基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針及其合成方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針及其合成方法和應用，屬于蛋白質檢測技術領域。該熒光探針具有化學穩定性好、生物兼容性好，響應速度快、靈敏度高、響應范圍寬、檢出限低等優點，能夠即時、在線的測定蛋白質。用本發明熒光探針可對非金屬蛋白中的牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HSA)進行選擇性檢測，檢出限可分別達到19.8nmol/L(1.32μg/mL)和24.5nmol/L(1.64μg/mL)。
【專利說明】
基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針及其合成方法和 應用
技術領域
[0001] 本發明屬于蛋白質檢測技術領域，涉及一種在水相中測定蛋白質的熒光探針及其 合成方法和檢測方法，具體涉及一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針及其合成方 法和應用。
【背景技術】
[0002] 蛋白質是生命體內重要的生物大分子，是生命活動的物質基礎，是構成生物體內 一切組織的基礎物質，機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質的參與，因此 它與各種形式的生命活動有著緊密的聯系。同時蛋白質翻譯后的修飾、蛋白質間相互作用、 蛋白質構象等問題，仍依賴于通過對蛋白質的研究來解決。因此蛋白質的特異性識別和定 量分析方法研究將直接推動蛋白質組學研究，并且蛋白質組學研究的進一步深入，將對藥 物篩選、臨床診斷以及生命奧秘的揭示等領域的發展起到決定性的作用。
[0003] 目前，定量分析痕量蛋白質的方法有分光光度法、熒光光度法、共振瑞利散射光譜 法、化學發光法、酶聯免疫吸附法、等離子體共振法、納米粒子法、過渡金屬羰基碎片法等。 在眾多蛋白痕量檢測方法中，熒光分析法以其選擇性好、靈敏度高、動態響應范圍寬、測試 條件更加接近生命體的生理環境以及可以實時在線檢測，能夠成像和輸出信號豐富等優點 而被廣泛地應用于蛋白質分析。因此，利用熒光傳感器實現對各種蛋白質檢測分析的方法 備受關注。
[0004] 然而，現有的檢測蛋白的熒光探針分子對分子合成技術以及分子的選擇性有著高 度的依賴性，且大多疏水性較強，限制其在水溶液中的應用以及對生物檢測對象的傳感。并 且部分熒光化學傳感器存在檢測耗時長、靈敏度低等不足。而兩親性膽酸分子具有良好的 生物兼容性、化學穩定性以及面雙親結構，因此可以在水中形成特定的非共價超分子聚集 體，并且利用膽酸衍生物聚集體的熒光傳感器對蛋白質的檢測幾乎沒有報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針及其合成 方法和應用，該熒光探針靈敏度高、選擇性好、測試范圍廣;該合成方法操作簡單，對設備要 求低，適合放大生產;該熒光探針能夠廣泛應用于蛋白質的檢測工作中。
[0006] 本發明是通過以下技術方案來實現：
[0007] -種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針，該熒光探針的結構式如下：
[0009] 式中，n = 2、3或 4。
[0010] 本發明還公開了上述基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，包括 以下步驟：
[0011] 1)合成芘磺酰基衍生物
[0012] 在氮氣氣氛及冰浴條件下，將芘磺酰氯的三氯甲烷溶液滴加到二氨基含氧烷烴的 三氯甲烷溶液中，滴加完畢后，室溫攪拌反應2~8h，然后將反應液洗滌、干燥、蒸除溶劑三 氯甲烷，再將反應物經過柱層析分離純化，制得結構式如下的芘磺酰基衍生物：
[0014] 式中，n = 2、3或 4;
[0015] 2)合成末端為溴的芘磺酰基衍生物
[0016] 在氮氣氣氛及冰浴條件下，將溴乙酰溴的二氯甲烷溶液滴加到芘磺酰基衍生物和 三乙胺的二氯甲烷溶液中，滴加完畢后繼續反應24~30h，將反應物經過柱層析分離純化， 制得結構式如下的末端為溴的芘磺酰基衍生物：
[0018] 3)合成基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針
[0019]在氮氣氣氛下，將膽酸鈉加入末端為溴的芘磺酰基衍生物和碘化鈉的N，N-二甲基 甲酰胺溶液中，在70~80°C下加熱回流5~12h，待反應液冷卻到室溫后，蒸除溶劑N，N-二甲 基甲酰胺，洗滌后萃取，然后干燥，再經過柱層析分離純化，得到基于膽酸修飾的兩親性芘 衍生物熒光探針。
[0020]步驟1)中，芘磺酰氯與二氨基含氧烷烴的摩爾比為1: (5~10);二氨基含氧烷烴為 1，8-二氨基-3，6_二氧辛燒、3，6，9_二氧雜十一燒-1，11-二胺、或3，6，9，12-四氧雜十六燒-1，16-二胺。
[0021 ]步驟1)中，所述洗滌是用飽和食鹽水洗6~7次;所述干燥是用無水硫酸鈉干燥過 夜;所述柱層析分離純化是采用二氯甲烷與甲醇按體積比為(20~40) :1配成的混合溶劑作 為洗脫劑進行過柱分離。
[0022]步驟2)中，芘磺酰基衍生物、溴乙酰溴及三乙胺的摩爾比為1: (1.5~3): (1~2)。 [0023]步驟2)中，調節滴加速度為5~6s/滴;所述柱層析分離純化是采用乙酸乙酯與石 油醚按體積比為(2~10): 1配成的混合溶劑作為洗脫劑進行過柱分離。
[0024] 步驟3)中，末端為溴的芘磺酰基衍生物、膽酸鈉及碘化鈉的摩爾比為1: (1.5~5): (1.5 ~5)〇
[0025] 步驟3)中，所述洗滌是用飽和食鹽水洗3~4次;所述萃取是用二氯甲烷進行萃取； 所述干燥是用無水硫酸鈉干燥過夜;所述柱層析分離純化是采用二氯甲烷與甲醇按體積比 為(15~30):: 1配成的混合溶劑作為洗脫劑進行過柱分離。
[0026] 步驟1)、2)、3)中控制氮氣流速為0 · 6~0 · 8mL/s。
[0027] 本發明還公開了上述基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針在檢測蛋白質中 的應用，其特征在于，所述的蛋白質為牛血清蛋白或人血清蛋白。
[0028] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0029] 本發明公開了一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針，該探針以熒光量子 產率高、對微環境敏感、熒光輸出信號豐富的芘為報告基團，以含有寡聚乙氧基和仲胺基的 鏈狀分子為親水性連接臂，通過引入生物兼容性好、具有面雙親結構的膽酸基團，制備了具 有自組裝能力的膽酸修飾的芘衍生物。該分子探針引入的膽酸具有面雙親結構保證了其在 水相中的聚集，而引入的芘基團具有單體和激基締合物多重熒光發射的特點，有望賦予聚 集體系多波長交互響應識別性能，為創建新型的超分子熒光傳感體系提供了可能。此處需 要對該熒光探針的結構特點做出闡述，分析其優勢。該基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒 光探針的化學穩定性好、生物兼容性好、響應速度快、選擇性好，可直接進行檢測。
[0030] 本發明公開的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法操作簡單，對 設備要求低，適合放大生產。用本發明熒光探針可對非金屬蛋白中的牛血清蛋白（BSA)和人 血清蛋白（HSA)進行選擇性檢測，檢出限可分別達到19.8nmol/L( 1.32yg/mL)和24.5nmol/L (1·64yg/mL)。
【附圖說明】
[0031] 圖1是本發明實施例1制備的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針檢測牛血 清蛋白溶液的熒光強度變化曲線圖；
[0032] 圖2是本發明實施例1制備的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針檢測牛血 清蛋白溶液的濃度-Im/Ie值關系曲線圖；
[0033] 圖3是本發明實施例1制備的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針檢測人血 清蛋白溶液的熒光強度變化曲線圖；
[0034] 圖4是本發明實施例1制備的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針檢測人血 清蛋白溶液的濃度-Im/Ie值關系曲線圖；
[0035] 圖5是本發明實施例1制備的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針對8種蛋白 質中牛血清蛋白和人血清蛋白的區分圖。
【具體實施方式】
[0036] 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而 不是限定。
[0037] 本發明公開了一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針，該熒光探針的結構 式如下：
[0039] 式中，η為2或3或4。
[0040]上述由膽酸修飾的芘熒光探針的合成方法由下述步驟組成：
[0041 ] 1)合成芘磺酰基衍生物
[0042]在流速為0.6~0.8mL/s的氮氣保護和冰浴條件下，按摩爾比為1:10將芘磺酰氯的 三氯甲烷溶液滴加到二氨基含氧烷烴的三氯甲烷溶液中，滴加完后室溫攪拌2小時，將反應 液用飽和食鹽水洗6~7次，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，蒸除三氯甲烷，用二氯甲烷與甲醇 的體積比為30:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產物，得到式I所示的芘磺酰基衍生物， 其反應方程式如下：
[0044] 上述的二氨基含氧烷烴為1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷、3，6，9-三氧雜^^一烷_1， 11-二胺、3,6,9,12-四氧雜十六烷-1,16-二胺中的任意一種。
[0045] 2)合成末端為溴的芘磺酰基衍生物
[0046] 在流速為0.6~0.8mL/s的氮氣保護和冰浴條件下，將溴乙酰溴的二氯甲烷溶液滴 加到芘磺酰基衍生物和三乙胺的二氯甲烷溶液中，調節滴加速度為5~6s/滴，芘磺酰基衍 生物、溴乙酰溴、三乙胺的摩爾比為1: (1.5~2): (1~1.5 )，滴加完成后繼續反應24h，用乙 酸乙酯與石油醚的體積比為2:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產物，得到式Π 所示的 末端為溴的芘磺酰基衍生物，其反應方程式如下：
[0048] 3)合成基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針
[0049] 在流速為0.6~0.8mL/s的氮氣保護條件下，將膽酸鈉加入末端為溴的芘磺酰基衍 生物和碘化鈉的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，末端為溴的芘磺酰基衍生物、膽酸鈉、碘化鈉的 摩爾比為1:2:1.5,70°(：加熱回流51 1，待反應液冷卻到室溫后，蒸除叱1二甲基甲酰胺溶劑， 用飽和食鹽水洗滌3~4次，加入二氯甲烷萃取，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，用二氯甲烷與 甲醇的體積比為20:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產物，得到式m所示的基于膽酸修 飾的兩親性芘衍生物熒光探針，其反應方程式如下：
[0051]上述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針在檢測蛋白質中的用途，所述的 蛋白質為牛血清白蛋白或人血清白蛋白，其檢測方法如下：
[0052] 1、配制溶液
[0053] 將50yL濃度為2.5 X 10-3mol/L兩親性芘衍生物熒光探針的乙腈溶液加入25mL容量 瓶中，加 HEPES緩沖溶液（10mm〇l/L，pH 7.4)定容至刻度線，配制成5以111〇1/1熒光探針溶液。 分別稱取一定質量的牛血清蛋白和人血清蛋白溶于10mm〇l/L HEPES緩沖溶液中，配制成 0.25mmol/L牛血清蛋白溶液和人血清蛋白溶液。
[0054] 2、繪制標準曲線
[0055] 量取2.5mL 5ymol/L熒光探針溶液于比色皿中，逐漸向其中分別滴加0.25mmol/L 牛血清蛋白溶液或人血清蛋白溶液，用毛細管攪拌使其混合均勻，所得到的溶液中牛血清 蛋白和人血清蛋白的濃度均為Ο-ΙΟμ mol/L。熒光光譜的測試均在單光子熒光光譜儀(FS5， Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發波長均為350nm，激發與發射狹縫分別 為2.0和1. Onm。待溶液達到平衡后，分別繪制熒光強度隨牛血清蛋白和人血清蛋白濃度變 化的焚光光譜圖，并通過采集單體(monomer，380nm)與激基締合物（excimer，490nm)處的焚 光強度，繪制Im/Ie值隨蛋白質濃度變化的標準曲線。
[0056] 3、檢測待測樣品
[0057]按照上述方法用熒光儀測量待測蛋白質樣品的熒光強度，根據待測蛋白質樣品的 Im/Ie值和濃度，結合標準曲線的線性方程即可確定人血清蛋白或牛血清蛋白。
[0058]本發明基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的化學穩定性好、生物兼容性 好、響應速度快、選擇性好，可直接進行檢測，如FS5、FLS920型單光子計數時間分辨熒光光 譜儀或其他類似的光學檢測器，實現對牛血清蛋白和人血清蛋白的選擇性檢測。
[0059] 實施例1
[0060]合成結構式如下的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針：
[0062]其合成方法包括如下步驟：
[0063] 1)合成芘磺酰基衍生物
[0064]在流速為0.6~0.8mL/s的氮氣保護和冰浴攪拌條件下，向盛有50mL三氯甲烷的三 口燒瓶中加入 1 · 47mL(9 · 97mmol) 1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷，然后將 0 · 30g(0 · 997mmol)芘 磺酰氯溶于40mL三氯甲烷中并滴加到上述溶液中。滴加完后室溫攪拌2小時，停止反應后， 將反應液用飽和食鹽水洗6~7次，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，蒸除三氯甲烷，用二氯甲烷 與甲醇的體積比為30:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產物，得到式Π 所示的芘磺酰基 衍生物，其反應方程式如下：
[0066] 2)合成末端為溴的芘磺酰基衍生物
[0067] 在流速為0.6~0.8mL/s的氮氣保護和冰浴攪拌條件下，將215yL(2.48mmol)溴乙 酰溴溶于10mL二氯甲烷中，并將其滴入溶有0.51g(1.24mmol)芘磺酰基衍生物和200yL (1.44mmol)三乙胺的二氯甲烷溶液中，調節滴加速度為5~6s/滴，滴加完成后繼續反應24 小時。用乙酸乙酯與石油醚的體積比為2:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產物，得到式 m所示的末端為溴的芘磺酰基衍生物，其反應方程式如下：
[0069] 3)合成基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針
[0070] 在流速為0.6~0.8mL/s的氮氣保護條件下，將0.84g(l.96mmol)膽酸鈉加入溶有 0.528(0.98!11111〇1)末端為溴的芘磺酰基衍生物和0.228(1.47111111〇1)碘化鈉的叱^二甲基甲 酰胺溶液中，70°C加熱回流5小時，待反應液冷卻到室溫后，蒸除N，N-二甲基甲酰胺溶劑，用 飽和食鹽水洗滌3~4次，加入二氯甲烷萃取，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，用二氯甲烷與甲 醇的體積比為20:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產物，得到式I所示的基于膽酸修飾 的兩親性芘衍生物熒光探針，其收率為57%，其反應方程式如下：
[0072]上述結構式I的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的核磁數據為：4匪R (5ppm,600MHz,CDCl3) :9.01 (1H) ,8.72(1H),8.37-8.10(7H),7.02(1H),6.35(1H),4.58 (2Η)，3·85(2Η)，3·57-3·35(11Η),3.15(2H),2.44-2.15(5H)，1.98-1·32(16Η),1.23-0.95 (6H),0.94-0.80(6H),0.60(3H).
[0073] 實施例2
[0074] 合成結構式如下的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針：
[0076]其合成方法步驟如下：
[0077] 在實施例1的合成芘磺酰基衍生物步驟1中，將所用的1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷 用等摩爾質量的3,6,9_三氧雜^^一烷-1，11-二氨替換，其它步驟與相應的實施例1相同。
[0078] 實施例3
[0079]合成結構式如下的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針：
[0081 ]在實施例1的合成芘磺酰基衍生物步驟1中，將所用的1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷 用等摩爾質量的3，6,9,12-四氧雜十六烷-1，16-二氨替換，其它步驟與相應的實施例1相 同。
[0082] 實施例4
[0083] 實施例1合成的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針在水相中檢測牛血清蛋 白的用途，其使用方法如下：
[0084] 1、配制溶液
[0085]向HEPES緩沖溶液（10mmOl/L，pH7.4)中加入基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒 光探針，配制成5ymol/L熒光探針溶液。稱取一定質量的牛血清蛋白溶于10mm〇l/L HEPES緩 沖溶液中，配制成〇. 25mmol/L牛血清蛋白溶液。
[0086] 2、繪制標準曲線
[0087] 量取2.5mL 5ymol/L熒光探針溶液于比色皿中，加入0.25mmol/L牛血清蛋白溶液， 用毛細管攪拌使其混合均勻，使得混合溶液中牛血清蛋白的濃度分別為〇.1、〇.3、0.5、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、7.0和1(^111〇1/1^。熒光光譜的測試均在單光子熒光光譜儀（？35， Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發波長均為350nm，激發與發射狹縫分別 為2.0和1. Onm。待溶液達到平衡后，繪制熒光強度隨牛血清蛋白濃度變化的熒光光譜圖，見 圖1。并通過采集單體(monomer，380nm)與激基締合物(excimer，490nm)處的焚光強度，繪制 Im/Ie值隨蛋白質濃度變化的標準曲線，見圖2。
[0088] 由圖1可見，濃度為5ymol/L的熒光探針的熒光強度隨著體系中牛血清蛋白濃度的 增大變化很明顯，說明所制備的熒光探針對牛血清蛋白的檢測靈敏度很高。由圖2可見，在 牛血清蛋白濃度為0-3. Oymol/L和3.0-ΙΟμ mol/L時，Im/Ie呈現不同的線性關系，線性方程分 別為：
[0089] yi = 1 · 510+1 · 107x 和 y2 = _4 · 636+3 · 338x
[0090] 式中ydPy2為牛血清蛋白濃度分別為0-3.0ymol/L和3.0_10ymol/L時Im/Ie值，x為 牛血清蛋白濃度，相關系數R分別為0.996和0.993。經測試，該熒光探針對牛血清蛋白的檢 出限為 19 · 8nmol/L( 1 · 32yg/mL) 〇
[0091] 3、檢測待測樣品
[0092]向2.5mL 5ymol/L熒光探針溶液中加入不同體積的待測蛋白質樣品，用熒光儀監 測傳感平臺的熒光強度，通過計算Im/Ie值和濃度，結合標準曲線的線性方程即可確定為牛 血清蛋白。
[0093] 實施例5
[0094]實施例1合成的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針在水相中檢測人血清蛋 白的用途，其使用方法如下：
[0095] 1、配制溶液
[0096]向HEPES緩沖溶液（10mmOl/L，pH7.4)中加入基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒 光探針，配制成5ymol/L熒光探針溶液。稱取一定質量的人血清蛋白溶于10mm〇l/L HEPES緩 沖溶液中，配制成〇. 25mmol/L人血清蛋白溶液。
[0097] 2、繪制標準曲線
[0098] 量取2.5mL 5ymol/L熒光探針溶液于比色皿中，加入0.25mmol/L人血清蛋白溶液， 用毛細管攪拌使其混合均勻，使得混合溶液中人血清蛋白的濃度分別為〇.1、〇.3、0.5、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、7.0和1(^111〇1/1^。熒光光譜的測試均在單光子熒光光譜儀（？35， Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發波長均為350nm，激發與發射狹縫分別 為2.0和l.Onm。待測試完畢后，繪制熒光強度隨人血清蛋白濃度變化的熒光光譜圖，見圖3。 并通過采集單體(monomer，380nm)與激基締合物(excimer，490nm)處的焚光強度，繪制Im/Ie 值隨蛋白質濃度變化的標準曲線，見圖4。
[0099] 由圖3可見，濃度為5ymol/L的熒光探針的熒光強度隨著體系中人血清蛋白濃度的 增大變化很明顯，說明所制備的熒光探針對人血清蛋白的檢測靈敏度很高。由圖4可見，在 人血清蛋白濃度為Ο-ΙΟμ mol/L時，Im/Ie與人血清蛋白濃度呈立方關系，方程為：
[0100] y = 1.375+0.450x-0.016x2+0.027x3
[0101 ]式中y為人血清蛋白濃度在Ο-ΙΟμ mol/L時Im/Ie值，x為人血清蛋白濃度，相關系數R 為0.999。經測試，該熒光探針對人血清蛋白的檢出限為24.5nmol/L( 1.64yg/mL)。
[0102] 3、檢測待測樣品
[0103] 向2.5mL 5ymol/L熒光探針溶液中加入不同體積的待測蛋白質樣品，用熒光儀監 測傳感平臺的熒光強度，通過計算Im/Ie值和濃度，結合標準曲線的線性方程即可確定為人 血清蛋白。
[0104] 為了證明本發明的有益效果，發明人按照實施例4的方法，對濃度為1.0、3.0、5.0、 7.0和lOymol/L的牛血清蛋白、人血清蛋白、胃蛋白酶、卵清蛋白、β-乳球蛋白、胰蛋白酶、溶 菌酶和魚精蛋白分別進行了測試，測試結果見圖5。由圖5可見，在相同條件下，加入8種不同 的蛋白質，只有牛血清蛋白和人血清蛋白發生明顯的比例型響應，而其他蛋白質熒光強度 均未發生明顯的變化，說明本發明的熒光探針(5μπι 〇 1 /L)在1 Ommo 1 /L HEPES緩沖溶液中（pH 7.4)可以很好地選擇性區分牛血清蛋白和人血清蛋白，然后根據蛋白質不同濃度下對應的 Im/Ie值，結合牛血清蛋白和人血清蛋白的標準曲線方程即可確定牛血清蛋白和人血清蛋 白。
[0105] 綜上所述，本發明采用兩親性熒光探針的超分子聚集體來構建熒光傳感體系，既 可以實現其在水相中的檢測，又可以實現基于動態聚集體調控的熒光傳感，減少對有機合 成的依賴。另外，我們構建的熒光化學傳感器具有響應速度快、靈敏度高、選擇性好等優點。
【主權項】
1. 一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針，其特征在于，該熒光探針的結構式 如下：式中，n = 2、3或4。2. 權利要求1所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特征在 于，包括以下步驟： 1) 合成芘磺酰基衍生物 在氮氣氣氛及冰浴條件下，將芘磺酰氯的三氯甲烷溶液滴加到二氨基含氧烷烴的三氯 甲烷溶液中，滴加完畢后，室溫攪拌反應2~8h，然后將反應液洗滌、干燥、蒸除溶劑三氯甲 烷，再將反應物經過柱層析分離純化，制得結構式如下的芘磺酰基衍生物：式中，n = 2、3或4; 2) 合成末端為溴的芘磺酰基衍生物 在氮氣氣氛及冰浴條件下，將溴乙酰溴的二氯甲烷溶液滴加到芘磺酰基衍生物和三乙 胺的二氯甲烷溶液中，滴加完畢后繼續反應24~30h，將反應物經過柱層析分離純化，制得 結構式如下的末端為溴的芘磺酰基衍生物：3) 合成基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針 在氮氣氣氛下，將膽酸鈉加入末端為溴的芘磺酰基衍生物和碘化鈉的N，N-二甲基甲酰 胺溶液中，在70~80°C下加熱回流5~12h，待反應液冷卻到室溫后，蒸除溶劑N，N-二甲基甲 酰胺，洗滌后萃取，然后干燥，再經過柱層析分離純化，得到基于膽酸修飾的兩親性芘衍生 物熒光探針。3. 根據權利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟1)中，芘磺酰氯與二氨基含氧烷烴的摩爾比為1: (5~10);二氨基含氧烷烴為 1，8-二氨基-3，6_二氧辛燒、3，6，9_二氧雜十一燒_1，11-二胺、或3，6，9，12-四氧雜十六燒-1，16-二胺。4. 根據權利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟1)中，所述洗滌是用飽和食鹽水洗6~7次;所述干燥是用無水硫酸鈉干燥過 夜;所述柱層析分離純化是采用二氯甲烷與甲醇按體積比為(20~40): 1配成的混合溶劑作 為洗脫劑進行過柱分離。5. 根據權利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟2)中，芘磺酰基衍生物、溴乙酰溴及三乙胺的摩爾比為1: (1.5~3): (1~2)。6. 根據權利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟2)中，調節滴加速度為5~6s/滴;所述柱層析分離純化是采用乙酸乙酯與石油 醚按體積比為(2~10): 1配成的混合溶劑作為洗脫劑進行過柱分離。7. 根據權利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟3)中，末端為溴的芘磺酰基衍生物、膽酸鈉及碘化鈉的摩爾比為1: (1.5~5): (1.5 ~5)〇8. 根據權利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟3)中，所述洗滌是用飽和食鹽水洗3~4次;所述萃取是用二氯甲烷進行萃取； 所述干燥是用無水硫酸鈉干燥過夜;所述柱層析分離純化是采用二氯甲烷與甲醇按體積比 為(15~30):: 1配成的混合溶劑作為洗脫劑進行過柱分離。9. 根據權利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟1)、2)、3)中控制氮氣流速為0.6~0.8mL/s。10. 權利要求1所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針在檢測蛋白質中的應 用，其特征在于，所述的蛋白質為牛血清蛋白或人血清蛋白。
【文檔編號】G01N21/64GK106047339SQ201610472271
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】丁立平, 范俊梅, 鄭德民, 卜雨, 崔華華, 房喻
【申請人】陜西師范大學