一種小檗堿親和標記探針及其制備方法

一種小檗堿親和標記探針及其制備方法
【專利摘要】一種小檗堿親和標記探針及其制備方法屬于生物檢測領域。探針包括：活性基團小檗堿、親和標記基團、連接部位和報告基團四個功能部位。此小檗堿標記探針與靶蛋白作用后，通過光照使親和標記基團分解，得到活潑的中間體，從而使探針分子與靶點蛋白共價結合，將靶標蛋白調出，確定靶標蛋白。本探針可用于小檗堿與機體、組織、細胞、菌體作用后靶標的探究。此小檗堿親和標記探針基于活性小分子與靶標蛋白之間的作用，具有方便、準確、靈敏高、適用于非模式生物的特點，其靈敏度明顯高于蛋白質光譜探針、RNA干擾。小檗堿親和標記探針可用于釣取人體、實驗動物和微生物中的靶標蛋白，具有重要生物和醫學應用價值。
【專利說明】
一種小檗堿親和標記探針及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種高靈敏小檗堿親和標記探針及其制備方法，屬于生物技術、生物 檢測領域。
【背景技術】
[0002] 小檗堿為異喹啉類生物堿，是中藥黃連、黃柏等的主要成分。文獻表明，小檗堿對 痢疾桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、金黃葡菌球菌等有抑制作用，傳統主要用于治療腸道感 染及菌痢等。現代藥理學證明小檗堿具有顯著的抗心力衰竭、抗心律失常、降低膽固醇、抗 制血管平滑肌增殖、改善胰島素抵抗、抗血小板、抗炎、抗癌等作用，且具有顯著的耐藥性消 除作用，因而在心血管系統、抗炎、神經系統疾病方面具有廣闊的應用前景，堪稱老藥新用 的典范。小檗堿對部分真菌病害有抑制作用，2013-2014年期間先后有十四家農藥企業申請 以小檗堿為主要成分防治植物病原真菌的田間試驗，主要用于褐腐病、白粉病、灰霉病、晚 疫病等病蟲害的防治，說明小檗堿作為農藥殺菌劑已被越來越多的科技工作者所關注。
[0003] 作為傳統抗細菌藥物，小檗堿的抗細菌機制研究較多。有報道認為小檗堿與蛋白 或膜蛋白的非特異性結合是其抗菌的主因，研究發現小檗堿對G+菌的stortase酶、轉肽酶 的活性有很強抑制作用，推斷抑制上述酶的活性是小檗堿的抗菌機制之一。90%的藥物靶 標為蛋白質，小分子藥物靶標絕大多數是蛋白質，如酶、受體、離子通道等。確定靶蛋白的方 法有很多，包括基因芯片技術、生物信息學、化學基因組學、親和色譜技術等，但這些技術大 都適用于模式生物細胞中靶標的發現。對于非模式生物，小檗堿親和標記探針是發現未知 靶蛋白的有效手段，本發明一種高靈敏小檗堿親和標記探針是活性小分子探針，它基于活 性小分子與靶標蛋白之間的作用，具有方便、準確的特點。經大量查詢，未發現以親和標記 探針研究小檗堿作用靶點的文獻。
[0004]

【發明內容】

[0005] 小檗堿是一種異喹啉類生物堿，其分子結構如下：
[0006]
[0007] -種小檗堿親和標記探針，其特征在于:探針包括活性基團、親和標記基團、連接 部位、報告基團四部分;是活性基團為小檗堿;親和標記基團是氮苯、氮雜苯、苯基疊氮、苯 甲基三氟雙吖丙啶、二苯甲酮、苯并三哇類、鄰羥基二苯甲酮類、Tinuvin 400，Cya-sorb UV 1164，Tinuvin 1577中的一種或幾種。
[0008] 報告基團與親和基團連接基團為RhRi為三乙二醇、聚乙二醇、C原子數n = 5-7的長 鏈烷烴;親和基團與小檗堿活性基團連接基團為R2，R2為乙二胺，乙酰胺，乙胺，C原子數n = 2-4的長鏈烷烴等中的一種或幾種。
[0009] 報告基團為：多肽標簽、熒光素如？11^、1^1〇(1&1^116、？41、8001?￥、〇73、〇75以及生物 素等。
[0010]探針與靶點蛋白接觸后，在紫外光照射下，（照射距離3-5cm，震蕩下光照15-30min，光照波長300-375nm。）親和標記基團分解，得到活潑的中間體，中間體可與革E1點蛋白 共價結合，將靶標調出。其基本結構如下（其中報告基團以生物素為例，親和基團以苯甲基 三氟雙吖丙啶為例，連接基團為Ri，R 2):
[0011]
[0012]部分化合物結構如下：
[0015] 其中Y1制備反應路線如下：
[0016] 以小檗堿(^61^61'；[116，13131041為起始原料，經真空裂解得到小檗紅堿42,42與鹵代 物R2X反應，進行連接臂的延長得到A3,然后將A3與經過以B2為起點制得的B1反應，得到小 檗堿親和標記探針BBR-BP。
[0017]其中B1為報告基團與親和基團連接物。
[0018]
[0019] 通常，小檗堿A1經高溫反應制得A2在真空下進行，用乙醇或者水進行重結晶，得到 A2，A2酚羥基成醚一般在N-N二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙腈中，以碳酸鉀、碳酸銫、氫氧化 鈉作為縛酸劑，反應溫度為20_90°C，反應時間為2-22h，反應結束后，一般用乙酸乙酯，二氯 甲烷，氯仿等溶劑萃取，經飽和食鹽水洗，真空除溶劑，硅膠柱層析得到A3,產物用NMR等方 法證明。
[0020] A3與B1的連接，一般在二氯甲烷，DMF或混合溶劑，加入催化劑二環己基碳二亞胺 (DCC)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，1 -羥基苯并三唑(HoBt)等進行縮合，反應溫度0-80 °C，反應 時間為l_28h，反應完成后一般真空除溶劑，用乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷等溶劑萃取，洗滌， 除溶劑，硅膠柱層析得到目標探針BBR-BP。產物通過NMR，MS等方法證明。
[0021] 這種高靈敏小檗堿親和標記探針及其制備方法，其特征是小檗堿親和標記探針用 于研究或探討小檗堿作用于人體、動物和微生物的靶標蛋白。
【具體實施方式】
[0022] 現結合實例詳細說明本發明的技術方案。所有的實例都嚴格按照上述的制備方法 的操作步驟進行操作
[0023] 實施例1:
[0024] 小檗紅堿A2的制備
[0025] 9.0g(25mmol)小檗堿于250ml三口燒瓶內，將燒瓶抽真空，于195°C，機械攪拌2h。 反應完畢后，將粗產物溶于250ml無水乙醇，過濾出去不溶物。蒸干溶劑，硅膠柱層析，體積 比（甲醇：二氯甲烷=1:15)，得紅色固體（6.35g, 19.7mmol)，產率78.8^,11^^(4001?， DMS0)511.23(s,1H) ,9.89(s , lH), 8.82(s , lH) ,8.09(d ,J = 9. OHz , lH) ,7.79(d ,J = 5.3Hz , 1H) ,7.69(d ,J = 8.9Hz,lH),7.07(s,lH) ,6.17(d ,J = 4.3Hz,2H) ,4.89(t ,J = 6.1Hz ,2H), 4· 03(s, 3H), 3 · 22-3 · 14(m, 2H) ·HRMS(ESI):計算值Ci9Hi6N〇4+322 · 1079,實測值322 · 1079 · [0026] 實施例2:
[0027]小檗紅堿連接臂A3的制備：
[0028] 100ml單口燒瓶中，化合物六2(0.58，1.55111111〇1)溶于351111乙腈中，加入帶保護的溴 乙胺（R2X)(433.05mg，l .93mmol，1.3equiv)，碳酸銫（970.943mg)，氫氧化鈉（60mg)，60°C磁 力攪拌16h，反應結束后，過濾，濾液蒸干溶劑，硅膠柱層析，體積比（甲醇：二氯甲烷=1: 10)，得黃色固體（340mg，0 · 73mmo 1)，產率 49 · 13 %。4 MMR( 400MHz，DMSO )S9.88(s，lH), 8.95(d ,J = 6.9Hz,lH),8.19(d ,J = 8.9Hz,lH),8.00(dd ,J=17.0,9.1Hz,lH),7.80(s,lH), 7.11(d ,J=14.8Hz,2H),6.18(s,2H),4.95(d ,J=17.9Hz,2H),4.34(t ,J = 5.1Hz,2H),4.03 (d,J=14.0Hz,3H) ,3.41( t,J= 11.5Hz, 2H) ,3.22(d,J = 5.5Hz,2H) ,1.40-1.25(m,9H) .HRMS(ESI):計算值C26H29N2〇6+465 · 2026,實測值465 · 2023.
[0029] 實施例3:
[0030] 化合物B3的制備：
[0031] 于25ml單口燒瓶中，化合物B2 (80mg，0 · 347mmol)溶于10ml無水DMF，加入RiX (132 · 4mg，0 · 424mmo 1)，四丁基碘化銨33mg，K2C〇364mg，70°C磁力攪拌12h。反應完畢后，向反 應液加入15ml水，用乙酸乙酯萃取3次，飽和氯化鈉洗。有機相無水Na 2S〇4干燥。硅膠柱層 析，體積比（乙酸乙酯：石油醚=1:5)，得黃色油狀物B3 (0.112g，0.243mmo 1)，產率69.83 % ,Η NMR(400MHz，CDCl3)Sl0.47(s，lH)，7.84(d，J = 8.1Hz，lH)，6.86(d，J = 8.2Hz，lH)，6.75 (s,lH),4.98(s,lH),4.28-4.22(m,2H),3.74-3.67(m,2H),3.66-3.60(m,2H),3.57-3.49 (m,2H),3.31(d ,J = 5.0Hz,2H),1.43(s,9H).
[0032] 實施例4:
[0033] 化合物M的制備：
[0034] 于5ml單口燒瓶中，加入化合物B3(0. lg，0.217mmol)，溶于lml二氯甲烷中，在冰水 浴下滴加三氟乙酸-二氯甲烷lml (體積比TFA: CH2C12= 1:1)，磁力避光攪拌lh。反應完畢后， 蒸干溶劑，將殘余物溶于lmlDMF中，后向反應液中加入三乙胺98μ1，加入溶于lmlDMF中的報 告基團生物素(81.38mg，238.39ymol，1 · lequiv)，磁力攪拌過夜。反應完畢后，蒸干溶劑，將 殘渣溶于甲醇與二氯甲烷中，分別用1N氫氧化鈉洗，飽和氯化鈉溶液洗，1N鹽酸洗，飽和氯 化鈉溶液洗，無水硫酸鈉干燥。硅膠柱層析，體積比（甲醇:二氯甲烷=1:10)。得無色固體Μ (6811^，115.724111〇1)，產率53.4%。1!1匪1?(4001抱，0)(：13)37.75(8，1!〇,7.09((1，了 = 20.0抱， 2H)，5.64(s，lH)，5.54(s，lH)，5.37(s，lH)，4.59(m，lH)，4.30(m，2H)，4.07(m，lH)，3.71(d， J = 39.9Hz,4H),3.49(m ,J= 17.4Hz, 5H), 3.32-3.07(m,4H), 2.13(m,2H),1.94(m,lH), 1.70 (m, J = 8 · 1Hz , 3H), 1 · 25(m, 2H) · HRMS(ESI):計算值C25H32F3N5〇6S[M+H]+587 · 2025,實測值[M+ Η]+588·2082·
[0035] 實施例5:
[0036] Y1,BBR_BP 的制備：
[0037] 取101111單口燒瓶，將化合物81(42.8611^，71.01以111〇1)溶于3111101^中，加入81摩爾 數的百分之一量的DCC，攪拌0.5h，后將化合物A3 (50mg)溶于3ml DMF中，加入到反應液中， 并加入適量(B1摩爾數的百分之一量的DCC，）DMAP,磁力攪拌室溫攪拌10h至反應完全。蒸干 溶劑。硅膠柱層析，體積比（甲醇:二氯甲烷=1:10)，得產物BBR-BP(34.6mg，34.32μπιο 1).產 率48 · 33% DHRMS(ESI):計算值C48H54F3N80iiS+1007 · 3585，實測值 1007 · 3569。
[0038] 實施例6:
[0039] 小檗堿親和標記探針活性測定:制備含有小檗堿親和標記探針的PDA培養基，該探 針終濃度分別為1.7、3.3、6.7、13.3、26.7yg/mL，并有一組PDA培養基加入等量的無菌水作 為空白對照組，每組濃度設置三個重復。另外設置同濃度小檗堿作對照。取出培養好的桃褐 腐菌(Monilinia fructicola)平板，無菌操作條件下，用打孔器打取菌塊，每次打取菌塊直 徑約為8 mm，接種菌塊貼到各個培養基平板的中心處（菌絲朝下），待菌餅貼好后（培養約 24h)倒置平板，27°C恒溫培養箱培養。用十字交叉法測定菌徑大小，每隔24h記錄一次生長 情況，據此通過公式計算抑制率。
[0040] 菌落直徑(mm)=測量菌落直徑平均值(_)-8
[0041 ]殺菌劑對桃褐腐菌抑制率（％ )=(空白對照組菌落直徑-帶探針組菌落)/空白對 照組菌落直徑XI00 %
[0042]選取84h的生長情況進行分析，小檗堿親和探針對桃褐腐菌有明顯的抑菌作用，隨 著小檗堿探針濃度的增大，對桃褐腐菌的抑制作用越明顯，在小檗堿探針濃度達26.7yg/mL 時，抑菌率89.6 %，小檗堿探針EC5Q = 6.64yg/mL，見表1。
[0043] 表1小檗堿親和探針對桃褐腐菌菌絲生長的抑制(84h)
[0044]
[0045] 選取84h的生長情況進行分析，小檗堿對桃褐腐菌有明顯的抑制作用，隨著小檗 堿濃度的增大，對桃褐腐菌的抑制作用越明顯，在小檗堿濃度達26.7yg/mL時，抑菌率達 87 · 6 %，小檗堿EC5q = 8 · 32yg/mL，見表2。
[0046] 表2小檗堿對桃褐腐菌菌絲生長的抑制(84h)
[0047]
[0048] 由表1、2可知，小檗堿親和探針對桃褐腐菌抑制作用與小檗堿沒有明顯區別，說明 此小檗堿親和探針與小檗堿具有生物活性，可用于用于釣取人體、實驗動物和微生物中的 革巴標蛋白。
【主權項】
1. 一種小築堿親和標記探針，其特征在于:探針包括活性基團、親和標記基團、連接部 位、報告基團四部分;是活性基團為小築堿;親和標記基團是氮苯、氮雜苯、苯基疊氮、苯甲 基Ξ氣雙叮丙晚、二苯甲酬、苯并Ξ哇類、鄰徑基二苯甲酬類、Tinuvin 400，Cya-so;rb UV 1164，Tinuvin 1577中的一種或幾種。2. 根據權利要求1所述探針，其特征在于:報告基團與親和基團連接基團為為Ξ乙 二醇、聚乙二醇、C原子數n = 5-7的長鏈燒控;親和基團與小築堿活性基團連接基團為R2，R2 為乙二胺，乙酷胺，乙胺，C原子數n = 2-4的長鏈燒控中的一種或幾種。3. 根據權利要求1所述探針，其特征在于:報告基團為:多膚標簽、巧光素或生物素。4. 根據權利要求1所述探針，其特征在于結構是下列任一化合物：5.制備如權利要求1所述的探針方法，當W生物素為報告基團，苯甲基Ξ氣雙叮丙晚為 親和基團，包括如下步驟：W小築堿Α1為起始原料，經真空裂解得到小築紅堿Α2，Α2與漠乙 胺反應，其中一端氨基被保護R巧進行連接臂的延長得到A3，然后將A3與經過Β2與RiX反應的 產物為起點制得的B1反應，得到小築堿親和標記探針BBR-BP; 町X結構為6.應用如權利要求1-4任意一項所述探針，其特征是用于研究或探討小築堿作用于人 體、動物和微生物的祀標蛋白。
【文檔編號】C09K11/06GK106085415SQ201610562804
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月16日
【發明人】田平芳, 尹鳴, 尹一鳴, 李映, 曹哲統
【申請人】北京化工大學