一種多肽修飾的金納米簇及其制備方法
【專利摘要】本發明屬于功能性生物納米材料技術領域，具體涉及一種多肽修飾的金納米簇及其制備方法，在水熱法制備過程中采用KRKC和GSH兩種多肽作為穩定劑修飾，通過設計多肽序列保證金屬團簇的穩定性制備對細胞核仁具有靶向標記作用的紅色熒光金納米簇，其粒徑為1.5?2.8nm范圍內，平均顆粒直徑為1.9nm，金納米簇在400nm附近有明顯的吸收峰，當用400nm的激發光對金納米簇照射時，在500?750nm區間有較強的熒光發射，發射峰在586nm附近，金納米簇的熒光量子產率為7％。該方法簡單，操作性強，成本低，材料表面用多肽穩定，生物親和性好，采用多肽多為穩定劑毒性低，穩定性好，發射波長，利于得到更好的核仁成像效果。
【專利說明】
一種多肽修飾的金納米簇及其制備方法
技術領域
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[0001]本發明屬于功能性生物納米材料技術領域，具體涉及一種多肽修飾的金納米簇及其制備方法，采用KRKC和GSH兩種多肽作為穩定劑修飾，通過設計多肽序列保證金屬團簇的穩定性制備對細胞核仁具有靶向標記作用的紅色熒光金納米簇。
【背景技術】
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[0002]細胞核仁是細胞核內的重要亞核結構，對于細胞的生長、增殖都有重要作用。除此之外，核仁還是細胞核內rRNA轉錄、翻譯以及核糖體組裝的場所，因此又被稱為“核糖體工廠”，甚至有文獻報道核仁也是某些病毒的靶向攻擊位置。細胞核仁并不是一直存在的，它形成于細胞分裂間期，由熔融態的核仁物質聚集形成，目前對于細胞核仁的生物學作用的研究尚不成熟。研究核仁及其相關過程時，非常重要的步驟是對核仁進行標記將核仁可視化。目前，對于核仁的可視化方法，得到普遍認同的有①銀染法一通過AgNO3與細胞核仁處的酸性蛋白反應，實現銀的還原，生成黑色銀顆粒，進而對核仁位置進行標記，缺點是在光學顯微鏡下呈黑色且無熒光信號，不利于進一步的研究使用；②商業化的STYO染料染色法一在480nm激發下有500nm的熒光發射，并且染料分子與RNA結合后熒光強度會存在數量級的變化，但染料分子的結構沒有公開報道。
[0003]近年來，隨著研究的不斷深入，對核仁特異性染色的其他材料也相應進入人們的視線，如以稀土元素銪為配位中心構成的稀土配合物；以吡啶，吡咯及苯等芳環結構構成的超低分子量的熒光探針；以及由過渡金屬元素鋨、銥組成的異核雙配位化合物均可對細胞核仁進行特異性的標記。這類材料的共同特征就是表面含有大量的芳環結構，可能是對核仁進行靶向識別的作用基團。越來越多的熒光納米材料應用于熒光標記領域，與傳統的化學染料相比，熒光納米材料的抗光漂白性更好，并且通過對納米材料表面進行修飾，還會使得材料的生物親和性大大提高。通過調節納米材料的尺寸可以得到發射波長較長的材料，這對降低細胞成像的背景干擾，信噪比及細胞自熒光都是有利的。
[0004]金屬團簇納米材料具有超小的顆粒尺寸具有優良的熒光性，將其負載在對細胞核內組分具有靶向材料的載體上可以進入細胞核的雙層膜結構，同時熒光標記細胞核仁結構，多肽序列具有比抗體更優良的靶向特異性，設計合理有效的多肽序列，合成可對細胞核仁靶向標記的納米金簇為研究細胞核仁及其相關過程提供更好的幫助。
【發明內容】
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[0005]本發明目的在于克服現有技術的不足，尋求一種多肽修飾的標記細胞核仁的金納米簇及其制備方法用，降低現有細胞核仁標記材料細胞成像的背景干擾以及解決現有細胞核仁標記材料制作成本高、毒性大和制作工藝復雜的問題。
[0006]為了實現上述目的，本發明涉及的多肽修飾的金納米簇的制備方法，具體工藝步驟如下:
[0007](I)用超純水分別配置 20mmol/L 的 HAuCl4、20mmol/L 的 KRKC 和 20mmol/L 的 GSH 溶液，將玻璃瓶用王水浸泡處理，清洗干凈后烘干備用；
[0008](2)向處理好的玻璃瓶內先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均勾，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可觀察到反應體系顏色由無色變為淡黃色，最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmo 1/L ；
[0009](3)將加入反應物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內，70°080°(:恒溫反應1211;
[0010](4)反應結束后，將樣品轉移到離心管中離心除去大分子顆粒物質，將離心上清液中剩余的未反應原料及小分子物質除去得到金納米簇；
[0011]步驟(4)中離心上清液采用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾，或采用透析或外加甲醇、乙醇和丙酮中的任一種離心沉降處理得到金納米簇;所述KRKC的中文全稱為賴氨酸一精氨酸一賴氨酸一半胱氨酸，所述GSH的中文全稱為谷氨酸一半胱氨酸一甘氨酸。
[0012]上述方法制備的多肽修飾的金納米簇，其粒徑為1.5-2.8nm范圍內，平均顆粒直徑為1.9nm，金納米簇在400nm附近有明顯的吸收峰，當用400nm的激發光對金納米簇照射時，在500-750nm區間有較強的熒光發射，發射峰在586nm附近，金納米簇的熒光量子產率為7%。
[0013]與現有技術相比，本發明涉及的多肽修飾的金納米簇的合成方法簡單，操作性強，成本低，材料表面用多肽穩定，生物親和性好，采用多肽多為穩定劑毒性低，穩定性好，發射波長，利于得到更好的核仁成像效果，此外，合成的納米材料對細胞核仁有特異性標記，相對于比較常規的富芳環的熒光探針，這是一種全新的材料，為核仁的研究提供了新的思路與方法。
【附圖說明】
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[0014]圖1為本發明涉及的KRKC和GSH多肽的結構示意圖。
[0015]圖2為本發明涉及的多肽修飾的金納米簇的透射電子顯微鏡表征圖。
[0016]圖3為本發明涉及的多肽修飾的金納米簇的紫外可見吸收光譜圖。
[0017]圖4為本發明涉及的多肽修飾的金納米簇的熒光發射光譜。
[0018]圖5為本發明涉及的多肽修飾的金納米簇(A)和商品化細胞核仁探針SYT0RNA-Select(B)分別與細胞共育5小時的熒光成像效果圖。
[0019]圖6為本發明涉及的多肽修飾的金納米簇與商品化SYTORNA-Select分別與細胞共育之后在激光連續照射的條件下不同采集時間點成像效果對比圖。
【具體實施方式】
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[0020]下面結合附圖和實施例對本發明做進一步說明:
[0021]實施例1:
[0022]本實施例涉及的多肽修飾的金納米簇的制備方法，具體工藝步驟如下:
[0023](I)用超純水分別配置 20mmol/L 的 HAuCl4、20mmol/L 的 KRKC 和 20mmol/L 的 GSH 溶液，將玻璃瓶用王水浸泡處理，清洗干凈后烘干備用；
[0024](2)向處理好的玻璃瓶內先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均勻，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可觀察到反應體系顏色由無色變為淡黃色，最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmo 1/L ；
[0025](3)將加入反應物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內，70°(:-80°(:恒溫反應1211;
[0026](4)反應結束后，將樣品轉移到離心管中離心除去大分子顆粒物質，將離心上清液采用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾去除剩余的未反應原料及小分子物質得到金納米簇；所述KRKC的中文全稱為賴氨酸(Lysine，K)—精氨酸(Arginine，R)—賴氨酸(Lysine,K)—半胱氨酸(Cysteine，C)，所述GSH的中文全稱為谷氨酸(Glutamic acid，E)—半胱氨酸(Cysteine，C)—甘氨酸(Glycine，G)，購買于上海強耀生物科技有限公司。
[0027]由圖1-4可知，本實施例制備得到的金納米簇顆粒分散均勻，而且粒徑分布范圍相對較窄，其粒徑為1.5-2.8nm范圍內，平均顆粒直徑為1.9nm，金納米簇在400nm附近有明顯的吸收峰，當用400nm的激發光對金納米簇照射時，在500_750nm區間有較強的熒光發射，發射峰在586nm附近，金納米簇的熒光量子產率為7%。
[0028]應用例1:
[0029]將實施例1制備的金納米簇配置成400yg/ml的溶液與人纖維肉瘤細胞(HT1080)在37°C，C02含量5%的恒溫培養箱內共同孵育5小時得到細胞爬片;將上述細胞爬片用4%多聚甲醛固定后，用共聚焦激光掃描系統成像，成像條件100X油鏡在405nm的激光激發，信號收集通道552-617nm 及662-737nm。
[0030]對比例1:
[0031]將商品化細胞核仁探針(SYTO RNA-Select，400yg/ml)與人纖維肉瘤細胞(HT1080)在37 °C，CO2含量5%的恒溫培養箱內共同孵育5小時得到細胞爬片;將上述細胞爬片用4%多聚甲醛固定后，用共聚焦激光掃描系統成像，成像條件100X油鏡在405nm的激光激發，信號收集通道552-617nm及662-737nm0
[0032]圖5為多肽修飾的金納米簇(A)與商品化SYTORNA-Select(B)分別與細胞共育2小時的熒光成像效果對比圖。可以看出多肽修飾的金納米簇與SYTORNA-SeIect的細胞內定位相同，因此，多肽修飾的金納米簇KCK-AuNCs可以對細胞的核仁部位進行靶向標記。圖6為多肽修飾的金納米簇與商品化SYTORNA-Select與細胞共育之后在激光連續照射條件下不同時間點成像效果的比較。如圖所示，在6分鐘的連續照射的成像條件下，熒光金納米簇能夠較好地維持其熒光強度，而SYTO RNA-Select的強度迅速下降，說明熒光金納米簇對比SYTORNA Select具有更好的光穩定性。
[0033]實施例2:
[0034]本實施例涉及的多肽修飾的金納米簇的制備方法，具體工藝步驟如下:
[0035](I)用超純水分別配置 20mmol/L 的 HAuCl4、20mmol/L 的 KRKC 和 20mmol/L 的 GSH 溶液，將玻璃瓶用王水浸泡處理，清洗干凈后烘干備用；
[0036](2)向處理好的玻璃瓶內先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均勻，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可觀察到反應體系顏色由無色變為淡黃色，最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmo 1/L ；
[0037](3)將加入反應物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內，80°C恒溫反應12h;
[0038](4)反應結束后，將樣品轉移到離心管中離心除去大分子顆粒物質，將離心上清液外加甲醇、乙醇和丙酮中的任一種離心沉降處理去除未反應原料及小分子物質得到金納米簇;所述KRKC的中文全稱為賴氨酸(Lysine，K)—精氨酸(Arginine，R)—賴氨酸(Lysine，K)—半胱氨酸(Cysteine，C)，所述GSH的中文全稱為谷氨酸(Glutamic acid，E)—半胱氨酸 (Cysteine，C)—甘氨酸(Glycine，G)，購買于上海強耀生物科技有限公司。
【主權項】
1.一種多肽修飾的金納米簇的制備方法，其特征在于具體工藝步驟如下: (1)用超純水分別配置20mmol/L的HAuCl4、20mmol/L的KRKC和20mmol/L的GSH溶液，將玻璃瓶用王水浸泡處理，清洗干凈后烘干備用； (2)向處理好的玻璃瓶內先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均勻，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可觀察到反應體系顏色由無色變為淡黃色，最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmol/L; (3)將加入反應物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內，70°C -80 °C恒溫反應12h ； (4)反應結束后，將樣品轉移到離心管中離心除去大分子顆粒物質，將離心上清液中剩余的未反應原料及小分子物質除去得到金納米簇； 步驟(4)中離心上清液采用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾，或采用透析或外加甲醇、乙醇和丙酮中的任一種離心沉降處理得到金納米簇;所述KRKC的中文全稱為賴氨酸一精氨酸一賴氨酸一半胱氨酸，所述GSH的中文全稱為谷氨酸一半胱氨酸一甘氨酸。2.—種權利要求1所述的方法制備的金納米簇，其特征在于金納米簇粒徑為1.5-2.8nm范圍內，平均顆粒直徑為1.9nm，金納米簇在400nm附近有明顯的吸收峰，當用400nm的激發光對金納米簇照射時，在500-750nm區間有較強的熒光發射，發射峰在586nm附近，金納米簇的熒光量子產率為7 %。
【文檔編號】C09K11/58GK106085420SQ201610389189
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月2日 公開號201610389189.7, CN 106085420 A, CN 106085420A, CN 201610389189, CN-A-106085420, CN106085420 A, CN106085420A, CN201610389189, CN201610389189.7
【發明人】王曉娟, 曲劍波, 王雅楠, 黃方, 何化, 王生杰
【申請人】中國石油大學(華東)