子。
將混合物A加入到反應器中并在攪拌下加熱到88℃。在攪拌下用3小時的時間將混合物B、C和D加入到反應器中，此后，在攪拌的同時，溫度在88℃下保持90分鐘，在攪拌下用1小時的時間將反應器內容物冷卻到65℃，此后將反應器內容物冷卻到室溫。所得乳液聚合物顆粒具有通過Brookhaven Instruments BI-90測定的0.5微米的直徑。
3μm低聚物種子的合成在攪拌下將混合物A加入到反應器中。將混合物B均化，并加入到以上反應器中。在己烷硫醇完全被低聚物種子吸收之后，將乳液C加入到反應器中。然后將反應器在室溫下攪拌20小時，然后用1小時加熱到85℃和然后另用1小時加熱到95℃。冷卻到室溫，獲得了粒度3微米的均勻低聚物顆粒。
可以理解，在實施例1中制備的各種種子和樹脂可以使用在本發明中所述的方法來干燥。
實施例2以下實施例舉例說明了本發明的反相聚合物樹脂的制備，它可以在生物分子/藥物分離和最終精加工中用作填料。可以理解，該反相聚合物樹脂也可以使用本文所述的新型干燥方法來干燥。而且，可以理解，本文的干燥方法可以用于制備在水污染物去除和其中使用樹脂和吸附劑的其它工業方法中所用的其它樹脂。
在500ml燒杯內通過將下列成分混合來制備種子進料21.3g由實施例1獲得的3.0微米低聚物種子(30.1％固體)，8.5g的1％Solusol溶液和105.5g的去離子水。將種子溶液加入到安裝了機械攪拌器和熱電偶的1.8L Buchi不銹鋼反應燒瓶(“反應器”)內。之后添加46.4g的去離子水以沖洗輸送管道。將攪拌器設定在150rpm。
在500ml燒杯內通過添加下列成分來制備單體/成孔劑乳液116.1g的二乙烯基苯(80％DVB/20％EVB)，69.7g的MIBC，142.0g的去離子水，和1.49g的75wt％Sol美國ol水溶液。將這些成分在燒杯內混合，形成乳液。然后用40分鐘的時間通過Silverson ILE乳化器(設置產量50％)將該乳液從燒杯內泵送到反應器中。
用1小時的時間將反應器加熱到60℃并在該溫度下保持2小時，以便使低聚物種子用單體和成孔劑乳液溶脹。
在60℃下保持2小時之后，然后添加乳化的引發劑溶液。該乳液在50ml燒杯內通過將1.29g的過辛酸叔丁酯加入到18.7g的1％Solusol溶液中來制備。將這些成分均化以形成乳液，再從燒杯中一次性轉移到反應器中。在轉移之后使用24.1g的去離子水來沖洗輸送管道。該反應器然后在60℃下保持另外2小時。
通過將2.4g的K4MP(甲基羥乙基纖維素，購自Dow ChemicalCompany)混入到334.9g的去離子水中來制備水溶液。在保持2小時之后，將水溶液轉移到反應器中，隨后添加15.8g的去離子水來沖洗輸送管道。
將反應混合物(合并的有機相和水相)在120rpm和60℃溫度下攪拌30分鐘，然后經60分鐘加熱到80℃。將反應混合物在80℃下保持12小時，以聚合這些反應物。
在聚合反應完成之后，在攪拌的同時將反應混合物的溫度調節到50℃。通過將10％硫酸緩慢加入到水相中直到達到最終pH來將水/聚合物混合物的水相的pH調至5.0。
將14.4g的β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(Cellulase4000，購自Valley Research，Inc.)的混合物混入到134.5g的去離子水中，然后加入到反應器中。溫度在50℃下保持12小時。然后用50％氫氧化鈉水溶液將水/聚合物混合物的水相的pH調至12.0，將反應器內的溫度升高到90℃。讓反應器在該溫度下保持5小時。
將水/聚合物混合物冷卻到室溫，從反應器移出，再置于1L色譜柱中。從該聚合物過濾出水相，然后聚合物的填充床用2L的去離子水洗滌，隨后用3.5L的丙酮洗滌和最后用3.5L的甲醇洗滌。濕聚合物在100℃的溫度和2.5mm(0.1英寸)汞真空度下干燥16小時。
實施例3本實施例描述了本發明的大孔聚合物對于胰島素結合容量的評價。這些聚合物使用標準干燥技術，而非本文所述的新型干燥技術來干燥。可以理解，使用本文所述的新型干燥技術為大孔聚合物賦予了改進的性能特性。將大約5ml體積的樣品填充到小規模試驗柱(1.0cm內徑×6.3cm長度)中，評價水溶液中牛胰島素的前沿吸附(frontal adsorption)；該試驗被設計用于測定聚合物基質是否允許快速有效的物質傳遞和對于目標探針分子(牛胰島素)在典型使用條件下的高容量。
將5g的干燥聚合物樹脂(根據實施例2制備，除非另有規定)與35ml的20％乙醇/水(v/v)混合，在環境溫度下放置至少2小時。然后聚合物淤漿通過以160cm/hr的線速度在20％(v/v)乙醇/水溶液中流動充填來填充到不銹鋼柱(尺寸10mm內徑×100mm長度，購自AlltechCorp.)中。柱填充的質量通過將50μL脈沖的1％氯化鈉在去離子水中的溶液注射到柱中，同時使20％(v/v)乙醇/水洗脫劑以40cm/hr的線速度流動來確定。柱的效率(板數/米)和不對稱性使用Hewlett PackardChemstation軟件來計算。可接受的柱填充參數的目標值是最低5,000板數/米的效率與0.8-1.8的不對稱性。
制備濃度為每升水5g的牛胰島素(購自Sigma-Aldrich ChemicalCo.)溶液。將總共200ml的該溶液泵送到線速度150cm/hr的柱中，使用波長設定在291nm的UV分光光度計檢測器(Spectraflow783，購自ABI Analytical，Kratos Division)來檢測流出物中的牛胰島素。
通過記錄UV響應曲線上1％胰島素突破點(相對于吸附到聚合物樹脂上的胰島素的總量)的吸附到聚合物樹脂上的胰島素的量來獲得聚合物樹脂的動態容量(g/L)。樹脂的總容量(g/L)通過用UV分光光度法測量流入和流出溶液的胰島素濃度，然后進行質量平衡來測定。
牛胰島素結合容量用作測定使用性能的篩選試驗。該容量測試的結果在表1中示出。由實施例2獲得的樹脂在該表中用樣品號1-3來表示，而編號1-1、1-2、1-4和1-5的樣品表示制劑中成孔劑含量的改變。為了使產品性能最大化，希望用最低的成孔劑含量獲得高的結合容量。
編號1-6、1-7和1-8的樣品表示用美國專利No.6,387,974中公開的技術制備的樹脂。與根據美國專利No.6,387,974制備的樹脂比較，用本文所述的技術制備的樣品出乎意料地顯示出在更低的成孔劑含量條件下高的胰島素結合容量的結果。在以下實施例中將顯示，這是形成具有所需的最終精加工性能，同時在100巴下壓力穩定的反相聚合物樹脂的關鍵實現因素。
實施例4以下實施例舉例說明了使用由實施例2獲得的聚合物樹脂對牛胰島素進行的最終精加工。將由實施例2獲得的樹脂裝填到尺寸為4.6mm內徑×250mm長度的不銹鋼色譜柱中。在本實施例中使用下列流動相“緩沖液A”＝pH4.0的去離子水中的100mM甘氨酸；“緩沖液B”＝100％的HPLC級乙腈。
在本實施例中使用的胰島素是具有92％的粗品純度的牛胰島素(購自Sigma-Aldrich Company)。通過將總共75mg的該胰島素溶解到12.5mL的“加載緩沖液(loading buffer)”中制備牛胰島素溶液，該“加載緩沖液”含有在10％(v/v)乙腈/去離子水中的0.1％的甘氨酸，用30mL的TFA調節pH為2。以0.27ml/min(100cm/hr)的速度將足量的胰島素溶液加載到柱中，以便獲得18mg胰島素/mL柱的柱濃度。
在加載之后，柱子用1個柱體積(4.15mL)的加樣載緩沖液并也以0.27ml/min的流速洗滌。通過用32.5個柱體積(135mL)的溶劑、采用從17.5％到30％的緩沖液B的線性梯度從柱中洗脫胰島素。在洗脫過程中的溶劑流速是0.27mL/min。流出物用設定在280nm的UV檢測，以每2分鐘1次的速率收集各級分。
使用填充了Zorbax 300SB-C8，300A，5微米樹脂的出自AgilentTechnologies的反相HPLC柱(4.6mm內徑×250mm長度)分析各級分。在級分分析中使用下列溶劑條件緩沖液A在HPLC級水中0.1％(v/v)的TFA；緩沖液B在HPLC級乙腈中0.1％(v/v)的TFA。使用Agilent 1100HPLC進行分析，其在25℃的柱溫和0.8ml/min的流速下運行。洗脫條件包括在25％緩沖液B的條件下保持3分鐘，然后在30分鐘過程中的從25％到35％緩沖液B的梯度。
在表2中示出了由牛胰島素的制備型純化得到的結果。實施例2的樹脂在該表中用樣品號1-3表示。其它商購聚合物樹脂為了對比而示出，包括樣品1-10(AmberchromTMCG300S)和樣品1-9(AmberchromTMXT20，按照美國專利No.6,387,974獲得的商品材料)。樣品1-11表示高質量的反相二氧化硅填料(KromasilTM100A，13微米二氧化硅，從EkaChemicals商購)，其在這里作為性能參考標準而示出。表2中的結果顯示，只有本發明的反相聚合物樹脂提供了比得上高質量反相二氧化硅的最終精加工的純化性能。
實施例5以下實施例舉例說明了胰島素或類胰島素分子使用由實施例2得到的聚合物樹脂的最終精加工。將由實施例2獲得的樹脂裝填到尺寸為4.6mm內徑×250mm長度的不銹鋼色譜柱中。在本實施例中使用下列流動相“緩沖液A”＝pH4.0的去離子水中的100mM甘氨酸；“緩沖液B”＝100％的HPLC級乙腈。
在本實施例中使用的胰島素是購自Sigma的重組人胰島素，它具有92％的純度。通過將總共75mg的該胰島素溶解到12.5mL的“加載緩沖液”中制備溶液，該“加載緩沖液”含有在10％(v/v)乙腈/去離子水中的0.1％的甘氨酸，用30mL的TFA調節pH為2。以0.27ml/min(100cm/hr)的速度將足量的胰島素溶液加載到柱中，以便獲得18mg胰島素/mL柱的柱濃度。在加載之后，柱子用1個柱體積(4.15mL)的加載緩沖液、也以0.27ml/min的流速洗滌。
通過用32.5個柱體積(135mL)的溶劑、采用從17.5％到30％的緩沖液B的線性梯度從柱中洗脫胰島素。在洗脫過程中的溶劑流速是0.27mL/min。流出物用設定在280nm的UV檢測，以每2分鐘1次的速率收集各級分。
使用填充了Zorbax 300SB-C8，300A，5微米樹脂的出自AgilentTechnologies的反相HPLC柱(4.6mm內徑×250mm長度)分析各級分。在級分分析中使用下列溶劑條件緩沖液A在HPLC級水中0.1％(v/v)的TFA；緩沖液B在HPLC級乙腈中0.1％(v/v)的TFA。使用Agilent 1100HPLC進行分析，其在25℃的柱溫和0.8ml/min的流速下運行。洗脫條件包括在25％緩沖液B的條件下保持3分鐘，然后在30分鐘過程中的從25％到35％緩沖液B的梯度。
在表3中示出了由重組人胰島素的制備型純化得到的結果。實施例2的樹脂在該表中用樣品號1-3表示。其它商購聚合物樹脂為了對比而示出，包括樣品1-10(AmberchromTMCG300S)和樣品1-9(AmberchromTMXT20，按照美國專利No.6,387,974獲得的商品材料)。樣品1-11表示高質量的反相二氧化硅填料(KromasilTM100A，13微米二氧化硅，從EkaChemicals商購)，它在這里作為性能參考標準而示出。表3中的結果顯示，只有本發明的反相聚合物樹脂提供了比得上高質量反相二氧化硅的最終精加工的純化性能。
使用該技術，人胰島素可以非常令人滿意地與雜質分離。以99.5％的純度獲得了70％的胰島素收率。裝載胰島素的總回收率＞90。
實施例6本實施例描述了如何評價大孔聚合物(使用標準技術干燥)的滲透特性，即耐壓縮性。這些聚合物用它們的“流阻”或者1/K值(參看方程式3)來表征。
在工業高壓液相色譜法中，通常使用安裝了將力(壓力)直接施加于樹脂的活塞的柱子。優選以等于或高于在整個色譜周期中的最大預期流動壓力的壓力保持活塞活動地壓縮該床。為了測試本發明聚合物的滲透特性，將聚合物樹脂裝填到ProChromTM動態軸向壓縮柱(Model LC.50，購自Novasep)中，并用首先設定在100巴壓縮壓力的活塞壓縮。該試驗的目的是表征各樣品的滲透特性(耐壓縮性)。以下是詳細描述一般而言，為了測定聚乙烯基芳族聚合物床的顆粒間空隙體積(或滲透性)，必須選擇流動相，以便與探針分子相容，使得它們消除或減少了探針分子與聚乙烯基芳族聚合物的疏水表面的相互作用。可以使用常規探針分子，比如線性聚苯乙烯、藍葡聚糖和聚乙二醇，但需要使用非極性流動相(比如四氫呋喃和甲苯)。然而，在下述方法中使用的探針分子不需要使用非極性溶劑，并且可以在任何水-有機溶劑體系，例如20％乙醇中使用。
為了測定柱中的空隙的總體積(顆粒內和顆粒間)，將2ml的1％氯化鈉(w/v，在20％乙醇水溶液中)注入到體系中。用電導率檢測器檢測該鹽。為了僅僅測定顆粒間空隙體積，將含有1％(w/v)的0.1-0.9μm帶離子電荷的乳液聚合物或細研磨的帶離子電荷聚合物(例如，具有可電離官能團，比如弱酸官能團(羧酸根)、強酸官能團(磺酸根)、或季銨氯化物基團的交聯聚苯乙烯)的20％乙醇溶液(水溶液)注射到流經該床的20％乙醇(水溶液)的料流中。用設定在280nm的UV檢測器檢測顆粒。由于帶離子電荷的聚合物探針顆粒的尺寸，這些顆粒不能穿過本發明的聚合物樹脂的孔。由于帶離子電荷的聚合物探針顆粒的表面性質(這些顆粒具有芳族結構和分布在整個表面上的高濃度的離子生成基團)，防止了對本發明聚合物樹脂的疏水吸引/保留。
測定聚合物床的總空隙體積(鹽探針洗脫體積)，并與聚合物顆粒外部的空隙體積(帶離子電荷的乳液或研磨聚合物的洗脫體積)合并。這些值與測量的床體積一起用于計算方程式2和3中的ε。
在表4中示出了由牛胰島素的制備型純化獲得的結果。實施例2的樹脂在該表中用樣品號1-3表示。其它商購聚合物樹脂為了對比而示出，包括樣品1-10(AmberchromTMCG300S)，樣品1-9(AmberchromTMXT20，按照美國專利No.6,387,974獲得的商品材料)，樣品1-12(SourceTM30RPC，購自General Electric)和樣品1-13(PLRPTM10-15微米，購自Polymer Labs)。樣品1-11表示高質量的反相二氧化硅填料(KromasilTM100A，13微米二氧化硅，從Eka Chemicals商購)，它在這里作為性能參考標準而示出。表4中的結果顯示，在100巴的活塞壓力下，只有本發明的反相聚合物樹脂沒有明顯變形；所有其它的反相聚合物填料都經受了顯著的變形和流阻增加。
實施例7以下實施例舉例說明了各種干燥方法。所要干燥的樣品如下制備將335g的水濕(20％固體)實驗的10μm聚二乙烯基苯多孔樹脂稱量到2000ml燒杯內。向該燒杯添加1500ml的去離子水，然后溫和地混合。
樣品如下所示進行噴霧干燥裝配BuchiTM微型噴霧干燥器B-191，用于處理樹脂淤漿。噴霧干燥器流速用去離子水(“DI”)設定在10ml/min，以便設定使用噴霧干燥器的下列操作條件噴霧流速10ml/min，進口溫度140℃，和出口溫度80℃。將進料軟管浸入到裝有樹脂淤漿的燒杯內，然后樹脂淤漿以10ml/min的速度送料給噴霧干燥器。在噴霧干燥2.5小時之后，收集了67g具有99.5％固體百分率的樹脂。產物是自由流動的粉末，使用顯微鏡在1×或100×放大倍數下目視檢查沒有發現聚集的跡象。
對比例7A以下實施例舉例說明了使用真空烘箱干燥的對比例。所干燥的樣品如下制備將335g的水濕(20％固體)實驗的10μm聚二乙烯基苯多孔樹脂投入到9″×11″SS盤中。將該樹脂以在底部形成薄層的方式施涂于盤中。然后將盤放入室溫下的真空烘箱內，施加40mmHg的真空。然后用4小時將烘箱加熱到99℃，再保持18小時。將真空烘箱冷卻到室溫，該烘箱用氮氣加壓到大氣壓。從烘箱中取出盤，樣品再稱重，獲得68g具有99.8％固體百分率的樹脂。
樣品在盤中目測到聚集，該聚集體非常難以破碎成單獨的10μm顆粒。該樣品然后使用20μm的篩網干燥篩選，獲得10g自由流動的粉末。
實施例8以下實施例舉例說明了使用賦予樹脂改進性能的、在本發明中所述的干燥方法制備的材料的柱子填料。干燥樹脂使用由60％異丙醇/40％水組成的溶劑溶液水合。為了填充1cm內徑×25cm長度的柱子(19.625mL體積)，將14g的干燥樹脂加入到100mL的溶劑溶液中。根據0.35g/mL的樹脂密度，這提供了40％(體積/體積)的樹脂淤漿。讓該材料在填充之前水合至少2小時。
該樹脂淤漿使用架空攪拌再次懸浮，然后超聲處理大約2分鐘，以確保均勻性。然后將該淤漿小心地倒入不銹鋼填充裝置中。該填充裝置由填充儲罐和不銹鋼柱(1cm內徑×25cm長度)組成。該填充裝置然后使用與該水合溶液相同的填充溶液連接于HPLC泵。在2-3分鐘的過程中將流速緩慢地升高到目標流速。壓力使用在線壓力計檢測，所施加的最高填充壓力是1000psi。通過在填充過程中降低流速來保持壓力恒定。當獲得穩定的壓力和流速時(15-20分鐘)，填充被認為是完全的。然后從填充儲罐中取出柱子，將端接頭(endfitting)放置在柱子的頂部。
如下進行氯化鈉柱評價然后將該柱子安裝到裝有電導率計的HPLC系統中。該柱子在2mL/min的20％乙醇/80％水的流動相下平衡20分鐘。在平衡之后，流速降低到0.5mL/min，將50μl的1％氯化鈉溶液注射到柱中。由洗脫的鹽峰計算柱效率(板數/M)。
如下所示對使用本發明的方法干燥的材料進行人胰島素的評價使用人胰島素(Sigma)，噴霧干燥的10μm材料的效率與競爭10μm二氧化硅柱(由供貨商填充)在非保留條件下進行比較。柱子首先在50％乙腈/50％水/0.1％TFA的流動相中平衡，然后將50μl的5mg/mL人胰島素注射到柱中。以5種不同的流速進行成雙地評價0.25、0.50、1.0、2.0和3.0mL/min。用UV檢測器在280nm下進行檢測。由洗脫的人胰島素的峰計算柱效率(板數/M)。
噴霧干燥材料的定性填充分布的再現性超過了常規干燥的材料。常規干燥樹脂的壓降比該噴霧干燥材料的壓降經歷了更大的波動。另外，常規干燥材料的最終流速低于該噴霧干燥材料的最終流速。
在表5中示出了氯化鈉評價的結果。實驗室、中試和生產規模的常規干燥樹脂提供了40,000到47,000板數/M范圍的效率。另外，來自Polymer Labs and Hamilton的其它10μm的商購聚合物材料提供了40,000到45,000板數/M范圍的效率。噴霧干燥的10μm樹脂提供了52,000到59,000板數/M范圍的效率。當然，人們可以調整干燥的類型或結合各種類型的干燥方法來調節板數/M的范圍值。
計算填充效率的方法如下所示根據Agilent Chemstation軟件計算填充效率，它以總板數/米柱長度為基礎。計算如下所示N＝5.54(Tr/W1/2)2，其中Tr＝保留時間(分鐘)和W1/2＝在半峰高處測定的峰寬(分鐘)該值然后除以柱長度(米)，得到總板數/米。柱長度是25cm，所以各效率通過將以上方程式除以0.25M來計算。
在表7中示出了人胰島素評價比較的結果。如在表中所示，在所評價的整個流速范圍內，噴霧干燥的10μm聚合物材料提供了與競爭的10μm二氧化硅產品類似的效率。
表1成孔劑含量對牛胰島素的柱結合容量的影響
樣品1-1到1-6表示根據實施例2所述的本發明制備的材料，而樣品1-7到1-9表示根據美國專利No.6,387,974制備的材料。
表2牛胰島素的最終精加工色譜法
表3人胰島素的最終精加工色譜法
表4各種反相樹脂在DAC柱中的100巴活塞壓力下的壓力測試
表5柱效率的比較
表權利要求
1.一種制備大量的大孔色譜樹脂珠粒的改進方法，其中所述改進包括以不干擾所述珠粒的內部孔結構的方式從所述珠粒周圍去除溶劑。
2.權利要求1的方法，其中所述溶劑包括水和其中所述去除包括從所述珠粒中急驟干燥出所述水。
3.權利要求1的方法，其中所述去除包括微波干燥。
4.權利要求1的方法，其中所述去除包括噴霧干燥。
5.權利要求1的方法，其中所述去除包括冷凍干燥。
6.一種使用采用以不干擾所述珠粒的內部孔結構的方式從所述珠粒周圍去除溶劑的步驟的方法制備的大孔珠粒。
7.一種改進的色譜法，其中所述改進包括使用采用以不干擾所述珠粒的內部孔結構的方式從所述珠粒周圍去除溶劑的步驟的方法制備的大量的大孔珠粒。
8.權利要求7的方法，其中所述去除選自閃蒸出所述溶劑、冷凍干燥去除所述溶劑和微波干燥去除所述溶劑。
9.使用權利要求7的色譜法從其它化合物中分離出的生物分子、藥物、或藥物前體、或生物分子前體。
10.權利要求1的方法，其中所述珠粒通過種子發泡來制備。
11.權利要求8的方法，其中所述珠粒通過種子發泡來制備。
全文摘要
本發明提供了大孔聚合物的干燥方法，該方法為大孔聚合物提供了改進的性能特性。這些聚合物容易填充和特別可用于大規模的色譜柱。
文檔編號F26B5/06GK1821691SQ20051007383
公開日2006年8月23日 申請日期2005年5月24日 優先權日2004年5月25日
發明者J·R·費希爾, M·K·金澤, J·J·邁克納 申請人:羅姆和哈斯公司