一種識別半胱氨酸和同型半胱氨酸新型熒光探針的合成與應用

一種識別半胱氨酸和同型半胱氨酸新型熒光探針的合成與應用
【專利摘要】本發明涉及一種用于檢測半胱氨酸和同型半胱氨酸的熒光探針的制備方法和應用，屬于化學分析檢測技術領域。其分子結構如下：該探針分子最大吸收波長在368nm，探針分子與半胱氨酸或同型半胱氨酸作用后，熒光光譜在585nm處強度由無到有并不斷增強，表現出較大斯托克斯位移(Stokes shifts)能夠提高檢測的靈敏度；發射波長在近紅外能夠減少探針檢測過程中的背景熒光和活細胞的光損傷。本發明所述的探針分子檢測靈敏度較高，對含巰基氨基酸識別能力強，響應速度較快，抗干擾能力強，該類探針在生物化學等領域具有重要的應用價值。
【專利說明】
一種識別半胱氨酸和同型半胱氨酸新型熒光探針的合成與 應用
技術領域
[0001] 本發明屬于化學分析檢測技術領域，具體涉及一種可以檢測半胱氨酸和同型半胱 氨酸的新型紅光-近紅外熒光探針的制備方法以及其在體外和活細胞內部檢測半胱氨酸和 同型半胱氨酸方面的應用。
【背景技術】
[0002] 生物疏基化合物，半胱氨酸(Cysteine，Cys)，同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy) 和谷胱甘肽(Glutatai 〇ne，GSH)等在生物的生理和病理過程中發揮著重要的調節作用。半 胱氨酸是參與生命體的蛋白質合成，解毒作用以及新陳代謝過程的必需氨基酸。研究表明， 半胱氨酸過高與神經毒性有密切關系，而半胱氨酸過低又與生長緩慢，嗜睡，肝損傷，皮膚 損害等相關聯。同型半胱氨酸與各種血管和腎臟疾病有關。同型半胱氨酸過高會增加獲心 血管疾病和阿爾采默病的風險。谷胱甘肽是人體內氧化還原作用和解毒作用是否正常運作 的指示劑，并與白細胞減少，癌癥，艾滋病病毒感染等有密切聯系。因此研究有效的生物硫 醇的檢測技術在化學，生物學，以及醫學領域都非常重要。由于熒光探針具有操作簡單，無 輻射，高靈敏度和高分辨率的優勢，使其成為檢測生物硫醇的理想選擇。目前，已經報道了 多種具有高靈敏度檢測生物硫醇的熒光探針。然而大部分這類探針是基于硫原子的強親核 性，因此它們對半胱氨酸以及同型半胱氨酸的檢測難以抵制其他硫醇的干擾。并且多數這 類探針還有短發射波長和小斯托克斯位移(Stokes shifts)的缺點。然而長得發射波長能 夠減少探針檢測過程中的背景熒光和活細胞的光損傷，大斯托克斯位移能夠提高檢測的靈 敏度。至今還沒有報道過一種具有大斯托克斯位移，用于檢測半胱氨酸和同型半胱氨酸，基 于丙烯酰脂的紅光-近紅外熒光探針。

【發明內容】

[0003] 本發明之一目的在于提供一種合成簡單、反應溫和、產率較高、成本較低的熒光探 針合成方法;本發明之另一目的是提供一種好選擇性、高靈敏度，強抗干擾能力，大斯托克 斯位移(Stokes shifts)，發射波長在近紅外，能夠對體外或者活細胞內部的半胱氨酸和同 型半胱氨酸進行監測或者細胞熒光成像的熒光探針。
[0004] 本發明解決問題采取的技術方案為，一種熒光開關(off-on)法識別半胱氨酸和同 型半胱氨酸的新型熒光探針，其分子結構式如下：
合成路線如下： >具體合成方法如下：（a)在 50ml圓底燒瓶中，將3-硝基鄰苯二甲臆(2 ? Og，11 ? 6mmol)，K2C〇3( 1 ? 8g，12 ? 7mmol)和NaN〇2 (0.8g，11.6mmol)溶于二甲基亞砜中（30mL)，130°C油浴攪拌回流30min，反應完成。冷卻至 室溫，加入90ml蒸餾水稀釋反應液，用2M鹽酸酸化至PH = 3，產生沉淀，抽濾，用蒸餾水和甲 醇洗滌濾餅，真空干燥，冰醋酸重結晶進一步純化得到棕色晶體。即得中間產物3-羥基鄰苯 二甲腈。產量:〇 ? 9g。收率54%。（b)在25ml圓底燒瓶中，將上步所得產物（288mg，2mmo 1)，2-氨基吡啶（385mg，4 ? lmmol)和CaCl2(46mg，0 ? 41mmol)溶于正丁醇(6mL)中。氬氣保護，110°C 油浴加熱回流5天，反應完全，冷卻至室溫，真空旋蒸除去正丁醇，水洗，常壓過濾，濾餅真空 干燥，經柱層析純化得到產物，真空干燥過夜，得到橘黃色粉末。即得中間產物羥基染料4。 產量：141.6mg。收率25Kc)將上步所得產物（79.25mg，0.25mmol)溶于10mL無水二氯甲烷 中，再加入三乙胺（0.07mL，0.5mmol)，冰浴下逐滴加入溶于4ml無水二氯甲燒的丙稀酰氯 (58.16mg，0.31mmol)，氬氣保護，室溫攪拌下反應10分鐘，反應完全，冰浴下旋蒸除去二氯 甲烷，快速柱層析分離得到黃色粉末。即得探針分子。產量:75.31mg。收率:81.2%。
[0005] 本發明的熒光探針的作用機理如下，由于丙烯酸酯部分的光誘導電子轉移(PET)， 探針分子沒有熒光。半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hey)和谷胱甘肽(GSH)能夠與探針分子 中丙烯酸酯的雙鍵發生親核加成反應得到硫醚衍生物，半胱氨酸（Cys)和同型半胱氨酸 (Hey)反應后得到的硫醚衍生物能夠通過分子內合環脫去硫醚部分恢復羥基染料4,探針分 子由無熒光變成很強的紅色熒光，谷胱甘肽(GSH)反應后得到的硫醚衍生物因為中間產物 的動力學禁阻而無法發生分子內合環反應。從而實現特異性檢測半胱氨酸(Cys)和同型半 胱氨酸(Hey)的目的。探針分子的響應過程如下：
高效液相色譜驗證了此響應機理，探針分子和對應的羥基染料4液相色譜圖中各自在 15分鐘和24.57分鐘出現單峰。當用0.5倍當量半胱氨酸(Cys)處理探針分子后，15分鐘的探 針分子峰減弱的同時，24.57分鐘出現染料4的單峰。用5倍當量半胱氨酸(Cys)處理探針分 子后，15分鐘的探針分子峰完全消失，只留下24.57分鐘的染料分子峰。
[0006] 本發明的熒光探針在近紅外發射，其與半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hey)作用 前無熒光，作用后熒光發射峰在585nm處。
[0007]本發明的焚光探針具有大斯托克斯位移（Stokes shifts)，最大吸收在368nm，與 半胱氨酸（Cys)和同型半胱氨酸（Hey)作用后最大發射在585nm，斯托克斯位移（Stokes shifts)為217nm〇
[0008]本發明的熒光探針選擇性好。探針分子的測試體系為含有l.OmM的十六烷基三甲 基溴化銨(CTAB)，PH為7.4的lOmM的roS緩沖溶液，室溫下測量。探針分子本身沒有熒光，在 加入5倍當量半胱氨酸(Cys)之后，在最大發射波長585nm處熒光強度增大了 86倍，加入5倍 當量半胱氨酸(Hey)之后，熒光強度增大了 84倍。而在加入同樣當量的GSH和其他生理氨基 H(Asp,Ala,Val ,Phe,His,Leu,Ser, lie,Trp,Lys,Arg,Pro ,Gly ,Met ,Tyr ,Glu,andThr) jfj, 熒光只有幾乎可以忽略的增加。
[0009] 本發明的熒光探針抗干擾能力強，其他生理氨基酸(Asp，Ala，Val，Phe，HiS，Leu， Ser，IIe，Trp，Lys，Arg，Pro，Gly，Met，Tyr，Glu，and Thr)的存在不影響探針分子與半胱氨 酸(Cys)的作用。
[0010] 本發明的熒光探針靈敏度高，探針分子的熒光強度隨著半胱氨酸(Cys)濃度的增 加逐漸增加，直到達到最大值。半胱氨酸(Cys)濃度在低濃度(0_7uM)與探針分子的熒光強 度成很好的線性關系。檢測限為5.6nM。可見本發明的探針分子可以用于在水相中檢測半胱 氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hey)。
[0011] 本發明的熒光探針對半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hey)響應速度快，探針分子 中加入5倍當量的半胱氨酸(Cys)后，熒光快速增強，在10分鐘達到最大值，加入5倍當量的 同型半胱氨酸(Hey)后，在15分鐘達到最大值。且30秒內即可觀察到熒光的明顯變化。
[0012] 本發明的熒光探針表現出較寬的應用范圍，探針分子在PH為7至10的范圍內都可 以對半胱氨酸選擇性識別。
[0013] 本發明所述的探針分子合成路線簡單，產率較高，成本較低，對對半胱氨酸(Cys) 和同型半胱氨酸(Hey)的發射波長在近紅外，斯托克位移大，選擇性好、抗干擾能力強，靈敏 度高，響應速度快，具有較寬的應用范圍，該熒光探針在生物化學，環境科學等領域具有實 際的應用價值。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明熒光探針的選擇性，熒光探針（5.0Xl(T6m〇l/L)在PBS緩沖溶液 (1 OmM，pH = 7.4，1. OMm CTAB)中，與不同種類氨基酸作用后的熒光光譜，橫坐標為波長，縱 坐標為熒光強度。
[0015] 圖2為本發明熒光探針的抗干擾能力，半胱氨酸(Cys)與其他氨基酸共存時，與熒 光探針(5.0 X 10-6m〇 1 /L)在PBS緩沖溶液（1 OmM，pH=7.4，1. OMm CTAB)中與半胱氨酸作用后 的熒光強度比值(1/1〇)柱狀圖。
[0016] 圖3為本發明的熒光探針(5.0Xl(T5m〇l/L)在不同條件下的高效液相色譜(a)熒光 探針的液相色譜。(b)熒光探針(5.0X l(T5m〇l/L)與0.5eqUiv.半胱氨酸作用后的液相色譜。 (c)熒光探針(5.0Xl(T 5m〇l/L)與5equiv.半胱氨酸作用后的液相色譜。（d)熒光探針與半胱 氨酸作用后生成的羥基染料4(5.0 X 1 (T5m〇 1/L)液相色譜。橫坐標為時間，縱坐標為響應值。 [0017]圖 4 為本發明的熒光探針(5.0\10-6111〇1/1)在?83緩沖溶液（101111411=7.4，1.01111 CTAB)中，與不同濃度半胱氨酸(Cys)作用后的熒光光譜變化，橫坐標為波長，縱坐標為熒光 強度。
[0018]圖 5 為本發明的熒光探針(5.0\10-6111〇1/1)在?83緩沖溶液（101111411=7.4，1.01111 CTAB)中，與半胱氨酸(Cys)濃度的線性關系，橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度。
[0019]圖 6 為本發明的熒光探針(5.0\10-6111〇1/1)在?83緩沖溶液（101111411=7.4，1.01111 CTAB)中，與不同濃度同型半胱氨酸(Hey)作用后的熒光光譜變化，橫坐標為波長，縱坐標為 熒光強度。
[0020] 圖 7 為本發明的熒光探針(5.0\10-6111〇1/1)在?83緩沖溶液（101111411=7.4，1.01111 CTAB)中，與同型半胱氨酸(Hey)濃度的線性關系，橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度。
[0021] 圖 8 為本發明的熒光探針(5.0\10-6111〇1/1)在?83緩沖溶液（101111411=7.4，1.01111 CTAB)中，與半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hey)和谷胱甘肽(GSH)作用過程中熒光強度隨 時間的變化，橫坐標為時間，縱坐標為熒光強度。
[0022] 圖9為本發明的熒光探針（5.0 X 1 (T6mo 1/L)在不同pH值緩沖溶液中，與半胱氨酸 (Cys)作用前后的熒光強度，橫坐標為pH，縱坐標為熒光強度。
[0023]具體實施實例 實施例1:中間產物3-羥基鄰苯二甲腈的合成 在50ml 圓底燒瓶中，將3-硝基鄰苯二甲腈(2.0g，11.6mmo 1)，K2C03 (1.8g，12.7mmo 1)和 NaN02(0.8g，11.6mmol)溶于二甲基亞砜中（30mL)，130° C油浴攪拌回流30分鐘，反應完成。 冷卻至室溫，加入90ml蒸餾水稀釋反應液，用2M鹽酸酸化至PH = 3，產生沉淀，抽濾，用蒸餾 水和甲醇洗滌濾餅，真空干燥，冰醋酸重結晶進一步純化得到棕色晶體。產量:〇.9g。收率 54% 〇 實施例2:中間產物染料4的合成 在25ml圓底燒瓶中，將上步所得產物3-羥基鄰苯二甲腈(288mg，2mmol)，2_氨基吡啶 (38511^，4.1_31)和〇3(]12(4611^，0.41_31)溶于正丁醇中（6111]^)。氬氣保護，110°(^油浴加熱 回流5天，反應完全，冷卻至室溫，真空旋蒸除去正丁醇，水洗，常壓過濾，濾餅真空干燥，經 柱層析純化得到產物，真空干燥過夜，得到橘黃色粉末。產量:141.6mg。收率25%。結構表征 如下 JH NMR(400MHz，CDC13)Sh 13.70(s，lH)，8.62(m，2H)，7.78(t，J = 7.9Hz，2H)，7.60(s， 1H)，7.52(d，J = 7.3Hz，2H)，7.38((1，了 = 8.01^，111)，7.19-7.09(111，31〇。13(：匪R(101MHz， CDC1 3)Sc 160.10,159.34,155.81，155.59,153.70,147.98,147.76,138.12,138.08， 135.66,133.58,123.43,122.31，120.50,120.27,118.98,118.29,114.52。 實施例3:探針分子的合成 將上步所得產物（79.2511^，0.25111111〇1)溶于1〇11^無水二氯甲烷中，再加入三乙胺 (0.07mL，0 ? 5mmol)，冰浴下加入溶于4ml無水二氯甲燒的丙稀酰氯(58 ? 16mg，0.31mmol)，氬 氣保護，室溫攪拌下反應10分鐘，反應完全，冰浴下旋蒸除去二氯甲烷，快速柱層析分離得 到黃色粉末。產量:75.31mg。收率：81.2%。探針分子的表征如下^HMIRGOOMHzJMSOWh 14.02(s，lH)，8.74(d，J = 4.6Hz，2H)，8.02-7.95(m，2H)，7.91(dd，J=14.1，7.2Hz，1H)， 7.82(t，J = 7.7Hz，lH)，7.56(d，J = 7.9Hz，lH)，7.48(d，J = 7.8Hz，lH)，7.29(dd，J=12.1， 6.9Hz，2H)，7.19(d，J = 7.8Hz，lH)，6.63(d，J = 8.0Hz，2H)，6.29(dd，J = 7.8,3.0Hz，lH)。 實施例4:本發明：熒光探針的應用 將探針分子溶于PBS緩沖溶液（10mM，pH = 7 ? 4,1 ? OMm CTAB)中配制成5 ? 0 X 10-6mol/L 的溶液，向溶液中加入各種氨基酸(厶8卩，厶1&，'\^1，卩116，1118，1^11，561'，116，1'印，1^8，厶作， Pro，Gly，Met，Tyr，Glu，Thr and GSH)后沒有引起熒光的明顯變化，而加人氨基酸（Cys， Hey)引起了熒光顯著變化，該熒光探針對半胱氨酸和同型半胱氨酸表現出高靈敏度、高選 擇性的識別。當半胱氨酸與干擾物質(48口，413，'\%1，？116，1118，1^11，561'，116，1'印，1^8，厶坪， Pro，Gly，Met，Tyr，Glu，Thr and GSH)共存時，探針不受干擾因素的影響，表現出來很強的 抗干擾能力。該探針分子與半胱氨酸響應速度快，30秒內即可觀察到熒光的變化。探針分子 在pH為7至10的范圍內都可以對半胱氨酸選擇性識別，表現出了良好的生物適應能力。
【主權項】
1. 一種識別半胱氨酸和同型半胱氨酸熒光探針的合成與應用，其結構為：2. 根據權利要求1所述的識別半胱氨酸和同型半胱氨酸的新型熒光探針的用途，其特 征在于該熒光探針用于環境或生物樣品中的半胱氨酸的熒光檢測和分析。
【文檔編號】C09K11/06GK105820810SQ201610267757
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】宋相志, 田惠惠, 楊大雷, 劉興江, 齊風佩, 楊雷, 譚倩
【申請人】中南大學