合成核酸的方法

專利名稱：合成核酸的方法
技術領域：
本發明涉及由特異核苷酸序列構成的核酸的合成方法，一種有用的擴增核酸的方法。
背景技術：
基于核苷酸序列互補性的分析方法可直接分析遺傳特征。因此，該分析是一種鑒定遺傳疾病，癌變，微生物等非常強有力的方法。而且，檢測的對象是基因自身，所以某些情況下耗時而又繁瑣的操作過程如培養中的就可省略。
然而，當樣品中靶基因量非常少時一般不易檢測，因此必須對靶基因自身或其檢測信號進行擴增。作為擴增靶基因的方法，PCR(聚合酶鏈式反應)方法已為大家所知(Science，230，1350-1354，1985)。目前，PCR方法是體外擴增核酸序列最普遍的技術方法。指數式擴增結果使其具有高靈敏度的優點，所以該方法牢牢地確立了一種非常好的檢測途徑。此外，由于回收到的擴增產物可以是DNA，因此作為一種支持遺傳工程技術例如基因克隆和結構決定的重要工具，該方法得到了廣泛應用。然而PCR方法明顯有下述的問題實際操作中必須要用專門的溫度控制器；擴增反應的指數式上升導致在定量中產生問題；樣品和反應溶液易受到外部污染，使混入的核酸作為模板錯誤地運行。
基因組信息的日益增多，單核苷酸多態性(SNPs)分析逐步受到了注意。通過設計引物使其核苷酸序列包含SNPs，依靠PCR檢測SNPs是可行的。也就是，是否存在與引物互補的核苷酸序列可通過是否存在反應產物的決定得出推斷。然而，一旦PCR中偶然誤合成互補鏈，在接下去的反應中該產物以模板運行，就會造成錯誤的結果。實際應用中，據說引物末端僅一個堿基不同就很難嚴格控制PCR。因此，必須改進特異性使PCR應用于SNPs的檢測上。
一方面，實際中還在應用連接酶合成核酸的方法。LCR方法(連接酶鏈式反應(ligase chain reaction)，Laffler TG；Garrino JJ；Marshall RL；Ann.Biol.Clin.(Paris)，519，821-6，1993)是基于這樣的反應，該反應中兩個相鄰的探針與靶序列雜交并且通過連接酶互相連接。在缺少靶核苷酸序列的情況下所述兩探針不能被連接，因此連接產物的存在是靶核苷酸序列存在的象征。LCR方法也需要控制溫度用于從模板分離互補鏈，遇到PCR方法中相同的問題。對于LCR，有通過增加在相鄰探針間提供缺口并利用DNA聚合酶填補缺口的步驟以改進特異性方法的報道。該改進方法所期望的是特異性的改進，然而，由于需要控制溫度所以仍然存在問題。此外，使用額外酶導致費用增加。
稱為SDA的方法(鏈置換擴增，strand displacement amplification)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，392-396，1992][Nucleic.Acid Res.，20，1691-1696，1992]也是人們所知的擴增具有序列與靶序列互補的模板DNA的方法。SDA方法中，在替換雙鏈5’-側的序列時，用特定的DNA聚合酶從與某核苷酸序列3’-側互補的引物開始合成互補鏈。本發明中簡單表達5’-側和3’-側指的是模板鏈的，由于新合成的互補鏈替換了5’-側的雙鏈，稱該項技術為SDA方法。SDA方法中限制酶識別序列作為引物預先插入到退火序列中就可去除PCR方法中必須的溫度變化步驟。即通過限制酶生成的切口供給3’-OH基作為互補鏈的合成起點，并且先合成的互補鏈通過鏈置換合成得以釋放單鏈，接著再次作為模板用于下面的互補鏈合成。這樣，在SDA方法中就不需要PCR方法中所必須的復雜溫度控制。
然而在SDA方法中，除了鏈置換型DNA聚合酶，還要用到生成切口的限制酶。需要應用額外酶是導致較高費用的主要原因。此外，由于限制酶不是用來斷開兩條鏈，而是為產生切口(也就是僅斷開其中一條鏈)，dNTP衍生物例如α-硫代dNTP被用作合成的底物使其它鏈能抗該酶的消化。因此，SDA擴增產物與天然核酸結構不同，并且對用限制酶來斷裂或將擴增產物應用到基因克隆上存在限制。這方面也是導致費用較高的主要原因。另外，SDA方法應用在未知序列時，與用于引入缺口的限制酶識別序列相同的核苷酸序列可能存在于要被合成的區中。這種情況下，有可能阻止完全互補鏈的合成。
NASBA(基于核酸序列的擴增(nucleic acid sequence-based amplification)，也稱TMA/轉錄介導擴增方法)也是我們所知的擴增核酸方法，其中不需要復雜的溫度控制。NASBA是反應系統，其中DNA通過DNA聚合酶在以靶RNA為模板，加入有T7啟動子的探針而得以合成，第二探針進入雙鏈使產物得以生成，接著以生成的雙鏈DNA為模板通過T7 RNA聚合酶轉錄而擴增大量的RNA(Nature，350，91-92，1991)。NASBA需某些熱變性步驟直到雙鏈DNA形成，但是接下去的轉錄反應在等溫條件下通過T7 RNA聚合酶得以進行。然而必須要用多種酶組合例如反轉錄酶，RNase H，DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶，然后多種酶的組合與SDA相似這對于費用是不利的。而且由于設定多種酶的反應條件復雜，該方法很難作為一般的分析方法得以推廣。已知的核酸擴增反應中，還存在如上所述復雜的溫度控制及需用到多種酶的問題。
對這些已知的合成核酸的反應，很少有關于進一步改進核酸合成的效率而又不損失特異性或費用的嘗試的報道。例如在稱為RCA(滾環擴增，rolling-circle amplification)的方法中，顯示具有一系列核苷酸序列與掛鎖探針(padlock probe)互補的單鏈DNA在靶核苷酸存在下可被連續的合成(Paul M.Lizardi et al.，Nature Genetics，19，225-232，July，1998)。在RCA中，用到具有特殊結構掛鎖探針，其中在LCR中一條鏈的寡核苷酸每個5’-和3’-末端構成相鄰的探針。然后以掛鎖探針為模板通過結合聚合酶催化合成鏈置換型互補鏈的反應，合成互補鏈的連續反應得以啟動，該模板在靶核苷酸序列存在下被連接并環化。由此生成的單鏈核酸具有一種重復的連續的結構，每個區由相同的核苷酸組成。引物進一步被退火使該單鏈核酸合成其互補鏈，從而實現高度擴增。但仍存在需多種酶的問題。而且，互補鏈合成的啟動取決于連接兩鄰近區的反應，并且其特異性基本上與LCR中的相同。
為了提供3’-OH，在已知方法中在3’-末端提供給核苷酸序列與其互補的序列，并且在末端形成發夾環(Gene 71，29-40，1988)。以靶序列自身為模板互補鏈的合成在發夾環處開始形成由互補核苷酸序列構成的單鏈核酸。例如，在PCT/FR95/00891中同一鏈末端發生退火的結構與互補的核苷酸序列的連接已經實現。然而，末端消除與該互補鏈配對的堿基并且在同一鏈上重新再構成堿基配對，該方法中這步是必須的。據估計該步的運行取決于涉及堿基對配對的互相互補的核苷酸序列末端的一種微平衡狀態。也就是，在與互補鏈配對的堿基和同一鏈上配對的堿基間維持一種平衡狀態。利用這種平衡狀態并且僅與同一鏈中核苷酸退火的鏈是互補鏈合成的起點。于是，認為應設定嚴格的反應條件以獲得高的反應效率。進一步地，在先端技術中，引物自身形成一種環的結構。因此，一旦形成引物二聚物，不管是否存在靶核苷酸序列，擴增反應會自動開始，于是就會合成非特異性產物。這可是嚴重的問題。此外，引物二聚物的形成和接下來的非特異性合成反應中引物的消耗導致所需反應的擴增效率降低。
此外，有利用不充當DNA聚合酶模板的區來實現能與同一鏈退火的3’-末端結構的報道(EP713922)。由于生成二聚物引物，在末端動力平衡的利用及非特異性合成反應的可能性方面，該報道存在與上面所述的PCT/FR95/00891相同的問題。另外，不能為DNA聚合酶提供模板的區應被制成引物。
此外，將上述NASBA原理應用于各種信號擴增反應中，經常利用末端具有發夾結構寡核苷酸來提供雙鏈的啟動子區(JP-A 5-211873)。然而，這些并不是那些為互補鏈合成連續提供3’-OH的技術。而且，在JP-A 10-510161(WO96/17079)中用發夾環結構以達到獲得RNA聚合酶轉錄的DNA模板的目的，該發夾環結構在同一鏈3’-末端退火。模板通過轉錄成RNA和RNA到DNA反轉錄得以擴增。然而，該方法中，反應系統不結合大量的酶就不能被構成。

發明內容
本發明的目的是提供一種合成核酸的方法，該方法基于一種新的原理。更具體地的目的是提供一種能實現依靠序列高效合成核酸的低成本方法。也就是，本發明的目的是提供通過在一種單酶甚至等溫條件下完成核酸合成和擴增的方法。本發明的另一目的是提供一種核酸合成的方法，該方法可實現用已知的核酸合成反應原理很難達到的高特異性，還提供一種用該合成方法擴增核酸方法。
本發明人把注意力集中在該事實上，利用聚合酶催化鏈置換型的互補鏈合成而不需復雜的溫度控制，有益于核酸的合成。該DNA聚合酶是SDA和RCA中用到的酶。然而，即使用這樣的酶，在以引物為基礎的已知方法中總是需要另一種酶反應提供3’-OH作為合成的起點，例如SDA。
這些情況下，本發明人用與已知方法完全不同的方法討論了3’-OH的供給，結果發現通過利用具有特定結構的寡核苷酸，不需任何額外酶反應3’-OH就可被提供，由此得出本發明。即本發明涉及合成核酸的方法，通過用所述核酸合成方法擴增核酸的方法和應用所述方法的新寡核苷酸，如下所述
(1)合成在其一條鏈上具有交替連接之互補核苷酸序列的核酸的方法，所述方法包括a)提供一種核酸，其3′末端具有可與同一條鏈上的部分F1c退火的F1區，并且通過所述F1區與F1c的退火可形成包含了可進行堿基配對的F2c區在內的環；b)以與F1c退火的F1 3′末端為起點合成互補鏈；c)使在其3′末端包含與F2c區互補的F2序列的寡核苷酸退火并以該寡核苷酸為合成起點，通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成反應而進行互補鏈合成，以置換步驟b)中所合成的互補鏈；d)使一種多核苷酸退火并以其3′末端為合成起點，通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成反應而進行互補鏈合成，以置換步驟c)中所合成的互補鏈，其中所述多核苷酸在其3′末端包含一種與步驟c)中合成的互補鏈的任意區域互補的序列；(2)如(1)所述的方法，其中步驟d)中所述合成起點為同一鏈上3′末端的可與R1c區退火的R1區，通過R1與R1c的退火可形成包含了可進行堿基配對的R2c區在內的環。
(3)一種寡核苷酸，其至少由以下兩個區域X2及X1c構成，且X1c連接至X2的5′側，X2區具有與含特定核苷酸序列的核酸中任意X2c區互補的核苷酸序列；X1c區具有與含特定核苷酸序列的核酸中X2c區5′側的X1c區基本相同的核苷酸序列。
(4)如(1)所述的方法，其中步驟a)所述的核酸是通過以下步驟產生的第二核酸i)使如(3)所述寡核苷酸的F2區與作為模板的核酸中的F2c區退火，其中所述寡核苷酸中，X2區為F2區，X1c區為F1c區；ii)以所述寡核苷酸中的F2為起點合成具有與所述模板互補之核苷酸序列的第一核酸；iii)使步驟ii)中合成的第一核酸的任意區處于可進行堿基配對的狀態；
iv)使一種寡核苷酸退火并以該寡核苷酸為合成起點，合成第二核酸，并使該核酸3′末端的F1處于可進行堿基配對的狀態，其中所述寡核苷酸具有與步驟iii)中的第一核酸中可進行堿基配對的區域互補的核苷酸序列。
(5)如(4)所述的方法，其中步驟iii)中可進行堿基配對的區域為R2c，且步驟iv)中的寡核苷酸為如(3)所述的寡核苷酸，其中X2c區為R2c區，X1c區為R1c區。
(6)如(4或5)所述的方法，其中步驟iii)及iv)中可進行堿基配對的狀態通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成反應而產生，該反應的合成起點啟用兩種外引物一種是與模板中F2c的3′側退火的外引物，另一種是與作為步驟iv)中第一核酸合成起點的區域的3′側退火的外引物。
(7)如(6)所述的方法，所述反應中所用的每種寡核苷酸與其在模板中的互補區之間的解鏈溫度在相同嚴謹條件下存在以下的關系(外引物/模板3′側區)≤(F2c/F2及R2c/R2)≤(F1c/F1及R1c/R1)。
(8)如(4)-(7)中任一項所述的方法，其中所述作為模板的核酸為RNA，且步驟ii)中的互補鏈通過具有反轉錄酶活性的酶來合成。
(9)擴增在其一條鏈上具有交替連接之互補核苷酸序列的核酸的方法，所述方法通過重復以下步驟完成A)提供一種模板，使其3′末端和5′末端具有由互補于相同鏈上每一末端區的核苷酸序列組成的區，當這些互補核苷酸序列退火時，形成可在兩者之間進行堿基配對的環；B)以與同一鏈退火的上述模板的3′末端為合成起點合成互補鏈；C)使3′末端互補于3′末端側的環內核苷酸序列的寡核苷酸與環部退火，并以該寡核苷酸為合成起點，通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成反應而合成互補鏈，以置換步驟B)中合成的互補鏈，使其3′末端處于可進行堿基配對的狀態；D)使步驟C)中具有能進行堿基配對的3′末端的鏈作為(A)中的新模板。
(10)如(9)所述的擴增方法，其中步驟C)中寡核苷酸的5′末端具有一段與作為步驟B)之合成起始點的3末端互補的核苷酸序列。
(11)如(10)所述的擴增方法，進一步包含這樣的步驟以步驟C)中的寡核苷酸作為合成起始點合成的互補鏈用做步驟A)中的模板。
(12)如(9)所述的擴增方法，其中步驟A)的模板是通過如(5)所述方法合成的。
(13)如(1)或(9)所述的方法，其中鏈置換型互補鏈合成反應是在解鏈溫度調節劑的存在下實施的。
(14)如(13)所述的方法，其中解鏈溫度調節劑為甜菜堿。
(15)如(14)所述的方法，其中允許反應溶液中甜菜堿的濃度為0.2-3.0M。
(16)一種檢測樣品中靶核苷酸序列的方法，包括實施如(9)-(15)中任一項所述的擴增方法并觀察是否生成擴增產物。
(17)如(16)所述的方法，其中在擴增產物中加入包含與所述環互補的核苷酸序列的探針，進而觀察兩者之間的雜交。
(18)如(17)所述的方法，其中所述探針被標記在顆粒上，并觀察通過雜交而發生的聚集反應。
(19)如(16)所述的方法，其中如(9)-(15)中任一項所述的擴增方法在核酸檢測試劑的存在下實施，并根據該檢測試劑的信號變化來觀察是否生成擴增產物。
(20)用如(16)所述方法檢測靶核苷酸序列中的突變的方法，其中核苷酸序列中作為擴增對象的突變阻礙了組成該擴增方法的任一互補鏈的合成。
(21)合成在其一條鏈上具有交替連接之互補核苷酸序列的核酸的試劑盒，其包括以下組分i)如(3)所述的寡核苷酸，其中作為模板的核酸中F2c區域是X2c，位于F2c 5′端的F1c是X1c；ii)一種寡核苷酸，其包含互補于以i)的寡核苷酸為引物而合成的互補鏈中任意區域的核苷酸序列；iii)一種寡核苷酸，其具有與作為模板的核酸中F2c區3′側的F3c區互補的核苷酸序列；iv)一種用于催化鏈置換型互補鏈合成反應的DNA聚合酶，和，v)一種核苷酸，其作為組分iv)的底物。
(22)如(21)所述的試劑盒，其中ii)的寡核苷酸為如(3)所述的寡核苷酸，以i)的寡核苷酸為合成起點合成的互補鏈中任意R2c區為X2c，位于R2c 5′側的R1c為X1c。
(23)如(22)所述的試劑盒，進一步包含以下組分vi)一種寡核苷酸，其具有與用i)的寡核苷酸作為起點合成的互補鏈中任意R2c區3′側的R3c區互補的核苷酸序列。
(24)一種用于檢測靶核苷酸序列的試劑盒，其中在如(21)-(23)中任一項所述試劑盒的基礎上，還進一步包含用于檢測核酸合成反應產物的檢測試劑。
具有互補核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸是本發明合成的目的，該核酸指的是具有互相互補核苷酸序列并排連接在單鏈里的核酸。此外，本發明中它應包含用于在互補鏈間成環的核苷酸序列。本發明中該序列稱為成環序列。本發明合成的核酸基本上由通過成環序列連接的互相互補的鏈組成。一般而言，不管是否部分涉及堿基配對，一個在配對堿基分離時不能被分離成兩個或更多分子的鏈稱為單鏈。同一鏈中互補核苷酸序列可形成堿基配對。本發明通過容許具有核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸在同一鏈內堿基配對，可獲得分子內堿基配對的產物，該產物供給組成明顯雙鏈的區和不涉及堿基配對的環。
也就是，本發明具有互補核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸可被定義為單鏈核酸，其中包含能在同一鏈中退火的互補核苷酸序列，并且其退火產物，在彎曲鉸鏈部分組成不涉及堿基配對的環。具有互補核苷酸序列的核苷酸可退火成不涉及堿基配對的環。成環序列可以是任意的核苷酸序列。成環序列能堿基配對以啟動用于置換的互補鏈的合成。并優先地被提供與位于其它區的核苷酸序列不同的序列，以獲得特異性退火。例如，在一優選的實施方案中，成環序列基本上包含與F2c(或R2c)區相同的核苷酸序列，F2c(或R2c)區位于源于模板核酸的區(例如F1c或R1c)的3’-側，并在同一鏈內退火。
本發明中基本相同的核苷酸序列定義如下。也就是，當以某序列作為模板合成的互補鏈與靶核苷酸序列退火以供給合成互補鏈的起點時，該某序列基本上與靶核苷酸序列相同。例如，基本上與F2相同的序列不但完全包括與F2相同的序列，還包括能作為模板的核苷酸序列，所述模板能給出與F2退火的核苷酸序列并能作為合成互補鏈的起點。本發明術語“退火”指的是通過根據沃森-克里克定律的堿基配對，形成雙鏈結構的核酸。因此，即使組成堿基配對的核酸鏈為單鏈，如果分子內互補核苷酸序列堿基配對，退火也會發生。既然通過堿基配對核酸組成雙鏈結構，因此本發明退火和雜交有相同的意思。
本發明組成核酸的核苷酸序列對數至少為1。本發明所期望的模型，核苷酸序列對數可為1的整倍數。該情況中，本發明組成核苷酸的互補核苷酸序列對數理論上沒有上限，在由多組互補核苷酸序列構成的本發明合成產物核酸時，該核酸由重復相同的核苷酸序列組成。
本發明合成的具有互補核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸與天然存在的核酸不可能有相同的結構。已知當通過核酸聚合酶作用合成核酸時如果用核苷酸衍生物作為底物，就可合成核酸衍生物。所用核苷酸衍生物包括放射性同位素標記的核苷酸或結合配體標記的核苷酸衍生物例如生物素或地高辛。這些核苷酸衍生物可用于標記產物核酸。或者，如果底物是熒光核苷酸，則產物核酸可能為熒光衍生物。而且產物可為DNA亦可為RNA。生成的產物通過結合實現核酸聚合反應的引物結構，聚合反應底物類型，聚合反應的試劑而定。
利用DNA聚合酶能啟動有上述結構的核酸的合成，該DNA聚合酶具有鏈置換活性以及F1區具備在3’-末端與同一鏈上的部分F1c區退火形成包含可堿基配對的F2c區在內的環。有許多關于互補鏈合成反應的報道，其中形成發夾環，以發夾環序列自身為模板，而本發明中提供給發夾環部分能堿基配對的區，并且具有在合成互補鏈時利用該區的新特點。通過將該區用作合成的起點，先前以發夾環序列自身為模板合成的互補鏈被替換。接著位于替換鏈3’-末端R1c區(任意區)處于一種可堿基配對的狀態。具有與該R1c互補序列的區通過退火進行互補鏈合成，導致生成核酸(2分子)，該核酸具有從F1延伸到R1c的核苷酸序列和其互補鏈通過成環序列通過彼此結合而形成。本發明中可任意地選擇任意區例如上面R1c，如果它可與該區互補的核苷酸序列的多核苷酸退火。并且以多核苷酸為合成起點合成的互補鏈，該合成的互補鏈對本發明具有必不可少的作用。
本發明用到術語“核酸”，本發明核酸通常既包括DNA又包括RNA。
然而，功能為合成互補鏈的模板的，來自天然DNA或RNA的其核苷酸被人工衍生物所替換的核酸或修飾核苷酸也包括在本發明的核酸范圍中。通常本發明的核酸被包含于生物樣品中，生物樣品包括動物，植物或微生物的組織，細胞，培養物和分泌物，或它們的提取物。本發明的生物樣品包括細胞內寄生物基因組DNA或RNA例如病毒或支原體。本發明的核酸一般由包含在所述生物樣品的核酸衍生而來。例如由mRNA合成cDNA，基于生物樣品衍生來的核酸而擴增的核酸，是本發明的核酸的典型實例。
本發明核酸的特征是在3’-末端被提供F1區，可與同一鏈上的部分F1c退火，通過該F1區與同一鏈上的F1c退火，可形成包含可堿基配對的F2c區在內的環，可在各種方法中得到該核酸。在最優選的實施方案中，利用有下述結構的寡核苷酸，通過合成互補鏈的反應可提供該結構。
也就是，本發明有效的寡核苷酸至少由下面兩個區X2和X1c構成，其中X1c與X2的5’-側相連。
X2區具有與核酸中X2c區互補的核苷酸序列，所述核酸具有特異核苷酸序列。
X1c區有與X1c區基本上相同核苷酸序列，所述X1c區位于具有特異核苷酸序列的核酸里X2c區5’-側。
此處通過本發明寡核苷酸結構所決定的具有特異核苷酸序列的核酸指的是以本發明寡核苷酸為引物時充當模板的核酸。在基于本發明的合成方法檢測核酸情況中，所述具有特異核苷酸序列的核酸是檢測的靶子或是檢測靶子衍生的核酸。具有特異核苷酸序列的核酸指的是其中至少一部分核苷酸序列是公開的或可預言的。公開的部分核苷酸序列是X2c區和位于其5’-側X1c區。可推測這2個區是鄰近的或隔開存在的。通過兩區的相對位置，可由產物核酸自我退火時，形成的環部狀態來決定。優選兩區的距離是互相分離不太遠以便使核酸產物自我退火優先于分子間的退火。因此，兩區位置關系優選的是鄰近的，距離通常為0到500堿基。然而，在下述自我退火成環中，有這樣的情況，預計的所述兩區相互太近的狀態下將不利于環的形成。在環中，需要一種新寡核苷酸退火和以所述寡核苷酸為合成的起點順利啟動鏈置換的互補鏈反應的結構。更優選的是，X2c區和位于其5’-側X1c區的距離設計成0到100個堿基，更期望是10到70個堿基。數值為不包括X1c和X2的長度。構成環部分的堿基數該長度加上相當于X2的區。
組成基于本發明所述寡核苷酸的核苷酸序列特征所用術語“相同的”和”互補的”并不意味著絕對相同和絕對互補。也就是，與某序列相同的序列包括與某序列退火的核苷酸序列互補的序列。另一方面，互補序列是嚴格條件下能退火的序列，提供作為互補鏈合成的起點3’-末端。
通常，對于具有特異核苷酸序列的核酸，組成本發明寡核苷酸的X2區和X1c區位置鄰近而沒有重疊。如果核苷酸序列中有共同部分，兩區就會有部分覆蓋，由于X2起到引物的功能，它總是3’-末端。另一方面，如下所述X1c將引物的作用供給互補鏈3’-末端，該互補鏈由核酸為模板合成，因此應被設計在5’-末端。以該寡核苷酸為合成的起點得到互補鏈，在下一步中以該互補鏈為模板合成反向互補鏈。并且最終本發明寡核苷酸部分為模板被拷貝進互補鏈。拷貝生成的3’-末端有核苷酸序列X1，該序列在同一鏈中與X1c退火成環。
本發明中，寡核苷酸是滿足兩個要求的核苷酸，即必須能形成互補堿基配對，并且在3’-末端供給-OH基為互補鏈合成的起點。因此，其主鏈并不必限于磷酸二酯鍵一種連接。例如，它可由硫代磷酸衍生物組成主鏈或者是基于肽連接的肽核酸，所述硫代磷酸衍生物為S取代P。堿基是指那些可互補配對的堿基。天然存在五種堿基，即A，C，T，G和U，堿基也可為類似物例如溴脫氧尿苷。優選的是，本發明寡核苷酸不僅可用做合成的起點還可為互補鏈合成的模板。本發明術語多核苷酸包括寡核苷酸。本發明所用術語“多核苷酸”的鏈長沒有被限制，而所用術語“寡核苷酸”指的是有相對短的鏈長的核苷酸聚合物。
下述各種核酸合成反應中在給定的條件下，本發明寡核苷酸鏈有能與互補鏈堿基配對并保持一定的特異性這樣一種長度。具體地，它由5-200個堿基組成，更優選10-50個堿基對。識別已知聚合酶的鏈長至少為5個堿基。該聚合酶催化依靠序列的核酸合成反應。所以退火部分的鏈長應長于該長度。另外，統計學上所期望10個堿基的長度或更長以獲得所期望核苷酸特異性。另一方面，由于化學合成制備太長核苷酸序列比較困難。因此上述鏈長是所期望范圍的實例。例證的鏈長指的是部分與互補鏈退火的鏈長。正如下面所描述的，本發明寡核苷酸可最終至少分別與兩區退火。因此，這里例證的鏈長應理解為組成寡核苷酸的每個區的鏈長。
此外，本發明的寡核苷酸可用已知的標記物標記。標記物包括結合配體例如地高辛和生物素，酶，熒光物，發光物，放射性同位素。眾所周知通過熒光類似物替換組成寡核苷酸的堿基的技術(WO95/05391，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，6644-6648，1994)。
本發明其它寡核苷酸還可被結合到固相。或者，寡核苷酸的任意部分可用結合配體標記，例如生物素，間接地由結合配體例如固定抗生物素蛋白所固定。固定寡核苷酸為合成的起點時，合成反應產物核酸為固相所捕獲，有利于其分離。通過核酸特異性指示物或與標記探針的雜交可對分離部分進行檢測。靶核酸片段由任意限制酶消化產物還可得以回收。
本發明所用術語“模板”是指用于合成互補鏈時作為模板的核酸。具有核苷酸序列與模板互補的互補鏈意思是指對應于模板的鏈。但是二者的關系只是相對的。即合成的互補鏈可以再次起到模板的功能。也就是，互補鏈可作為模板。
本發明有用的寡核苷酸并不限于上述2區，可包含額外區。將X2和X1c分別設計到3’-和5’-末端，任意序列可在其間插入。例如它可是限制酶的識別序列，RNA聚合酶所識別的啟動子，或編碼核酶的DNA。通過利用其作為限制酶的識別序列，本發明合成的具有互補的序列交替地連接到單鏈里的核酸可被斷裂成同樣長度的雙鏈核苷酸。將啟動子序列設計成RNA聚合酶能識別的，本發明的合成產物作為模板以允許進一步轉錄成RNA。還可通過設計編碼核酶的DNA，轉錄產物自斷裂的系統就可實現。這些額外核苷酸序列是那些在形成雙鏈后發揮作用的序列。因此，在本發明單鏈核苷酸成環時，這些序列不起作用，直至核酸被延伸并在缺環情況下退火成具有互補核苷酸序列的鏈時才發揮作用。
當啟動子與基于本發明的寡核苷酸以允許合成區轉錄的方向進行結合時，本發明在相同核苷酸序列被重復的部位的反應產物實現高效轉錄系統。通過將該系統與合適的表達系統結合，就可翻譯蛋白。即利用該系統在細菌或動物細胞或在體外轉錄和翻譯成蛋白。
可化學合成本發明具有上述結構的寡核苷酸。或者，天然核酸由例如限制酶斷裂可以改變上述的堿基序列的組成或它們的連接方式。
本發明實施合成反應的基本原理參考圖5-圖6，該反應通過利用上述有用的寡核苷酸與DNA聚合酶結合得以實施，在核酸合成反應中該DNA聚合酶有鏈置換反應的活性。首先X2(相應于F2)作為模板，上述寡核苷酸(圖5中的FA)與模板核酸退火，以提供互補鏈合成的起點。圖5中由FA合成起點合成的互補鏈被由外引物(F3)合成的互補鏈(下述)所替換而形成單鏈(圖5-A)。在進一步合成互補鏈時，該互補鏈與正生成的互補鏈互補，圖5-A合成的互補鏈核酸3’-末端有與本發明寡核苷酸互補的核苷酸序列。即由于本發明寡核苷酸5’-末端有與X1c區(相應于F1c)相同的序列。如此合成的核酸3’-末端有互補序列X1(F1)。圖5顯示從R1為合成起點合成的互補鏈被由外引物R3為合成起點合成的互補鏈所替換。一旦3’-末端部分通過該替換使其可堿基配對，在同一鏈上的3’-末端X1(F1)與X1c(F1c)退火，進行以自身為模板的延伸反應(圖5-B)。然后，位于其3’-末端的X2c(F2c)形成環，該環不涉及堿基配對。本發明寡核苷酸中X2(F2)退火成該環，以所述寡核苷酸為合成起點合成互補鏈(圖5-B)。以先合成的產物為模板的合成反應的產物，通過鏈置換反應被替換使其堿基配對。
本發明通過用一種基本組成為可進行核酸合成的任意反向引物，其中所述核酸是以該寡核苷酸為引物合成的互補鏈用作模板。大多數核酸合成產物如圖6中所示的可被得到。從圖6中可看出，(D)是本發明所期望的核酸產物，具有互補的核苷酸序列交替地連接在單鏈里。通過處理例如熱變性一旦轉變成單鏈，其它產物(E)再次作為形成(D)的模板。如果雙鏈產物(D)核酸通過熱變性被轉換成單鏈，同一鏈內發生退火高幾率而不能形成最初的雙鏈。這是因為具有相同解鏈溫度(Tm)的互補鏈的分子內反應優先于分子間反應進行。從同一鏈中退火產物(D)衍生的每一條單鏈在同一鏈中被退火，并且返回到(B)狀態。每條鏈進一步分別供給一個(D)分子和(E)分子。通過重復這些步驟，有可能連續合成具有互補核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸。在1循環中形成的模板和產物以指數形式增加，因此使反應非常有效。
為實現圖5(A)狀態，最初合成的互補鏈，至少在反向引物退火的部分，可堿基配對。該步可通過任意方法得以完成。針對最初的模板，尤其準備了一個外引物，該外引物比由本發明寡核苷酸退火的F2c區在模板上更與3’-側的F3c區退火。如果通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成，將該外引物用作合成的起點以合成互補鏈，本發明從F2c為合成起點合成的互補鏈被替換，結果通過R1與R1c區退火使其堿基配對(圖5)。通過利用鏈置換反應，直到現在在等溫條件下該反應可得以進行。
在使用外引物時，在從F2c合成之后開始進行從外引物(F3)的合成。在最簡單的方法中，使內引物濃度高于外引物的濃度。特定地，所用引物通常在2倍到50倍，優選4倍到10倍的濃度，因此反應可按所期望的進行。此外，設置外引物解鏈溫度(Tm)低于內引物中X1的Tm(相當于F1和R1)，因此可以控制合成的時間。也就是，(外引物F3F3c)≤F2c/F2)≤(F1c/F1)或(外引物/在模板3’-側的區)≤(X2cX2)≤(X1cX1)。這里，(F2c/F2)≤(F1c/F1)是因為F1c/F1間退火優先與F2退火成環，F1c/F1間退火是分子內的反應，并可因此高幾率優先進行。然而，為了給出更多的反應條件而考慮到Tm是有意義的。甚至在設計反向引物中，相似的反應條件理所當然的應考慮到。通過利用這種關系，可獲得統計學上理想反應的條件。如果其它條件不變，通過結合退火的互補鏈的長度和組成堿基配對的堿基，理論上解鏈溫度(Tm)可以被計算出來。因此，那些本領域的技術人員根據公開的本說明書能導出更好的條件。
此外，稱為鄰近堆積的現象控制外引物退火時間的選擇。鄰近堆積使不能獨立退火的寡核苷酸在鄰近雙鏈部分上能退火的現象(ChiaraBorghesi-Nicoletti et al.，Bio Techniques，12，474-477(1992))。即外引物設計成鄰近F2c(X2c)并且不能獨立地退火。通過這樣做，直到F2c(X2c)退火時，最初的外引物才能退火，因此F2c(X2c)的退火優先進行，根據這一原則，實例顯示作為一系列反應引物的必需寡核苷酸的核苷酸序列所設置。該步驟在通過加熱變性或用DNA解旋酶也可得以實現。
如果具有F2c(X2c)的模板核酸為RNA，圖5-(A)狀態也可通過不同的方法實現。例如，如果該RNA鏈被分解，使R1可堿基配對。也就是使F2與RNA中F2c退火并且通過反轉錄酶合成的互補鏈為DNA。通過堿變性或用核糖核酸酶處理作用于DNA/RNA雙鏈中的RNA，作為模板的RNA被分解，其中從F2合成的DNA形成單鏈。由于酶選擇性分解雙鏈DNA/RNA中的RNA，RNase H的某些反轉錄酶或核糖核酸酶活性得以應用。這種方式中，使反向引物與能堿基配對的R1c退火。因此，不必需要導致R1c處于堿基配對的外引物。
或者，反轉錄酶鏈置換活性可被用在通過如上述外引物的鏈置換，這種情況中，反應系統可僅通過反轉錄酶構成，即用RNA為模板，通過反轉錄酶在模板中F2與F2c的退火有可能合成互補鏈和從退火為F3c外引物F3為合成起點合成互補鏈以及同時替換先前合成的互補鏈，外引物F3位于F2c的3’-側。當反轉錄酶以DNA為模板進行合成互補鏈的反應時，所有通過反轉錄酶進行合成互補鏈的反應包括以與R1c退火的R1作為合成起點的互補鏈的合成，該互補鏈在鏈置換反應中作為模板；以與R3c退火的R3作為合成起點的互補鏈的合成及同時的鏈置換發應，R3位于R3c的3’-側。在所給反應條件下不能預計反轉錄酶顯示DNA/RNA鏈置換活性時，可以結合具有如上述鏈置換活性的DNA聚合酶。如上述以RNA為模板獲得第一條單鏈核酸的模式為本發明的優選模式。另一方面，如果使用既具有鏈置換活性又有反轉錄酶活性的DNA聚合酶諸如Bca DNA聚合酶，通過相同的酶不但從RNA的第一條單鏈核酸的合成，而且接下去以DNA為模板的反應可得以類似地進行。
通過利用有特定結構的反向引物，本發明上述反應方式導致各種內在的變化。最有效的變化在下面描述。也就是，組成[5]中所描述的寡核苷酸在本發明最有利的模型中用作反向引物。[5]中的寡核苷酸是其中以F2為引物合成的互補鏈中的任意區R2c和R1c分別為X2c和X1c的一種寡核苷酸。通過使用這樣反向引物，有意義鏈和反義鏈中發生一系列反應(向前的和反向的)，所述一系列反應是指成環反應和從該環合成和替換互補鏈的反應。結果本發明中有效合成核酸的反應得到大大改善，該核酸具有互補核苷酸序列交替地連接在單鏈上，而等溫條件下一系列這樣的反應是可以進行的。在下文中，作為參考更具體地描述了

圖1到3所概述的該模型。
下面模型中，基于本發明的2種寡核苷酸得以制備。為了說明，將其命名為FA和RA.組成FA和RA的區如下所述X2 X1cFA F2 F1cRA R2 R1c這里，F2是模板核酸中F2c區的互補核苷酸序列。R2與任意區R2c互補的核苷酸序列，R2c包含在以F2為引物合成的互補鏈中。F1c和R1c分別是位于F2c和R2c下游的任意核苷酸序列。F2和R2間的距離可是任意的。即使其長度約1kbp，合適的條件下，充分合成是可行的，盡管取決于用于實施合成互補鏈的DNA聚合酶的合成能力，特定地，當用到Bst DNA聚合酶時，如果F2和R2c的距離為800bp，優選500bp或更小，就一定能合成所需的產物。涉及溫度循環的PCR中，通過重點改變溫度使酶活性得到降低被認為是降低了長核苷酸序列合成效率。在本發明優選的模式中，擴增核酸步驟中不需要溫度循環，因此甚至長核苷酸序列的合成和擴增可確信能實現。
首先，針對模板核酸使FA中F2退火，并用作互補鏈合成的起點。接下去直到圖1(4)的反應步驟與本發明先前所述的基本模型(圖5)相同。圖1(2)中退火序列為F3，就是上述的外部引物。用以該引物為合成起點進行鏈置換型互補鏈合成反應的DNA聚合酶從FA合成的互補鏈被置換并且處于堿基配對。
當(4)中R2c處于堿基配對時，在R2c/R2的結合里反向引物RA于此退火。以該位置為合成起點進行互補鏈的合成直到該鏈延伸到在FA 5’-末端的F1c。在該合成互補鏈的反應之后，用于替換的外引物R3在此退火合成互補鏈，在此期間鏈置換也在進行，使從RA為合成起點合成的互補鏈作被替換。由此替換的互補鏈中，RA位于其5’-端，與FA互補的序列位于其3’-端。
因此在被替換的單鏈核酸3’-側，同一鏈上存在有與F1c互補的F1序列。F1迅速與同一分子內排列的F1c退火以啟動互補鏈的合成。當在同一鏈中3’-末端(F1)與F1c退火時，形成含F2c的環。正如圖2-(7)明確顯示的，該環部分可堿基配對。本發明的寡核苷酸FA與該環部分退火，并作為互補鏈(7)的合成起點，所述寡核苷酸具有與F2c互補的序列。當在先前從F1啟動的互補鏈合成中的反應產物被替換時，從環進行互補鏈的合成。結果自身為模板合成的互補鏈在3’-末端再次可堿基配對。該3’-末端被提供同一鏈中能退火到R1c的R1區，并且由于分子內的反應迅速，所述兩鏈被優先退火。與上述反應相同的從以FA為模板合成的3’-末端開始的反應也在該區得以進行。結果，通過連續的合成互補鏈及接下去的置換，本發明具有互補核苷酸序列交替地連接到相同單鏈的核酸，從3’-末端R1為起始點得以繼續延伸。由于R2c總是被包含在通過3’-末端R1的分子內退火形成的環中，在接下去的反應中提供R2的寡核苷酸(RA)在3’-末端退火成環。
當注意力集中在從寡核苷酸開始被合成為互補鏈核酸時，該核酸以自身為模板得以延伸，所述寡核苷酸在單鏈核酸中退火成環，本發明具有互補核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸的合成也在進行。即當自環的互補鏈的合成到圖2-(7)中RA時，合成得以完成。然后，當通過該核酸替換的核酸的合成啟動互補鏈(圖3-(8))合成時，反應到達曾作為合成起點的環，并且替換重新開始。這種方式中，從環開始被合成的核酸也被替換。結果得到同一鏈中能退火的3’-末端R1(圖3-(10))。該3’-末端R1在同一鏈中與R1c退火以啟動互補鏈的合成。除了用F替代R外該反應與圖2-(7)中的相同。因此，圖3-(10)所示結構有起到新核酸的作用得以繼續自我延伸并形成新的核酸。
與上述反應相反，從圖3-(10)所示的核酸啟動合成核酸的反應，導致從合成起點3’-末端F1開始延伸，也就是說，本發明中一個核酸被延伸，繼續提供能啟動延伸的新核酸的反應分別進行，而且，隨著鏈的延伸，不僅在末端而且在同一鏈上產生許多成環序列，當這些成環序列經鏈置換反應可堿基配對時，寡核苷酸退火充當形成新核酸的反應的起點。通過不但在末端而且在鏈內開始的合成反應，獲得進一步有效的擴增。基于本發明的寡核苷酸RA被結合為如上所述的反向引物，其中延伸和隨后新核酸的形成得以進行。而且，本發明中該新形成的核酸本身得到了延伸，也導致了后面新核酸的形成，一系列這樣的反應，理論上可永久地獲得非常有效的核酸擴增。另外，本發明的反應可在等溫條件下進行。
因此，積累的反應產物具有一種結構，該結構在F1和R1間具有核苷酸序列，并且其互補鏈交替地連接，然而，重復單元兩末端均有由連續核苷酸序列F2-F1(F2c-F1c)或R2-R1(R2c-R1c)組成的區，例如，圖3-(9)中，序列(R2-F2c)-(F1-R2c)-(R1-F1c)-(F2-R2c)自5’-側按照這樣的順序連接。這是因為基于本發明的擴增反應以這樣一種原理進行，即反應以寡核苷酸作為合成起點從F2(或R2)開始，接著，互補鏈通過以自身3’-末端作為合成起點從F1(或R1)合成的反應得以延伸。
這里，在最優選的模型中，本發明寡核苷酸FA和RA為退火成環部分的寡核苷酸。然而即使不使用這些具有限制結構的寡核苷酸，本發明擴增反應可通過利用能啟動自環開始的互補鏈合成的寡核苷酸而得以實現，也就是，正在延伸的3’-末端，一旦被自從環開始合成的互補鏈所替換，就又一次供給環部分。因為從環開始的互補鏈合成中總是以具有互補核苷酸序列交替地連接到單鏈里核酸作為模板。很明顯，可以合成本發明所需核酸。然而，如此合成的核酸通過置換后形成環進行互補鏈的合成。但是沒有可用于接下去形成環的3’-末端，因此不能作為新模板使用。所以不象通過FA或RA啟動合成的核酸，這種情況中的產物，不能得到所希望的指數式擴增。由于這種原因，具有FA或RA結構的寡核苷酸可用于高效地合成本發明的核酸。
一系列這樣的反應通過下面的描述得以進行，向模板單鏈核酸添加下面的成分，并接著在組成FA和RA的核苷酸序列與其互補核苷酸序列能形成穩定堿基配對而酶的活性能得以保持的這樣一種溫度下培養混合物。
·4種寡核苷酸FA，RA，外引物F3，和外引物R3，·用于進行置換型互補鏈合成的DNA聚合酶，·用作DNA聚合酶底物的寡核苷酸。
因此，無需設定PCR之類的溫度周期。穩定的堿基配對這里指的是反應系統中至少一部分寡核苷酸可提供互補鏈合成起點的狀態。例如，能導致穩定堿基配對所需條件將溫度設置為低于解鏈溫度(Tm)。一般而言，解鏈溫度(Tm)是具有互補核苷酸序列的核酸有50％堿基配對。本發明中將溫度設定為解鏈溫度(Tm)或低于解鏈溫度不是最重要的條件，但被認為是達到高效合成的一個反應條件。如果所用模板核酸是雙鏈，所述核酸至少在寡核苷酸退火區的應可堿基配對。由于這個原因，一般進行熱變性，并且在反應開始前作為預處理僅進行一次。
該反應在下面成分存在下進行，能使酶反應處于合適pH值的緩沖液，退火或維持酶催化活性的必需鹽，保護酶的介質以及調控解鏈溫度(Tm)所必須的調控物。對于緩沖液，例如所用的在中性或弱堿性范圍有緩沖作用的Tris-HCl。根據所用的DNA聚合酶調節pH值，對于鹽，KCl，NaCl，(NH4)2SO4等適量加入以保持酶的活性并調控核酸的解鏈溫度(Tm)，保護酶的介質使用牛血清白蛋白或糖類。此外，一般用二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺作為解鏈溫度(Tm)的調控物。通過利用解鏈溫度(Tm)的調控物在限定的溫度條件下寡核苷酸的退火得到了調控。而且，甜菜堿(N，N，N-三甲基甘氨酸)或四烷基銨鹽(tetraalkyl)通過其等穩定作用(isostabilization)對于改善鏈置換的效率也是有效的。通過向反應溶液中加入0.2-3.0M甜菜堿，優選0.5-1.5M，可得到所希望的本發明對核酸擴增的促進作用。因為這些解鏈溫度的調控物有降低解鏈溫度的作用，那些合適的嚴謹性和反應性條件要結合鹽的濃度，反應溫度等憑經驗而定。
本發明重要的特征是除非許多區的位置關系得以保持，否則一系列反應不能進行。由于這個特征，伴隨互補鏈非特異合成的非特異合成反應得到了有效阻止。也就是即使發生某非特異反應，在合成接下去的擴增步驟中產物作為起始物質的可能性也得到了降低，而且，通過許多區調控反應的進展，有可能導致在類似的核苷酸序列中能精確的鑒定出所需產物的檢測系統可被隨意地組成。
利用所述特征檢測基因突變。本發明使用外引物模式中，所用4個引物，即2個外引物和本發明寡核苷酸組成的2引物。若所述6區包含在4個寡核苷酸中不起作用的話，則本發明的合成反應不能進行。具體地，作為互補鏈合成起點的每個寡核苷酸3’-末端的序列和以所述互補鏈為合成起點的序列X1c區5’-末端的序列是重要的序列。因此設計這些重要的序列使相對應的突變能被檢測，本發明合成反應的產物能得以觀察，存在或不存在諸如堿基缺失或插入的突變、或諸如SNPs的遺傳多態性可得到廣泛的分析。更具體地，設計估計有突變或多態性的堿基使其與作為互補鏈合成起點的寡核苷酸3’-末端附近的或在互補鏈作為合成起點的5’-末端的堿基相當，如果在互補鏈合成起點的3’-末端或其附近存在誤配，互補鏈合成核酸的反應受到明顯地抑制。本發明中除非初始反應中產物末端的結構導致重復反應，否則不會得到高度擴增的反應。因此，甚至在發生錯誤合成時，構成擴增反應的互補鏈的合成在某步驟中總是被中斷，因此，在誤配的情況下不會存在高度擴增的反應。結果是誤配有效地抑制了擴增反應，最終導致產生準確的結果。也就是可以說基于本發明的核酸的擴增反應對核苷酸序列的檢查有一高度完整的機制。這些特征是在諸如擴增反應僅在2個區進行的PCR方法中很難預料到的優點。
合成互補序列后，顯示本發明所用寡核苷酸特征的X1c區可作為合成的起點，并且該互補序列與新合成的同一鏈中X1序列退火，其中的合成反應以自身為模板進行的。因此，即使形成在前沿領域研究中常常成為問題的所謂的引物二聚物，該寡核苷酸不能成環。因此，歸因于引物二聚物形成的非特異性擴增，在理論上是不能發生的。由此，所述寡核苷酸有助于改善該反應的特異性。
此外，本發明所示外引物F3(圖1-(2))或R3(圖2-(5))被結合并由此使上述一系列反應在等溫條件下得以進行。也就是，本發明提供一種擴增具有互補序列交替地連接在單鏈里的核酸的方法。其中包含在上述9中所示的步驟。該方法中，在F2c/F2間，R2c/R2間，F1c/F1間及R1c/R1間選擇能發生穩定退火的溫度條件，通過在F2c/F2和R2c/R2的退火而分別地促進鄰近堆積(contiguous stacking)現象優選的是確定在F3c/F3和R3c/R3間退火。
本發明用到術語核酸“合成”和“擴增”。本發明核酸的合成指的是從作為合成起點的寡核苷酸開始的核酸延伸。如果不但所述合成而且其它核酸的形成以及所形成核酸的反應的延伸能夠連續進行，一系列這樣的反應廣義上稱為擴增。
所產生的單鏈核酸在3’-末端有能與同一鏈中F1c部分退火的F1區，進行同一鏈中F1區與F1c的退火，能形成含有可堿基配對的F2c區的環，是本發明重要的成分。這樣的單鏈核酸還可以下述原理的方式供給。也就是，互補鏈的合成根據具有下述結構的引物才容許進行。5’-[與引物中X1c區退火的X1區]-[能形成堿基配對序列環]-[X1c區]-[具有與模板互補的序列區]-3’。
制備具有與模板互補的序列區，兩個核苷酸序列，即一個核苷酸序列(引物FA)與F1互補并且一個核苷酸序列(引物RA)與R1c互補。組成要合成核酸的核苷酸序列組成包含從F1區延伸到R1c區的核苷酸序列和從具有與該核苷酸序列互補的核苷酸序列的R1區延伸到F1c區的核苷酸序列。能在引物內退火的X1c和X1可為任意的序列。然而，在引物FA和RA間的區內，優選的是使該X1c/X1區的序列不同。
首先，通過引物FA從模板核酸F1區進行互補鏈的合成，接著在已合成的互補鏈中R1c區可堿基配對，使其它引物退火形成互補鏈的合成起點，該步驟中合成的互補鏈3’-末端有與組成起始合成鏈5’-末端的引物FA互補的序列。因此在其3’-末端被提供X1區，其中X1區在同一鏈中與X1c區退火成環。由此提供本發明特征性3’-末端的結構，接下去的反應組成先前顯示為最優選模式的系統。退火成環部分的寡核苷酸在3’-末端被提供X2區，在5’-末端被提供X1區，X2區與環中X2c區互補。在先前的反應系統中，用引物FA和RA合成與模板核酸互補的鏈，將環結構供給核酸的3’-末端。該方法中，通過很短的引物就可有效地提供本發明特征性末端結構。另一方面，所述模型中，組成環的全部核苷酸序列可作為引物被提供，并且必須合成長引物。
如果包含限制酶識別區的核苷酸序列可用作反向引物，則可構建本發明不同的模型。利用包含限制酶識別序列的反向引物的反應參考圖6具體描述。當圖6-(D)得以完成時，通過限制酶產生切口相當于反向引物中限制酶識別位點。以該切口為合成起點開始合成鏈置換型互補鏈的反應。因為反向引物位于組成(D)的雙鏈核酸的兩末端，合成互補鏈的反應也可從兩末端開始，盡管基本上基于先端技術中所述的SDA方法，本發明作為模板的核苷酸序列具有互補核苷酸序列交替地連接的結構，從而構成本發明獨一無二的核酸系統。作為要產生切口的反向引物互補鏈的一部分應被設計為結合dNTP衍生物，通過限制酶阻止雙鏈斷裂產生對核酸酶一種對抗性。
也可能將RNA聚合酶啟動子插入反向引物。圖6-(D)中從兩末端的轉錄通過RNA聚合酶識別該啟動子得以進行，在該情況中與先前應用SDA的模型非常相似。
本發明合成的核酸是單鏈，就單鏈而言，由互補核苷酸序列構成，其大部分均為堿基配對的。通過利用這個特征，對合成的產物可進行檢測。通過實施本發明合成核酸的方法，在有熒光色素作為雙鏈特異性嵌入劑(double-specific intercalater)例如溴化乙錠，SYBR Green I或Pico Green，隨著產物的增加可觀察到熒光的強度增加。通過監測它，就可能在封閉系統中跟蹤實時(real-time)合成反應。也可考慮在PCR方法中應用該類型的檢測系統，但是認為有許多問題，因為不能區分產物信號和引物二聚物的信號等。然而，當本發明應用該系統時，增加非特異堿基配對的能力非常低，因此，預計高靈敏度和低干擾可能同時能獲得，與應用雙鏈特異性嵌入劑(double-specific intercalater)相似，在同一系統中可利用熒光能量的轉移用于實現檢測系統的方法。
本發明合成核酸的方法通過DNA聚合酶催化合成鏈置換型的互補鏈反應而得到支持。上述反應期間，也包含不必需鏈置換型聚合酶的反應步驟。然而，為了組成試劑的簡單化及經濟的觀點，使用一種DNA聚合酶有利，該種DNA聚合酶，下列的酶是已知的。此外，本發明范圍中可利用這些酶的各種突變體，它們都具有用于互補鏈合成的序列-依賴活性和鏈置換活性。其中突變體指的是包括那些僅具有導致酶所需的催化活性的結構或那些通過例如氨基酸中突變對催化活性，穩定性或熱穩定性所進行的修飾的突變體。
Bst DNA聚合酶Bca(exo-)DNA聚合酶DNA聚合酶I克列諾(Klenow)片段Vent DNA聚合酶Vent(Exo-)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Vent DNA聚合酶)Deep Vent DNA聚合酶Deep Vent(Exo-)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Deep Vent DNA聚合酶)Φ29 phage DNA聚合酶MS-2 phage DNA聚合酶Z-Taq DNA聚合酶(寶酒造)KOD DNA聚合酶(東洋紡績)這些酶中，Bst DNA聚合酶和Bca(exo-)DNA聚合酶是特別所需的酶，因為它們具有某種程度的熱穩定性和高催化活性。在優選的實施方案中，本發明的反應可等溫的實現，但由于解鏈溫度的調節(Tm)等，不可能總是能利用所需溫度條件來維持酶的穩定。因此，它是酶的熱穩定所需的條件之一。盡管等溫反應是可行的，熱變性可提供核酸作為最初的模板，在這方面，熱穩定酶的使用拓寬了試驗方案的選擇。
Vent(Exo-)DNA聚合酶是既有鏈置換活性又有高度熱穩定性的酶。已知涉及通過DNA聚合酶鏈置換的互補鏈合成反應通過加入單鏈結合蛋白得到促進(Paul M.Lizardi et al.，Nature Genetics，19，225-232，July，1998)。本發明中應用該反應，并且通過加入單鏈結合蛋白，可以預計促進合成互補鏈的所需效果。例如，T4基因32作為Vent(Exo-)DNA聚合酶單鏈結合蛋白是有效的。
由于DNA聚合酶沒有3’-5’核酸外切酶活性，互補鏈的合成不能在模板5’-末端停止，導致產生一堿基的突出，這是已知的現象。本發明該現象并不是優選的，因為當互補鏈的合成到達末端時，3’-末端導致啟動下一互補鏈的合成。然而，通過DNA聚合酶的高幾率添加堿基“A”到3’-末端，選擇序列以使從3’-末端的合成從“A”開始，如果通過dATP添加錯誤的額外堿基，也不會產生問題。此外，在互補鏈合成的期間甚至3’-末端被突出，利用3’→5’核酸外切酶的活性消化突出使其成為鈍末端。例如，因為Vent DNA聚合酶有這樣的活性，該酶可與(Exo-)DNA聚合酶混合使用以解決所述的問題。
本發明合成或擴增核酸所必需的各種試劑可被預先包裝，并以試劑盒的形式提供，具體地，本發明所提供的試劑盒包含作為合成互補鏈合成的引物和用于置換反應的外引物所必需的各種寡核苷酸，用于互補鏈合成的底物dNTP，用于實現鏈置換型互補鏈合成的DNA聚合酶，為酶反應提供合適條件的緩沖液，和用于檢測合成反應產物所必需的介質。具體地，本發明優選的模式中，反應期間無需加入的試劑，并由此對于移入反應容器后一個反應所必需供給的試劑，其中僅通過加入樣品就可啟動該反應。通過利用發光信號或熒光信號可在容器內檢測反應產物的系統。反應后不必打開和關閉容器。這對于預防污染是非常可取的。
本發明合成具有互補核苷酸序列交替地連接在單鏈內的核酸。該核酸具有例如下面的用途第一特征是利用一分子中具有互補序列的特定結構帶來的優勢，該特征預計有利于檢測，即有已知用于檢測核酸的系統，其中其變化的信號取決于與互補核苷酸序列堿基配對。例如，通過結合使用雙鏈特異性嵌入劑作為如上所述的檢測試劑的方法，充分利用本發明合成產物特征的檢測系統可得以實現。如果本發明合成反應的產物在所述檢測系統發生一次熱變性，并且返回到原始溫度，分子內退火優先發生，并因此容許互補序列之間快速堿基配對。如果存在非特異性產物，分子中它們沒有互補序列從而使通過熱變性分離成2或更多的分子后，它們不能立刻就返回到原始雙鏈。通過在檢測前提供的熱變性步驟，伴隨非特異反應的干擾得以降低。如果所用的DNA聚合酶不抗熱，熱變性步驟有反應終止的意思，并因此有利于控制反應溫度。
第二特征是常常形成能堿基配對的環。能堿基配對的環的結構在圖4中顯示。如圖4中看到的該環由核苷酸序列F2c(X2c)和插入F2c-F1c(X1c)之間的核苷酸序列構成，F2c(X2c)可進行引物退火。F2c-F1c間序列(或更普遍的形式X2c-X1c間)是源于模板的核苷酸衍生序列。因此，如果具有互補核苷酸序列的探針與該區雜交，模板的特異性檢測是可行的。此外，該區常常可堿基配對，因此，熱變性不必先于雜交進行。組成本發明擴增反應產物中的環的核苷酸可能有任意的長度。因此，如果希望與探針雜交，通過引物要被退火的區和通過探針要被雜交的區分別設計以阻止它們的競爭，其中可能得到理想反應條件。
根據本發明優選的模式，在單鏈核酸中供給大量能堿基配對的環。這意味著大量的探針可與一分子核酸雜交以容許高靈敏度的檢測。因此不僅可能實現改進靈敏度還可能實現基于特殊反應原理例如聚集作用來檢測核酸的方法。例如，將固定在精細顆粒例如聚苯乙烯乳膠上的探針加入到本發明反應產物中，觀察乳膠顆粒的聚集作用為產物與探針雜交。聚集作用的強度通過光學測定就可進行高靈敏度和定量觀察。或者還可通過裸眼觀察聚集作用，所以還可建立不用光學的測定裝置的反應系統。
此外，本發明反應產物容許許多要結合的標記，其中每核酸分子能進行層析檢測。在免疫測定領域里，實際所應用是利用可見的檢測標記使用層析介質的分析方法(免疫層析)。該方法基于分析物夾在固定在層析介質上的抗體和標記抗體間的原理，未反應的標記成分被洗脫。本發明的反應產物使該原理應用到核酸分析上。也就是，制備針對環部分的標記探針并固定在層析介質上為捕獲準備捕獲探針，以容許在層析介質里進行分析。序列與環部分互補的捕獲探針得以利用，由于本發明的反應產物具有大量的環，產物與大量標記的探針結合以給出肉眼可識別信號。
本發明反應產物常常能供給堿基配對的環區，能拓寬其它各種檢測系統。例如，利用表面胞質基因組使用固定探針檢測該環部分的系統是可行的。此外，如果用雙鏈特異嵌入物標記該環部分的探針，就可進行更靈敏的熒光分析。或積極利用本發明合成核酸的能力在3’-和5’-側以形成能堿基配對的環。例如，設計一個環使其在正常型和不正常型間有共同的核苷酸序列，而設計其它環使其在其中產生差異。通過探針證實共同部分存在基因，而在其它區證實有不正常存在時，有可能組成特征分析系統。因為本發明合成核酸的反應也能等溫的進行，值得一提的優點是，通過一般熒光光度計可進行實時(real-time)分析。直到此時，同一鏈中要退火的核酸的結構是已知的。然而，通過本發明獲得的具有核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸是新的，因為它包含大量的能與其它堿基配對的環。
另一方面，通過本發明反應產物所給的大量的環自身能被用作探針，例如，在DNA芯片里，探針在有限的區域內高密度堆積，而該技術中可固定在某區域寡核苷酸數量有限，因此通過利用本發明產物大量能退火的探針可被高密度固定，即本發明的反應產物在DNA芯片上可用作固定的探針，擴增后反應產物可通過本領域已知的任何技術得以固定，或用固定的寡核苷酸作為本發明擴增反應的寡核苷酸，導致生成固定反應產物。因此通過使用固定的探針，大量樣品DNA在有限的區域內得以雜交，結果預計可得到高信號。
附圖簡述圖1是本發明優選的模式中反應原理(1)-(4)部分的圖解。
圖2是本發明優選的模式中反應原理(5)-(7)部分的圖解。
圖3是本發明優選的模式中反應原理(8)-(10)部分的圖解。
圖4是通過本發明單鏈核酸所形成的環結構的圖解。
圖5是本發明基本的模式中(A)-(B)部分的圖解。
圖6是本發明基本的模式中(C)-(D)部分的圖解。
圖7是顯示M13mp18靶核苷酸序列中組成寡核苷酸的每個核苷酸序列的位置關系。
圖8是顯示通過以M13mp18為模板合成本發明單鏈核酸的方法獲得的產物瓊脂糖電泳結果的照片。
泳道1XIV分子量標記泳道21 fmol M13mp18 dsDNA泳道3沒有靶圖9是顯示限制酶消化產物的瓊脂糖凝膠電泳結果的照片，其中所述產物通過本發明核酸合成反應在實施例1中得到的。
泳道1XIV分子量標記泳道2純化產物的BamHI消化泳道3純化產物的PvuII消化泳道4純化產物的HindIII消化圖10是顯示產物瓊脂糖凝膠電泳結果的照片，所述產物是在甜菜堿存在下以M13mp18為模板通過本發明合成單鏈核酸的方法獲得的，0，0.5，1和2是指加入反應溶液中的甜菜堿的濃度(M)，N為陰性對照，-21是指模板DNA的濃度為10-21mol。
圖11是顯示從HVB衍生來的靶核苷酸序列中組成寡核苷酸的每個核苷酸序列的位置關系。
圖12是顯示通過本發明合成單鏈核酸的方法獲得的產物瓊脂糖凝膠電泳結果的照片，其中結合在M13mp18中的HBV-M13mp18為模板。
泳道1XIV分子量標記泳道21 fmol HBV-M13mp18 dsDNA泳道3沒有靶圖13是顯示通過本發明合成單鏈核酸的方法獲得的堿變性產物瓊脂糖凝膠電泳結果的照片，泳道1來自λ-噬菌體的HindIII-消化片段泳道2實施例1中的反應產物泳道3實施例3中的反應產物圖14是顯示通過本發明合成單鏈核酸的方法獲得的產物瓊脂糖凝膠電泳結果的照片，其中靶M13mp18的濃度是變化的，上面和下面的照片分別顯示反應1和3小時的結果。
泳道1M13mp18 dsDNA 1×10-15mol/管泳道2M13mp18 dsDNA 1×10-16mol/管泳道3M13mp18 dsDNA 1×10-17mol/管泳道4M13mp18 dsDNA 1×10-18mol/管泳道5M13mp18 dsDNA 1×10-19mol/管泳道6M13mp18 dsDNA 1×10-20mol/管泳道7M13mp18 dsDNA 1×10-21mol/管泳道8M13mp18 dsDNA 1×10-22mol/管泳道9沒有靶泳道10XIV分子量標記圖15是顯示突變位置以及每一區相對于靶核苷酸序列(靶)的位置關系，突變中下劃線的鳥嘌呤被腺嘌呤所替換。
圖16是顯示本發明擴增反應產物瓊脂糖凝膠電泳結果的照片。
M100bp序列梯(New England Biolabs)N沒有模板(純化水)WT1 fmol野生型模板M13mp18
MT1 fmol突變模板M13mp18FM圖17是顯示編碼靶mRNA的核苷酸序列中組成寡核苷酸的每個核苷酸序列的位置關系。
圖18是顯示以mRNA為模板通過本發明合成單鏈核酸的方法獲得的產物瓊脂糖凝膠電泳結果的照片。
實施本發明最好的模式實施例1 對M13mp18中的區域的擴增本發明合成具有互補鏈交替地連接到單鏈里的核酸的方法是利用M13mp18為模板嘗試的，實驗中用到四種引物即M13FA，M13RA，M13F3，和M13R3，M13F3和M13R3是置換分別以M13FA和M13RA為合成起點獲得的第一條核酸的外引物。因為以M13FA(或M13RA)合成后外引物為互補鏈合成起點的引物。通過利用臨近堆積現象將這些設計成退火至臨近M13FA(或M13RA)的區。此外，將這些引物設置為高濃度使M13FA(或M13RA)的退火優先發生。
組成每個引物的核苷酸序列如序列表所示，引物的結構特征在下面概括。此外，針對靶核苷酸序列(靶)每個區的位置關系在圖7中顯示。
引物 5’-側的區/3’-側的區M13FA與通過M13FA合成的互補鏈中F1c區相同/與M13mp18中F2c區互補M13RA與通過M13RA合成的互補鏈中R1c區相同/與通過M13FA合成的互補鏈中R2c區互補M13F3與M13mp18中F2c區3’-側臨近的F3c互補M13R3通過M13FA合成的互補鏈中F2c區3’-側臨近的R3c互補通過所述引物，合成核酸，其中M13mp18中從F1c延伸到R1c的區，及其互補核苷酸序列是交替地通過含F2c的成環序列連接在單鏈里。通過這些引物合成本發明核酸的方法的反應溶液的組合在下面所示。
反應溶液組合(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO4
6mM MgSO40.1％ Triton X-1005％二甲基亞砜(DMSO)0.4mM dNTP引物800nM M13FA/SEQ ID NO1800nM M13RA/SEQ ID NO2200nM M13F3/SEQ ID NO3200nM M13R3/SEQ ID NO4靶M13mp18 dsDNA/SEQ ID NO5反應上述反應溶液在95℃加熱5分鐘，該靶變性成單鏈，將反應溶液轉移到用冰預冷的水中，加入4U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLANDBiolabs)，混合物于65℃反應1小時，反應后，于80℃10分鐘終止該反應，然后重新轉到用冰預冷的水中。
反應的證實將1μl上樣緩沖液加到5μl上面的反應溶液中，樣品于80mV在2％瓊脂糖凝膠(0.5％TBE)上電泳1小時。用XIV(100bp梯，Boehringer Mannheim)作為分子量標記，用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色電泳后的凝膠以驗證核酸。結果在圖8中顯示，各泳道分別相對于下面的樣品。
1.XIV分子量標記2.1 fmol M13mp18 dsDNA3.沒有靶泳道3中，除了未反應的引物被染色得到證實外，沒有帶被證實。泳道2中存在靶，證實產物為低分子量的梯狀帶，在高分子量處染色為不清晰的成片條帶，并且帶很難在膠中電泳。低分子量帶中，290bp和450bp附近的帶與本發明合成反應中所期望的產物一致，即雙鏈SEQ ID NO11和12(相當于圖2-(7)和2-(10)中所示形成的雙鏈)與單鏈SEQ ID NO13(相當于圖3-(9)長單鏈)。因此證實反應按照預計的進行。因為該反應基本上是連續反應以允許變化反應產物的分子量，進一步因為該產物具有部分單鏈和雙鏈復合的復雜結構，所以預計會導致在高分子量處產生不清晰成片條帶模式和未被電泳的帶的結果。
實施例2 通過限制酶的消化證實反應產物為了闡清具有互補核苷酸序列交替地連接在單鏈內的本發明實施例1獲得的核酸結構，用限制酶消化產物。如果通過消化能生成理論上的片段，同時不存在(disappear)如實施例1中觀察到的高分子量處產生不清晰成片條帶模式和未被電泳的帶，就可預計任何這些產物為本發明具有互補序列交替地連接在單鏈內的核酸。
實施例1中8管反應溶液(200μl)通過用酚處理及乙醇的沉淀作用得以沉積和純化，回收產生的沉淀并重新溶于200μl TE緩沖液中，分別用限制酶BamHI，PvuII，和HindIII于37℃消化10μl等分試樣2小時，消化物于80mV在2％瓊脂糖凝膠(0.5％TBE)上電泳1小時。用Super Ladder-Low(100bp梯)(Gensura Laboratories，Inc.)作為分子量標記，用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色電泳后的凝膠以驗證核酸。結果在圖9中顯示，各泳道分別相對于下面的樣品。
1XIV分子量標記2純化產物的BamHI消化3純化產物的PvuII消化4純化產物的HindIII消化預計組成相關短擴增產物的核苷酸序列是那些SEQ ID NO13，14，15和16，從這些核苷酸序列，預計用限制酶消化的各片段的大小如表1所示，表中“L”是指由于L是含環的片段(單鏈)因此沒有確定電泳位置。
表1.本發明擴增產物限制酶消化后的片段序列編號 BamHI PvuII HindIII13 177+L 56+L 147+L14 15+101+L- 142+L15 171+101+L 56+L 147+161+L16 11+101+230+L237+L 142+170+L總計 101,177,230 56,237142,147,161,170(11，15；未證實)因為消化前幾乎所有的帶被轉化為所需的帶，這就證實目標反應產物得到了擴增，此外還顯示沒有或很少有非特異性產物。
實施例3添加甜菜堿對擴增反應的促進作用進行檢測添加到反應溶液中的甜菜堿(N，N，N-三甲基甘氨酸，Sigma)對核酸擴增反應影響的實驗。與實施例1相似，在存在各種濃度甜菜堿的情況下，用M13mp18為模板進行合成本發明具有互補鏈交替地連接在單鏈內的核酸。該實驗所用的引物與實施例1中的相同，模板DNA的量為10-21mol(M13mp18)，水作為陰性對照。向反應溶液中添加濃度為0，0.5，1和2M甜菜堿，反應溶液的組合如下所示。
反應溶液的組成(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.84mM MgSO40.4mM dNTPs10mM KCl10mM(NH4)2SO40.1％Triton X-100引物800nM M13FA/SEQ ID NO1800nM M13RA/SEQ ID NO2200nM M13F3/SEQ ID NO3200nM M13R3/SEQ ID NO4靶M13mp18 dsDNA/SEQ ID NO5聚合酶，反應條件，及反應后的電泳條件與實施例1中所述相同。
結果在圖10中顯示，反應中甜菜堿的濃度為0.5或1.0M，擴增產物的量得到增加。而且，如果其濃度增加到2.0M，則觀察不到擴增。由此所示合適濃度的甜菜堿促進擴增反應。擴增產物量降低的原因估計為當甜菜堿的濃度為2.0M時，Tm被降的太多。
實施例4 HBV基因序列的擴增嘗試合成本發明核酸的方法，其中具有HBV基因的部分序列與其結合的M13mp18用作模板。實驗中所用4種引物HB65FA(SEQ ID NO6)，HB65RA(SEQ ID NO7)，HBF3(SEQ ID NO8)和HBR3(SEQ ID NO9)。HBF3和HBR3是置換分別以HB65FA和HB65RA為合成起點獲得的第一條核酸的外引物。因為以HB65FA(或HB65RA)合成后外引物為互補鏈合成起點的引物。通過利用臨近堆積現象將這些設計成退火至臨近HB65FA(或HB65RA)的區。此外，將這些引物設置為高濃度使HB65FA(或HB65RA)的退火優先發生。該實施例中靶序列(430bp)由結合在M13mp18中HBV衍生而來，在SEQ ID NO10中顯示。
組成每個引物的核苷酸序列如序列表所示，每個引物的結構特征在下面概括。此外，針對靶核苷酸序列(靶)每個區的位置關系在圖11中顯示引物5’-側的區/3’-側的區HB65FA 與通過HB65FA合成的互補鏈中F1c區相同/與HBV-M13mp18中F2c區互補HB65RA 與通過HB65RA合成的互補鏈中R1c區相同/與通過HB65FA合成的互補鏈中R2c區互補HBF3與HBV-M13mp18中F2c區3’-側臨近的F3c互補HBR3通過HB65FA合成的互補鏈中F2c區3’-側臨近的R3c互補通過所述引物，合成核酸，其中具有部分HBV基因與其結合的M13mp18HBV-M13mp18)中從F1c延伸到R1c的區，及其互補核苷酸序列是交替地通過插入含F2c的成環序列交替地連接在單鏈里。除了上述所用引物，該反應在與實施例1中相同的條件下得以進行。反應溶液通過瓊脂糖凝膠電泳分析，結果在圖12中顯示。各泳道分別相對于下面的樣品。
1.XIV分子量標記2.1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA.
3.沒有靶與實施例1相似，在靶存在的情況下僅證實產物為低分子量的梯狀帶，在高分子量處染色為不清晰的成片條帶和很難在膠中電泳的帶(泳道2中)低分子量帶中，310bp和480bp附近的帶與本發明合成反應中所期望的產物一致，即雙鏈SEQ ID NO17和18。因此證實反應按照預計的進行。如實施例1中所述的結果，預計本發明合成產物的特征結構導致在高分子量處產生不清晰成片條帶模式和未被電泳的帶。從該實驗中，證實甚至在用不同序列(靶)來擴增，本發明能得以利用。
實施例5證實合成反應產物的大小為了證實本發明合成的核酸結構通過堿變性條件下電泳分析其長度，在實施例1或4中靶存在下向5μl每個反應溶液中加入1μl上樣緩沖液，樣品于50mA在0.7％瓊脂糖凝膠(50mM NaOH，1mM EDTA)上電泳14小時。用的HindIII-消化的λ-噬菌體片段作為分子量標記，電泳后的凝膠用1M Tris，pH8中和并用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色以驗證核酸。結果在圖13中顯示，各泳道分別相對于下面的樣品。
1來自λ-噬菌體的HindIII-消化片段2實施例1中的反應產物3實施例4中的反應產物當堿變性條件下電泳反應產物，可以證實單鏈狀態中的大小。證實實施例1(泳道2)和實施例4(泳道3)主要產物的大小在2 kbase之內，而且，通過該分析顯示出本發明產物在可分析證實的范圍內已被延伸到至少不小于6kbase的大小。另外，未變性條件下實施例1和實施例4中未被電泳的帶在變性狀態下被分離成單個更小的單鏈。
實施例6 對擴增M-13mp13中的區域的反應中依賴于靶濃度的擴增的證實可觀察濃度變化的靶對合成本發明核酸的影響。除了作為靶的M13mp18 dsDNA的量為0-1 fmol和反應時間為1或3小時外在與實施例1相同的條件下本發明合成核酸的方法得以實施。與實施例1相似，樣品在2％瓊脂糖凝膠(0.5％TBE)上電泳，用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色以驗證核酸。用XIV(100bp梯，Boehringer Mannheim)作為分子量標記，結果在圖14中(上面反應1小時，下面反應3小時)顯示，各泳道分別相對于下面的樣品1.M13mp18 dsDNA 1×10-15mol/管。
2.M13mp18 dsDNA 1×10-16mol/管。
3.M13mp18 dsDNA 1×10-17mol/管。
4.M13mp18 dsDNA 1×10-18mol/管。
5.M13mp18 dsDNA 1×10-19mol/管。
6.M13mp18 dsDNA 1×10-20mol/管。
7.M13mp18 dsDNA 1×10-21mol/管。
8.M13mp18 dsDNA 1×10-22mol/管。
9.沒有靶。
10.XIV分子量標記。
各泳道中共同帶在電泳圖里較低部分顯示，為未反應的染過色的引物。不考慮反應時間，在缺少靶時則不能觀察到擴增產物。染色模式取決于靶的濃度，僅在靶存在下才能獲得擴增產物的染色模式。此外，增加反應時間時能證實擴增產物的濃度較低。
實施例7 點突變的檢測(1)M13mp18FM(突變型)的制備所用靶DNA為M13mp18(野生型)和M13mp18FM(突變型)，為了制備突變型M13mp18FM，用LA PCRTM體外誘變試劑盒(酒寶造)替換一核苷酸得到突變。此后，通過測序證實該序列。F1區的序列如下所示野生型CCGGGGATCCTCTAGAGTCG(SEQ ID NO19)突變型CCGGGGATCCTCTAGAGTCA(SEQ ID NO20)(2)引物設計野生型和突變型所用FA引物分別在F1c區5’-末端提供不同的核苷酸序列，突變的位置和針對靶核苷酸序列(靶)的每區位置關系在圖15中顯示。
(3)擴增反應如下所示通過利用M13mp18(野生型)和M13mp18FM(突變型)為模板應用結合特異性引物進行檢測特異性模板擴增反應是否發生的實驗。
野生型擴增所用引物FAd4，RAd4，F3，R3突變型擴增所用引物FAMd4，RAd4，F3，R3每個引物核苷酸序列如下FAd4CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(SEQ ID NO21)FAMd4TGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(SEQ ID NO22)RAd4CGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC(SEQ ID NO23)F3ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA(SEQ ID NO24)R3GTTGGGAAGGGCGATCG(SEQ ID NO25)(4)檢測M13mp18中點突變反應溶液組合如下終濃度D2W 3.75μL10X Thermo pol buffer(NEB)2.5μL20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO46mM MgSO40.1％TritonX-1002.5mM dNTP4μL 400μM100mM MgSO40.5μL4M Betaine6.25μL 1MM13FAd4引物(10pmol/μL)或M13FAMd4引物(10pmol/μL) 2μL 800nMM13RAd4引物(10pmol/μL) 2μL 800nMM13F3引物(10pmol/μL) 0.5μL200nMM13R3引物(10pmol/μL) 0.5μL200nM總量22μL將1 fmol(2μl)靶M13mp18或M13mp18FM加入到反應溶液中于95℃加熱5分鐘，其中所述靶變性成單鏈。將反應溶液轉移到用冰預冷的水中，加入1μl(8U)Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)于68℃或68.5℃反應1小時，反應后，于80℃10分鐘終止該反應，反應溶液重新轉到用冰預冷的水中。
如圖16所示，當對于野生型FAd4被用作FA引物時，僅在野生型模板情況下觀察到有效擴增。另一方面，當對于突變型FAMd4被用作FA引物，僅在野生型模板情況下觀察到有效擴增。
從上述結果顯示通過利用本發明擴增反應，可有效地檢測點突變。
實施例8 以mRNA為靶的擴增反應通過利用以mRNA為靶核酸合成本發明核酸的方法得以嘗試。為制備靶mRNA，將表達前列腺特異抗原(PSA)的前列腺癌細胞系LNCaP細胞(ATCC No.CRL-1740)與非表達細胞慢性骨髓白血病細胞系K562細胞(ATCC No.CCL-243)在1∶106到100∶106范圍混合，接著通過利用來自Qiagen(Germany)的RNeasy Mini試劑盒，提取總RNA，實驗中所用4種引物即PSAFA，PSARA，PSAF3和PSAR3。PSAF3和PSAR3是替換分別以PSAFA和PSARA為合成起點獲得的第一核酸的外引物。此外，將這些引物的濃度設置高使PSAFA(或PSARA)的退火優先發生。組成各個引物的核苷酸序列如下，引物PSAFATGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG(SEQ ID NO26)PSARATGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG(SEQ ID NO27)PSAF3TGCTTGTGGCCTCTCGTG(SEQ ID NO28)PSAR3GGGTGTGGGAAGCTGTG(SEQ ID NO29)引物的結構特征在下面概括。此外，針對編碼對于靶mRNA的DNA核苷酸序列每個引物的位置關系和限制酶Sau3AI識別位點在圖17中顯示。
引物 5’-側的區/3’-側的區PSAFA與通過PSAFA合成的互補鏈中F1c區相同/與靶核苷酸序列中F2c區互補PSARA與通過PSARA合成的互補鏈中R1c區相同/與通過PSAFA合成的互補鏈中R2c區互補PSAF3與靶核苷酸序列中F2c區3’-側臨近的F3c互補PSAR3通過PSAFA合成的互補鏈中F2c區3’-側臨近的R3c互補本發明合成核酸方法的反應溶液的組合如下反應溶液的組成(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.84mM MgSO40.4mM dNTPs10mM KCl10mM (NH4)2SO40.1％ Triton X-1000.8M betaine5mM DTT
1600nM PSAFA & PSARA引物200nM PSAF3 & PSAR3引物8U Bst DNA聚合酶100U Rever Tra Ace(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)5μg總RNA所用成分在冰上混合，該實驗中以mRNA(單鏈)為靶序列，因此不必通過熱變性獲得單鏈的步驟。于65℃進行反應45分鐘，于85℃5分鐘終止該反應，反應后，5μl反應溶液在2％瓊脂糖凝膠上電泳，用SYBR Green I染色。
結果在圖18中顯示，各泳道分別相對于下面的樣品泳道 Bst RT LNCaP細胞數/106K562細胞數1 -+02 -+103 +-04 +-105 ++06 ++17 ++108泳道6中為Sau3AI消化1μL等份反應溶液9泳道7中為Sau3AI消化1μL等份反應溶液10分子量標記，100bp ladder(New England Biolabs)在缺少Bst DNA聚合酶或Rever Tra Ace時，不能得到擴增產物(泳道1-4)。所述兩種酶都存在情況下，如果存在從LNCaP衍生的RNA，則能檢測到擴增產物(泳道5-7)。能檢測到從一個LNCaP細胞/一百萬個K562細胞提取的RNA(泳道6)。當在位于靶內部的Sau3AI限制酶位點消化擴增產物時，該產物被消化成所估計大小的片段(泳道8和9)。
從上述結果中，證實在本發明合成核酸的方法中甚至以RNA為靶時可得到所需的反應產物。
工業應用根據本發明新寡核苷酸和利用所述寡核苷酸合成核酸的方法，提供了合成具有互補核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸的方法，而不需要任何復雜的溫度控制。基于本發明以寡核苷酸為引物合成的互補鏈以所述模板鏈3’-末端作為合成新互補鏈的起點，伴隨有導致新引物退火的環的合成及以先合成的鏈為模板合成互補鏈反應產物，被再次通過從環開始的合成的互補鏈所替換并可堿基配對。由此得到的以自身為模板合成的核酸與已知的核酸合成方法例如SDA結合，有益于改進核酸的合成效率。
根據本發明進一步的優選模式，提供合成核酸的新方法，該方法可改進已知方法合成核酸的效率，不需要復雜的溫度控制，而且預計可達到高效率擴增，并可獲得高特異性，即將基于本發明的寡核苷酸用作模板鏈，和其互補鏈，其中具有互補核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸可得以連續合成。理論上該反應可以繼續到合成所必須的初始產物的耗盡。在繼續合成從環開始合成的新核酸期間，從能退火為環的寡核苷酸的延伸進行鏈的置換為長單鏈核酸的延伸(即具有多對互補鏈連接在此的核酸)提供3’-OH。另一方面，長的單鏈核酸的3’-OH以自身為模板進行合成互補鏈的反應，由此得到延伸，從環開始的合成的新互補鏈被替換，該擴增反應步驟在等溫條件下進行并維持高的特異性。
當兩臨近區按照所設計的設計時使本發明寡核苷酸可作為合成核酸反應的引物，這明顯有助于特異性的保守，通過與非特異性誤退火啟動非特異性擴增反應的與e.g.PCR相比較，不管所需2引物的位置關系如何就可容易地對本發明所需高特異性作出解釋，能利用該特異性高靈敏度及精確地檢測SNPs。
本發明的特征在于通過組成簡單的試劑就可容易地獲得該反應，例如本發明寡核苷酸具有特定結構，但這是核苷酸序列選擇的物質，是簡單的寡核苷酸物質。此外，在優選的模型中，僅通過催化合成置換型的互補鏈反應的DNA聚合酶反應，可得以進行。而且，如果本發明以RNA為模板，利用DNA聚合酶例如Bca DNA聚合酶，既具有反轉錄酶活性又有鏈置換型DNA聚合酶活性使所有酶反應可通過單酶得以進行，通過簡單酶實現高度擴增核酸的反應原理尚不清楚。甚至對于將本發明應用到已知的核酸合成反應例如SDA中對于它們的結合不必需要額外酶。并且該與基于本發明的寡核苷酸的簡單結合可被用于各種反應系統中，因此本發明合成核酸的方法在費用方面也是有利的。
如上所述，本發明合成核酸的方法和其中的寡核苷酸提供了一種新的原理同時解決了許多問題例如操作(不必需要溫度控制)，改進合成效率，經濟化和高特異性。
序 列 表<110> 榮研化學株式會社(Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha)<120> 合成核酸的方法<130> E2-001PCT2<140><141><150> PCT/JP99/06213<151> 1999-11-08<160> 29<170> PatentIn Ver.2.0<210> 1<211> 52<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 1cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg at 52<210> 2<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 2acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta c 51<210> 3<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 3actttatgct tccggctcgt a 21<210> 4<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 4gttgggaagg gcgatcg17<210> 5<211> 600<212> DNA<213> 噬菌體M13mp18<400> 5gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct 240cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg 300ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 360atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 420agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc 480cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac ggtcgtcgtc ccctcaaact 540ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt aacctatccc attacggtca 600<210> 6<211> 63<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 6ctcttccaaa agtaaggcag gaaatgtgaa accagatcgt aatttggaag acccagcatc 60cag 63<210> 7<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 7gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgt 43<210> 8<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 8gccacctggg tgggaa 16<210> 9<211> 22<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 9ggcgagggag ttcttcttct ag 22<210> 10<211> 430<212> DNA<213> 乙型肝炎病毒<400> 10ctccttgaca ccgcctctgc tctgtatcgg gaggccttag agtctccgga acattgttca 60cctcaccata cagcactcag gcaagctatt ctgtgttggg gtgagttaat gaatctggcc 120acctgggtgg gaagtaattt ggaagaccca gcatccaggg aattagtagt cagctatgtc 180aatgttaata tgggcctaaa aatcagacaa ctattgtggt ttcacatttc ctgccttact 240tttggaagag aaactgtttt ggagtatttg gtatcttttg gagtgtggat tcgcactcct 300cccgcttaca gaccaccaaa tgcccctatc ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt 360agacgacgag gcaggtcccc tagaagaaga actccctcgc ctcgcagacg aaggtctcaa 420tcgccgcgtc430<210> 11<211> 293<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 11acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 60cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 120gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 180ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 240tatccgctca caattccaca caacaaaaag tacccgggga tcctctagag tcg293<210> 12<211> 293<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 12cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 120agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgt293<210> 13<211> 459<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 13acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 60cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 120gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 180ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 240tatccgctca caattccaca caacaaaaag tacccgggga tcctctagag tcgacctgca 300ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 360ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 420aggcccgcac aaaaagggtt ttcccagtca cgacgttgt459<210> 14<211> 458<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 14cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 120agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 300cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc 360tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 420ccacacaaca aaaagtaccc ggggatcctc tagagtcg 458<210> 15<211> 790<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 15acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 60cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 120gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 180ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 240tatccgctca caattccaca caacaaaaag tacccgggga tcctctagag tcgacctgca 300ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 360ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 420aggcccgcac aaaaagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag 480cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgggta ctttttgttg tgtggaattg 540tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttcgagctcg 600gtacccgggg atcctctaga gtcgacctgc aggcatgcaa gcttggcact ggccgtcgtt 660ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 720ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca caaaaagggt tttcccagtc 780acgacgttgt790<210> 16<211> 789<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 16cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 120agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 300cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc 360tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 420ccacacaaca aaaagtaccc ggggatcctc tagagtcgac ctgcaggcat gcaagcttgg 480cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tttttgtgcg ggcctcttcg 540ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca 600gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc atgcctgcag 660gtcgactcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg taatcatggt catagctgtt 720tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac aaaaagtacc cggggatcct 780ctagagtcg 789<210> 17<211> 310<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 17gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgtctaacaa cagtagtttc 60cggaagtgtt gataagatag gggcatttgg tggtctgtaa gcgggaggag tgcgaatcca 120cactccaaaa gataccaaat actccaaaac agtttctctt ccaaaagtaa ggcaggaaat 180gtgaaaccac aatagttgtc tgatttttag gcccatatta acattgacat agctgactac 240taattccctg gatgctgggt cttccaaatt acgatctggt ttcacatttc ctgccttact 300tttggaagag310<210> 18<211> 465<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 18gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgtctaacaa cagtagtttc 60cggaagtgtt gataagatag gggcatttgg tggtctgtaa gcgggaggag tgcgaatcca 120cactccaaaa gataccaaat actccaaaac agtttctctt ccaaaagtaa ggcaggaaat 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人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 25gttgggaagg gcgatcg 17<210> 26<211> 44<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 26tgttcctgat gcagtgggca gctttagtct gcggcggtgt tctg 44<210> 27<211> 45<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 27tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg 45<210> 28<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 28tgcttgtggc ctctcgtg18<210> 29<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 29gggtgtggga agctgtg 1權利要求
1.合成在其一條鏈上具有交替連接之互補核苷酸序列的核酸的方法，所述方法包括a)提供一種核酸，其3′末端具有可與同一條鏈上的部分F1c退火的F1區，并且通過所述F1區與F1c的退火可形成包含了可進行堿基配對的F2c區在內的環；b)以與F1c退火的F1 3′末端為起點合成互補鏈；c)使在其3′末端包含與F2c區互補的F2序列的寡核苷酸退火并以該寡核苷酸為合成起點，通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成反應而進行互補鏈合成，以置換步驟b)中所合成的互補鏈；d)使一種多核苷酸退火并以其3′末端為合成起點，通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成反應而進行互補鏈合成，以置換步驟c)中所合成的互補鏈，其中所述多核苷酸在其3′末端包含一種與步驟c)中合成的互補鏈的任意區域互補的序列；
2.權利要求1的方法，其中步驟d)中所述合成起點為同一鏈上3′末端的可與R1c區退火的R1區，通過R1與R1c的退火可形成包含了可進行堿基配對的R2c區在內的環。
3.一種寡核苷酸，其至少由以下兩個區域X2及X1c構成，且X1c連接至X2的5′側，X2區具有與含特定核苷酸序列的核酸中任意X2c區互補的核苷酸序列；X1c區具有與含特定核苷酸序列的核酸中X2c區5′側的X1c區基本相同的核苷酸序列。
4.權利要求1的方法，其中步驟a)所述的核酸是通過以下步驟產生的第二核酸i)使權利要求3所述寡核苷酸的F2區與作為模板的核酸中的F2c區退火，其中所述寡核苷酸中，X2區為F2區，X1c區為F1c區；ii)以所述寡核苷酸中的F2為起點合成具有與所述模板互補之核苷酸序列的第一核酸；iii)使步驟ii)中合成的第一核酸的任意區處于可進行堿基配對的狀態；iv)使一種寡核苷酸退火并以該寡核苷酸為合成起點，合成第二核酸，并使該核酸3′末端的F1處于可進行堿基配對的狀態，其中所述寡核苷酸具有與步驟iii)中的第一核酸中可進行堿基配對的區域互補的核苷酸序列。
5.權利要求4的方法，其中步驟iii)中可進行堿基配對的區域為R2c，且步驟iv)中的寡核苷酸為權利要求3所述的寡核苷酸，其中X2c區為R2c區，X1c區為R1c區。
6.權利要求4或5的方法，其中步驟iii)及iv)中可進行堿基配對的狀態通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成反應而產生，該反應的合成起點啟用兩種外引物一種是與模板中F2c的3′側退火的外引物，另一種是與作為步驟iv)中第一核酸合成起點的區域的3′側退火的外引物。
7.權利要求6的方法，所述反應中所用的每種寡核苷酸與其在模板中的互補區之間的解鏈溫度在相同嚴謹條件下存在以下的關系(外引物/模板3′側區)≤(F2c/F2及R2c/R2)≤(F1c/F1及R1c/R1)。
8.權利要求4-7中任一項的方法，其中所述作為模板的核酸為RNA，且步驟ii)中的互補鏈通過具有反轉錄酶活性的酶來合成。
9.擴增在其一條鏈上具有交替連接之互補核苷酸序列的核酸的方法，所述方法通過重復以下步驟完成A)提供一種模板，使其3′末端和5′末端具有由互補于相同鏈上每一末端區的核苷酸序列組成的區，當這些互補核苷酸序列退火時，形成可在兩者之間進行堿基配對的環；B)以與同一鏈退火的上述模板的3′末端為合成起點合成互補鏈；C)使3′末端互補于3′末端側的環內核苷酸序列的寡核苷酸與環部退火，并以該寡核苷酸為合成起點，通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成反應而合成互補鏈，以置換步驟B)中合成的互補鏈，使其3′末端處于可進行堿基配對的狀態；D)使步驟C)中具有能進行堿基配對的3′末端的鏈作為(A)中的新模板。
10.權利要求9的擴增方法，其中步驟C)中寡核苷酸的5′末端具有一段與作為步驟B)之合成起始點的3末端互補的核苷酸序列。
11.權利要求10的擴增方法，進一步包含這樣的步驟以步驟C)中的寡核苷酸作為合成起始點合成的互補鏈用做步驟A)中的模板。
12.權利要求9的擴增方法，其中步驟A)的模板是通過權利要求5所述方法合成的。
13.權利要求1或9的方法，其中鏈置換型互補鏈合成反應是在解鏈溫度調節劑的存在下實施的。
14.權利要求13的方法，其中解鏈溫度調節劑為甜菜堿。
15.權利要求14的方法，其中允許反應溶液中甜菜堿的濃度為0.2-3.0M。
16.一種檢測樣品中靶核苷酸序列的方法，包括實施權利要求9-15中任一項所述的擴增方法并觀察是否生成擴增產物。
17.權利要求16的方法，其中在擴增產物中加入包含與所述環互補的核苷酸序列的探針，進而觀察兩者之間的雜交。
18.權利要求17的方法，其中所述探針被標記在顆粒上，并觀察通過雜交而發生的聚集反應。
19.權利要求16的方法，其中權利要求9-15中任一項所述的擴增方法在核酸檢測試劑的存在下實施，并根據該檢測試劑的信號變化來觀察是否生成擴增產物。
20.用權利要求16所述方法檢測靶核苷酸序列中的突變的方法，其中核苷酸序列中作為擴增對象的突變阻礙了組成該擴增方法的任一互補鏈的合成。
21.合成在其一條鏈上具有交替連接之互補核苷酸序列的核酸的試劑盒，其包括以下組分i)權利要求3所述的寡核苷酸，其中作為模板的核酸中F2c區域是X2c，位于F2c 5′端的F1c是X1c；ii)一種寡核苷酸，其包含互補于以i)的寡核苷酸為引物而合成的互補鏈中任意區域的核苷酸序列；iii)一種寡核苷酸，其具有與作為模板的核酸中F2c區3′側的F3c區互補的核苷酸序列；iv)一種用于催化鏈置換型互補鏈合成反應的DNA聚合酶，和，v)一種核苷酸，其作為組分iv)的底物。
22.權利要求21的試劑盒，其中ii)的寡核苷酸為權利要求3所述的寡核苷酸，以i)的寡核苷酸為合成起點合成的互補鏈中任意R2c區為X2c，位于R2c 5′側的R1c為X1c。
23.權利要求22所述的試劑盒，進一步包含以下組分vi)一種寡核苷酸，其具有與用i)的寡核苷酸作為起點合成的互補鏈中任意R2c區3′側的R3c區互補的核苷酸序列。
24.一種用于檢測靶核苷酸序列的試劑盒，其中在權利要求21-23中任一項所述試劑盒的基礎上，還進一步包含用于檢測核酸合成反應產物的檢測試劑。
全文摘要
本發明涉及具有新結構的寡核苷酸和通過其用作引物合成核酸的方法。該寡核苷酸在引物的5’－側所提供的核苷酸序列，基本上與以該引物為合成起點而合成的區域相同。本發明在單純試劑的組成上實現了基于等溫反應的核酸合成。此外，本發明根據該核酸合成的方法又提供了合成高特異性核酸的方法。
文檔編號C12N15/10GK1420928SQ00818262
公開日2003年5月28日 申請日期2000年3月28日 優先權日1999年11月8日
發明者納富繼宣, 長谷哲 申請人:榮研化學株式會社