Rgd功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料、其修飾方法及應用

Rgd功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料、其修飾方法及應用
【專利摘要】本發明公開了一種RGD功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料，其修飾方法及應用，屬于納米材料領域。所述納米材料由以下修飾方法得到：(一)利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺?聚乙二醇通過配體交換方法將油酸修飾的納米粒改性為表面氨基化的水溶性粒子；(二)將羧基化的2?氰基苯并噻唑偶聯到表面氨基化的水溶性粒子表面；(三)接著在RGD功能多肽分子氨基端構建出半胱氨酸末端殘基；(四)將含有半胱氨酸殘基的多肽特異性修飾到特異性連接臂修飾的水溶性稀土上轉化納米粒表面，制成RGD功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料。與現有技術相比，本發明的稀土上轉化納米材料具有非常強的靶向腫瘤能力，具有廣泛的應用價值。
【專利說明】
RGD功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料、其修飾方法及應用
技術領域
[0001]本發明涉及納米材料領域，具體地說是一種RGD功能多肽修飾的稀土上轉化納米 材料，其修飾方法及應用。
【背景技術】
[0002] 上轉換納米材料是一種熒光納米材料，通過稀土離子的摻雜由低能量紅外或者近 紅外光激發，輻射出高能量的可見光。稀土摻雜NaYF4:Yb/Er可以通過對稀土元素摻雜比例 的調節實現多色發光，也可以通過對摻雜元素種類進行調節，實現磁學和光學的多模態信 號轉換。上轉換熒光納米材料是已知的最有效的可以實現多模態顯像的納米材料之一，在 生物分析化學和生物成像等方面有著巨大潛力。
[0003] 為了實現納米材料的生物功能，需要對其表面進行功能化修飾。在生物學功能化 方面，針對不同的生物分子，如寡聚核苷酸、蛋白質(含抗原、抗體、酶）、多肽等，不同的修飾 方法已經被用來對上轉化納米粒表面進行功能化修飾。其中將革E分子和納米粒表面之間的 氨基和羧基偶聯反應是對納米材料功能化的首選方案，比如，Sisi Cui等人(ACS Nano, 2013,1,676-688.)利用靶向葉酸受體的葉酸分子作為靶標分子，將其羧基用N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)和二環己基碳酰亞胺(DDC)活化，然后與稀土上轉化納米材料表面親水性配體殼 聚糖上氨基進行偶聯，通過酰胺鍵的形式將葉酸分子的羧基和納米顆粒表面的氨基相連 接，從而構建了靶向到癌部位的納米顆粒。但所用到的葉酸為小分子靶標，結構簡單易于結 構修飾，對于多肽或者蛋白這種方法存在明顯不足，最突出的問題就是由于多肽或者蛋白 質分子中可反應的氨基通常不止一個而使產物中存在大量的異構體，而且如果氨基恰好處 于蛋白質的生物活性位點上，則可能導致蛋白質的失活。同時，這種連接方法反應活性較 低，連接到納米材料表面的生物分子較少。
[0004] 由于上述方法在標記過程當中的非特異性標記，基于"點擊化學"的修飾方法受到 了越來越多的關注，比如Joshua I .Cutler等人(Nano·Lett ,2010，10，1477-1480)，首先將 寡核苷酸的末端構建出炔基，接著將納米粒表面修飾出疊氮基團，通過"點擊化學"將靶寡 核苷酸分子修飾在納米粒表面完成對納米粒的功能化修飾，但是炔基和疊氮基團之間的縮 合反應，通常是需要在銅離子的介導下才能完成的。眾所周知，銅作為一種常見的重金屬離 子，在生理條件下能影響生物大分子構象的變化，從而使其功能受到影響。所以，在修飾納 米材料的過程當中會不可避免的影響到納米粒表面生物大分子的功能。同時由于純化不徹 底造成銅離子的殘留，會有潛在的生物毒性。

【發明內容】

[0005] 本發明的技術任務是針對上述現有技術的不足，提供一種RGD功能多肽修飾的稀 土上轉化納米材料。
[0006] 本發明進一步的技術任務是提供上述納米材料的修飾方法。
[0007] 本發明更進一步的技術任務是提供上述納米材料的應用。
[0008] 本發明的技術任務是按以下方式實現的：RGD功能多肽修飾的稀土上轉化納米材 料，其特點是由以下修飾方法得到：
[0009] 首先利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG-OH和DSPE-PEG-Nh2)通 過配體交換方法將油酸修飾的納米粒改性為表面氨基化的水溶性粒子；
[0010] 隨后將羧基化的2-氰基苯并噻唑(COOH-CBT)偶聯到表面氨基化的水溶性粒子表 面，得到特異性連接臂修飾的水溶性稀土上轉化納米粒；
[0011] 接著在RGD功能多肽分子氨基端構建出半胱氨酸末端殘基，得到半胱氨酸修飾的 RGD功能多肽；
[0012] 最后將半胱氨酸修飾的RGD功能多肽特異性修飾到特異性連接臂修飾的水溶性稀 土上轉化納米粒表面，制成R⑶功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料。
[0013] 修飾反應式為：
[0014]
[00?5 ]作為優選，上述稀土上轉化納米材料RGD功能多肽的修飾方法包括以下步驟：
[0016] 1)表面氨基化的水溶性稀土上轉化納米材料的制備：
[0017] 取表面油酸包裹的稀土上轉化納米材料用三氯甲烷分散，加入二硬脂酰基磷脂酰 乙醇胺-聚乙二醇，超聲反應一定時間后減壓濃縮除去三氯甲烷，純化得到聚乙二醇(PEG) 修飾的表面氨基化的水溶性稀土上轉化納米材料，如采用去離子水重新分散離心，棄去上 清液(除去未包裹的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇），得到聚乙二醇(PEG)修飾的表面 氨基化的水溶性稀土上轉化納米材料；
[0018] 2)水溶性稀土上轉換納米材料表面特異性連接臂修飾：
[0019] 將羧基化的2-氰基苯并噻唑（COOH-CBT)的羧基活化，制備成琥珀酰亞胺酯溶液， 接著將氨基化的水溶性稀土上轉化納米材料用三氯甲烷分散，將制備得到的琥珀酰亞胺酯 溶液加入到納米材料分散液中，加入一定量的堿，反應完成后，除去未反應的原料(如未反 應的羧基化的2-氰基苯并噻唑），并提純得到特異性連接臂修飾的水溶性稀土上轉化納米 材料；
[0020] 3)半胱氨酸修飾的RGD功能多肽：
[0021]在R⑶功能多肽溶液中加入N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯 (B0c-NH2-Cys(Trt)-OSu)，調節體系pH值至8-8.5，使RGD功能多肽的末端氨基與N-叔丁氧 羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯偶聯制備出含有受保護半胱氨酸殘基的多肽， 接著將得到的保護性多肽在裂解液的作用下，脫去半胱氨酸的保護基團，并用半制備HPLC 純化，得到半胱氨酸修飾的RGD功能多肽；
[0022] 4)稀土上轉化納米材料表面R⑶功能化多肽修飾：
[0023]將步驟1)得到的水溶性稀土上轉化納米材料的碳酸鹽緩沖溶液，加入步驟3)得到 的半胱氨酸修飾的RGD功能多肽的碳酸鹽緩沖溶液中，同時加入防止巰基氧化的還原劑，反 應一段時間后，純化得到R⑶功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料。
[0024] 步驟1)所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG-Oi^PDSPE-PEG-NH 2) 優選為二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3000或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合液中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-NH2)的摩爾百分比率為5%-20 %，總二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇總濃度為10-40mM。超聲反應的反應時間優選為10-40min。
[0025] 步驟2)所述羧基化的2-氰基苯并噻唑(COOH-CBT)的結構式如下：
[0026]
[0027] 式中，X為氧原子或者氮原子;m為0、1、2、3或者4。
[0028]步驟2)中活化羧基所用的活化劑優選為二環己基碳酰亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)，以摩爾比計，其反應當量關系為羧基化的2-氰基苯并噻唑:二環己基碳酰亞胺： N-羥基琥珀酰亞胺= 1:(1-1.5) :(1-1.5);
[0029]所述堿為N，N-二異丙基乙胺(DIEA)和/或者三乙胺(TEA);
[0030] 加入堿后再反應時間3-5h。
[0031 ]步驟3)所述半胱氨酸修飾的RGD功能多肽具有式(I)所示的結構：
[0032]
[0033]式（I)中，半胱氨酸為L構型或者D構型。
[0034]步驟3)中，在RGD功能多肽溶液中加入N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥 珀酰亞胺酯(Boc-NH2-Cy s (Trt)-OSu)的具體方法優選為:N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-半胱 氨酸琥珀酰亞胺酯(B0c-NH 2-Cys(Trt)-OSu)先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亞砜，隨后 再將N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯(B 0c-NH2-Cys(Trt)-OSu)溶液 加入到含有R⑶功能多肽的碳酸鹽緩沖體系中，N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥 珀酰亞胺酯與RGD功能多肽的摩爾比率范圍為（I. 2-1.5):1，偶聯反應的反應時間為0.5-lh〇
[0035]步驟3)中可以選用現有技術中任意一種堿劑進行pH值調節，優先為以N，N_二異丙 基乙胺(DIEA)和/或者三乙胺(TEA)調節體系pH值至8-8.5。
[0036]步驟3)中所述裂解液可選用現有技術中任意一種裂解液，如三氟乙酸/二氯甲烷 體系或三氟乙酸/三異丙基硅烷/和去離子水體系，但為了達到最佳效果，優選為三氟乙酸 (TFA)、三異丙基硅烷(TIS)和去離子水(H 2O)的混合溶液，三氟乙酸、三異丙基硅烷和去離 子水的體積百分比為95% : 1-5% : 1-5%，反應時間為5-10min。
[0037] 步驟4)中所述還原劑優選為三（2-羰基乙基）磷鹽酸鹽(TCEP'HCl)，三(2-羰基乙 基）磷鹽酸鹽與半胱氨酸修飾的RGD功能多肽的摩爾比率范圍為（2-5):1，反應時間為5-IOmin0
[0038]通過大量實驗可以看出，本發明的R⑶功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料具有 非常強的靶向腫瘤能力，在制備腫瘤組織的靶向檢測制劑中可以得到廣泛的應用。
【附圖說明】
[0039]附圖1為實施例中脫掉半胱氨酸側鏈保護后的C(RGDfK)多肽高分辨質譜圖；
[0040]附圖2為實施例中功能性c (RGDf K)多肽對稀土上轉化納米材料修飾前后的透射電 鏡(TEM)圖；
[0041 ]附圖3為實施例中功能性C(RGDfK)多肽對稀土上轉化納米材料修飾前后在980nm 激發光激發下的熒光發射圖；
[0042]附圖4為實驗例中注射納米材料后的活體熒光成像圖。
[0043]實施方式
[0044] 下面的實施例、制劑實施例以更詳細地說明本發明，但不以任何形式限制本發明。
[0045] 【實施例1】
[0046]本發明的R⑶功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料由以下修飾方法得到：
[0047] (1)表面氨基化的水溶性稀土上轉化納米材料的制備
[0048] 稱取20.2mg的油酸包裹的稀土上轉化納米材料(OA-UCNPs)分散于IOmL三氯甲烷 中，再稱取二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3000(DSPE-PEG3Q(X)-OH和DsPE-PEG3(XX)-NH 2) 10.2mg溶于5mL的三氯甲烷，共同加入至lj50mL圓底燒瓶中，室溫下超聲處理30min，然后用減 壓濃縮除去三氯甲烷，得到的白色固體用5mL去離子水超聲分散后，再用超純水清洗3次，除 去未包裹的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3000, 1000 Or X 5min離心5min，沉淀真空干 燥得到白色粉末，即表面氨基化的水溶性稀土上轉換納米材料。
[0049] 所用的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3000中DsPE-PEG3(XX)-NH2摩爾百分比率 為10%，總二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3000濃度為20mM。
[0050] (2)特異性連接臂的制備
[0051]
[0052] 取化合物1 (2-氰基-6-羥基苯并噻唑）（350.4mg，2mmol)于反應瓶中，加入化合物 溴乙酸叔丁酯2 (390 · 3mg，3mmoI)，碳酸鉀（I · 39g，IOmmo I)及6mL的無水N，N-二甲基甲酰胺， 100°C下攪拌回流，TLC檢測反應，反應結束后，冷卻反應液，用水-二氯甲烷體系萃取2次，合 并有機層，無水碳酸鈉干燥后減壓濃縮，硅膠柱分離純化，最終得到淡黃色固體粉末(化合 物3)499.411^，產率86%。1!1匪1?(〇)(：13,40冊!^)57.95((1，1!1，了 = 8.9)，6.98((1(1，1!1，了 = 2.3,8.9),6.94(d,lH ,J = 2.3),4.9(br t, 1H) ,3.89(d,2H ,J = 5.1), 1,5(s,9H) .MS:calcd for C14H16N3O2S 290.1 ,found 290.3〇
[0053]
[0054] 稱取化合物3 50.4mg于反應瓶中，加入三氟乙酸5mL，冰浴下反應2h，反應結束后， 減壓濃縮反應液，硅膠柱分離純化，最終得到淡黃色固體粉末(化合物4一一羧基化的2-氰 基苯并噻唑）36.711^，產率91%。1!1匪1?(0)3〇0,40010^)57.87((1，1!1，了 = 9.8)，7.04-7.08 (m,2H),3.99(s,2H).MS:calcd for CioH8N3O2S 234.0,found 234.2〇
[0055] (3 )PEG化的稀土上轉化納米材料表面C00H-CBT修飾
[0056]稱取20.3mg的特異性連接臂（羧基化的2-氰基苯并噻唑，C00H-CBT)溶于2mL的N， N-二甲基甲酰胺，加入21 .Img二環己基碳酰亞胺(DCC)和11.8mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 反應時間為3h，過濾除去沉淀，保留濾液備用。稱取20.3mg的氨基化的水溶性稀土上轉換納 米材料分散于5mL的N，N-二甲基甲酰胺中，再將上述特異性連接臂活化酯溶液加入到納米 材料溶液中，然后加入33. Img N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，在室溫下攪拌3h，之后將體系離 心，收集底部沉淀，依次用N，N-二甲基甲酰胺(2次)和超純水(2次)清洗，除去未反應的特異 性連接臂，1000 Or X 5min離心，沉淀真空干燥得到白色粉末，即偶聯有連接臂的水溶性稀土 上轉換納米材料。
[0057] (4)RGD功能性多肽的半胱氨酸修飾
[0058] 稱取N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯Boc-NH2-Cy s (Trt)- OSu 26.8mg溶于200yL二甲基甲酰胺;稱取環狀五肽c (RGDfK) 19.3mg用300yL碳酸鹽緩沖體 系溶解，將Boc-NH2-Cys(Trt)-OSu二甲基甲酰胺加入到多肽水溶液中，以N，N-二異丙基乙 胺調節體系pH=8.2，室溫下反應30min，反應結束后用半制備HPLC純化目標產物，收集相應 餾分，最終得到白色凍干粉，隨后稱取產物25.3mg，加入裂解液ImU室溫下反應10min。反應 液傾入IOmL冰乙醚中，出現大量白色絮狀沉淀，離心收集白色沉淀用去500yL離子水復溶， 最終用半制備HPLC純化目標多肽，收集相應餾分，最終得到白色凍干粉(半胱氨酸修飾的 RGD功能多肽）。
[0059]如附圖1所示，脫掉半胱氨酸側鏈保護后的C(RGDfK)多肽分子離子峰[M+H] +為 707.3283，其理論值為 707.3294。
[0000] (5)稀土上轉換納米材料環狀五肽C(RGDfK)功能化修飾
[00611稱取20.2mg的偶聯有特異性連接臂的水溶性稀土上轉換納米材料，分散于5mL的 碳酸鹽緩沖體系，再稱取2. Img的末端半胱氨酸化的多肽(半胱氨酸修飾的RGD功能多肽)溶 于500yL的碳酸鹽緩沖體系，稱取1.6mg三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(TCEP.HC1)加入到多肽水 溶液中，隨后將多肽溶液加入到偶聯有特異性連接臂的水溶性稀土上轉換納米材料中，以 N，N-二異丙基乙胺調節體系酸堿度，使反應體系pH值為8.2,在室溫下攪拌反應lOmin，之后 將體系離心，收集底部沉淀，用超純水清洗3次，除去未反應的多肽，1000 Or X 5min離心，沉 淀真空干燥得到淡黃色固體粉末，即c (RGDf K)功能化的稀土上轉換納米材料。
[0062]所述裂解液成分為三氟乙酸(TFA)，三異丙基硅烷(TIS)和去離子水(H2O)的混合 溶液，其體積百分比為TFA/TIS/H20 (95%:2.5%:2.5%)。
[0063]本發明的RGD功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料具有非常強的靶向腫瘤能力。 通過下面試驗例及應用試驗進行詳細說明。
[0064]【試驗例一】
[0065]對功能性C(RGDfK)多肽對稀土上轉化納米材料修飾前后做透射電鏡(TEM)。圖2左 圖為特異性連接臂偶聯的水溶性稀土上轉化納米材料的透射電鏡（TEM)圖；右圖為c (RGDfK)功能化修飾后的稀土上轉化納米材料的透射電鏡(TEM)圖；從透射電鏡圖看出多肽 功能化修飾前后對其粒徑基本無影響。
[0066]【試驗例二】
[0067]以980nm激發光激發修飾前后的功能性C(RGDfK)多肽對稀土上轉化納米材料。圖3 虛線為特異性連接臂偶聯的水溶性稀土上轉化納米材料的熒光發射譜;實線圖為C(RGDfK) 功能化修飾后的稀土上轉化納米材料的熒光發射譜。從熒光發射譜看出多肽功能化修飾前 后對其熒光發射譜基本無影響。
[0068]【應用試驗】
[0069] 應用步驟：
[0070] (1)4T1荷瘤裸鼠動物模型的建立：
[0071] (2)c(RGDfK)功能化稀土上轉化納米材料4Τ1乳腺癌靶向近紅外熒光成像：
[0072] 1)4T1荷瘤裸鼠動物模型的建立:4T1小鼠的乳腺癌細胞在標準培養條件下培養。 收集細胞，離心，反復洗滌3次，最終將細胞重懸，得到5xl06/mL的4Τ1細胞懸液，吸取IOOyL 皮下注射入Athymic nude小鼠，形成種植瘤模型。當腫瘤總體積達IOOmm3時進行活體成像 實驗。
[0073] 2)4T1乳腺癌靶向近紅外熒光成像:實驗組所用材料為C(RGDfK)功能化稀土上轉 化納米材料將功能化上轉化納米粒;對照組實驗所用為未經修飾的上轉化納米粒。兩種納 米材料都稀釋到1.5mg/mL，尾靜脈注射進荷瘤模型小鼠（200μ!7小鼠），使用經980nm激發光 源改造過的Lumina 11小動物活體成像系統進行活體光學成像。激發光波長980nm，功率密 度為0.5W/cm2,發射光譜濾光片為790nm-810nm。注射后對不同組別的不同4T1荷瘤裸鼠進 行腫瘤區域光學成像。
[0074]圖4左圖為實驗組(注射C(RGDfK)功能化上轉化納米粒），右圖為對照組(注射未經 功能化上轉化納米粒）。通過圖4可以發現左圖腫瘤區域的信號明顯強于右圖相應位置的信 號，說明經過靶向多肽修飾后的稀土上轉化納米材料其靶向腫瘤能力有明顯提高。
【主權項】
1. R⑶功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料，其特征在于由以下修飾方法得到： 首先利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇通過配體交換方法將油酸修飾的納米粒 改性為表面氨基化的水溶性粒子； 隨后將羧基化的2-氰基苯并噻唑偶聯到表面氨基化的水溶性粒子表面，得到特異性連 接臂修飾的水溶性稀土上轉化納米粒； 接著在RGD功能多肽分子氨基端構建出半胱氨酸末端殘基，得到半胱氨酸修飾的RGD功 能多肽； 最后將半胱氨酸修飾的R⑶功能多肽特異性修飾到特異性連接臂修飾的水溶性稀土上 轉化納米粒表面，制成R⑶功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料。2. 根據權利要求1所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料，其特征在于，所述 修飾方法包括以下步驟： 1) 表面氨基化的水溶性稀土上轉化納米材料的制備： 取表面油酸包裹的稀土上轉化納米材料用三氯甲烷分散，加入二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇，超聲反應一定時間后減壓濃縮除去三氯甲烷，純化得到聚乙二醇修飾的表面 氨基化的水溶性稀土上轉化納米材料； 2) 水溶性稀土上轉換納米材料表面特異性連接臂修飾： 將羧基化的2-氰基苯并噻唑的羧基活化，制備成琥珀酰亞胺酯溶液，接著將氨基化的 水溶性稀土上轉化納米材料用三氯甲烷分散，將制備得到的琥珀酰亞胺酯溶液加入到納米 材料分散液中，加入一定量的堿，反應完成后，除去未反應的原料，并提純得到特異性連接 臂修飾的水溶性稀土上轉化納米材料； 3) 半胱氨酸修飾的RGD功能多肽： 在RGD功能多肽溶液中加入N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯，調 節體系pH值至8-8.5,使R⑶功能多肽的末端氨基與N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸 琥珀酰亞胺酯偶聯制備出含有受保護半胱氨酸殘基的多肽，接著將得到的保護性多肽在裂 解液的作用下，脫去半胱氨酸的保護基團，并用半制備HPLC純化，得到半胱氨酸修飾的RGD 功能多肽； 4) 稀土上轉化納米材料表面RGD功能化多肽修飾： 將步驟1)得到的水溶性稀土上轉化納米材料的碳酸鹽緩沖溶液，加入步驟3)得到的半 胱氨酸修飾的RGD功能多肽的碳酸鹽緩沖溶液中，同時加入防止巰基氧化的還原劑，反應一 段時間后，純化得到R⑶功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料。3. 根據權利要求2所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料，其特征在于:步驟 1) 所用的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合液中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的摩爾百 分比率為5%-20%，總二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇總濃度為10-40mM，超聲反應的 反應時間為10-40min。4. 根據權利要求2所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料，其特征在于:步驟 2) 所述羧基化的2-氰基苯并噻唑的結構式如下：式中，X為氧原子或者氮原子;m為0、1、2、3或者4。5. 根據權利要求4所述的RGD功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料，其特征在于:步驟 2) 中活化羧基所用的活化劑為二環己基碳酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，以摩爾比計，其反 應當量關系為羧基化的2-氰基苯并噻唑：二環己基碳酰亞胺:N-羥基琥珀酰亞胺=1: (1-1.5):(1-1.5)； 所述堿為N，N-二異丙基乙胺和/或者三乙胺； 加入堿后再反應時間3-5h。6. 根據權利要求2所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料，其特征在于:步驟 3) 所述半胱氨酸修飾的RGD功能多肽具有式(I)所示的結構：式(I)中，半胱氨酸為L構型或者D構型。7. 根據權利要求6所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料，其特征在于:步驟 3) 中N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲 基亞砜，隨后再將N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯溶液加入到含有 RGD功能多肽的碳酸鹽緩沖體系中，N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯 與R⑶功能多肽的摩爾比率范圍為(1.2-1.5): 1，偶聯反應的反應時間為0.5-lh; 所述裂解液為三氟乙酸、三異丙基硅烷和去離子水的混合溶液，三氟乙酸、三異丙基硅 燒和去離子水的體積百分比為95% : 1-5% : 1-5%，反應時間為5-10min。8. 根據權利要求2所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料，其特征在于:步驟 4) 中所述還原劑為三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽，三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽與半胱氨酸修飾的 R⑶功能多肽的摩爾比率范圍為(2-5): 1，反應時間為5-10min。9. 稀土上轉化納米材料R⑶功能多肽的修飾方法，其特征在于： 首先利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇通過配體交換方法將油酸修飾的納米粒 改性為表面氨基化的水溶性粒子； 隨后將羧基化的2-氰基苯并噻唑偶聯到表面氨基化的水溶性粒子表面，得到特異性連 接臂修飾的水溶性稀土上轉化納米粒； 接著在RGD功能多肽分子氨基端構建出半胱氨酸末端殘基，得到半胱氨酸修飾的RGD功 能多肽； 最后將半胱氨酸修飾的R⑶功能多肽特異性修飾到特異性連接臂修飾的水溶性稀土上 轉化納米粒表面，制成R⑶功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料。10.權利要求1所述RGD功能多肽修飾的稀土上轉化納米材料在制備腫瘤組織的祀向檢 測制劑中的應用。
【文檔編號】C09K11/06GK105860962SQ201610326562
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】袁雙虎, 劉治國, 黃勇, 楊國仁, 趙書強, 賈永峰, 于金明
【申請人】山東省腫瘤醫院