一種檢測汞離子的新型羅丹明熒光探針及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種檢測隸離子的羅丹明巧光探針及其制備方法，屬于巧光探針及其 制備方法技術領域。
【背景技術】
[0002] 隸離子是一種典型的重金屬離子，具有極強的毒性。隸離子一旦進入水環境，就會 被細菌類微生物轉化為有機的甲基隸，并在生物體內（如魚類)快速積累從而進入食物鏈。 甲基隸破壞人的神經系統，引起大腦受損、認知和運動素亂等，震驚世界的水侯病就是有機 隸中毒的一種類型。因此，尋找能夠快速、準確檢測隸離子的方法具有重要意義。
[0003] 羅丹明類巧光染料具有光穩定性好、長波長紅光發射、量子產率高、水溶性好和適 用的抑范圍較寬等優異的光物理和光化學性能，已成為構建巧光探針最理想的報告基團之 一。一些羅丹明類巧光探針及其在隸離子檢測方面的應用已被報道，如CN 104530064A和CN 104479671A，但如本發明所示的羅丹明巧光探針結構未見公開。本發明提供的羅丹明巧光 探針合成步驟簡單、易于提純、收率高，對隸離子的選擇性好，可在生理環境條件下工作，具 有應用于生物巧光成像的前景。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種羅丹明B衍生物及其制備方法和在隸離子檢測方面的應 用。
[0005] 本發明是通過W下技術方案實現的：
[0006] -種羅丹明B衍生物R，其結構如下所示：
[0007]
[000引
[0009] 本發明合成羅丹明B衍生物R的流程式
[0010] 羅丹明B衍生物R的制備方法，按照W下步驟進行：
[0011] 將羅丹明B酷阱和苯基乙二醒溶解在溶劑中，羅丹明B酷阱與苯基乙二醒的摩爾比 為1:1.2,加熱回流至反應完全，冷卻析出固體，過濾即得到席夫堿。將席夫堿溶于四氨巧喃 中，緩慢加入棚氨化鋼，席夫堿與棚氨化鋼的摩爾比為1:2,減壓除去溶劑，重結晶得羅丹明 B衍生物R。
[0012] 具體制備步驟包括：
[OOU] (1)羅丹明B酷阱的制備
[0014] 將羅丹明B和水合阱溶解在溶劑中，加熱回流至反應完全，冷卻加水析出固體，過 濾得淺粉色粗產品，干燥、重結晶得羅丹明B酷阱。
[0015] 所述的溶劑為甲醇或乙醇，重結晶所用的溶劑為石油酸和乙酸乙醋。
[0016] (2)席夫堿的制備
[0017] 將羅丹明B酷阱和苯基乙二醒溶解在溶劑中，羅丹明B酷阱與苯基乙二醒的摩爾比 為1:1.2,加熱回流至反應完全，冷卻析出固體，過濾即得到席夫堿。
[001引所述的溶劑為甲醇或乙醇。
[0019 ] (3)羅丹明B衍生物R的制備
[0020] 將席夫堿溶解于四氨巧喃中，緩慢加入棚氨化鋼，室溫攬拌化，反應完全后除去溶 劑，重結晶得到羅丹明B衍生物R。
[0021] 所述的席夫堿與棚氨化鋼摩爾比為1:2,重結晶所用的溶劑為石油酸和乙酸乙醋。
[0022] 羅丹明B衍生物R的應用:所述的羅丹明B衍生物R可作為巧光探針。所述的羅丹明B 衍生物R可作為巧光探針實現隸離子的檢測。所述的羅丹明B衍生物R可作為巧光探針用于 活細胞內隸離子的檢測。
[0023] 本發明所具有的優點：本發明提供的羅丹明B衍生物R，合成步驟簡單，反應時間 短，易于提純，收率高。該化合物是隸離子的巧光增強型探針，對隸離子具有高度專一性，可 在生理環境條件下工作，具有應用于生物巧光成像的前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發明實施例合成羅丹明B衍生物R的流程圖。
[0025] 圖2為本發明實施例合成的席夫堿的核磁共振氨譜。
[0026] 圖3為本發明實施例合成的席夫堿的質譜圖。
[0027] 圖4為本發明實施例合成的羅丹明B衍生物R的核磁共振氨譜。
[0028] 圖5為本發明實施例合成的羅丹明B衍生物R的質譜圖。
[0029] 圖6為本發明實施例合成的羅丹明B衍生物R的單晶結構圖。
[0030] 圖7為本發明實施例合成的羅丹明B衍生物R作為巧光探針的最佳醇/水比的測試。
[0031] 圖8為本發明實施例合成的羅丹明B衍生物R作為巧光探針的pH適用范圍的測試。
[0032] 圖9為本發明實施例合成的羅丹明B衍生物R作為巧光探針對隸離子選擇性的測 試。
[0033] 圖10為本發明實施例合成的羅丹明B衍生物R作為巧光探針對隸離子的巧光滴定 的測試。
[0034] 圖11為本發明實施例合成的羅丹明B衍生物R作為巧光探針對隸離子絡合的工作 曲線圖。
[0035] 圖12為本發明實施例合成的羅丹明B衍生物R作為巧光探針對隸離子在細胞體內 進行的巧光成像實驗。（a)加入巧光探針R細胞解育20min后在巧光顯微鏡下的成像圖，（b) 加入隸離子后解育20min細胞在巧光顯微鏡下的成像圖，（b)圖中的白色部分在彩圖中為紅 色巧光的細胞。
【具體實施方式】
[0036] 下面結合實施例和附圖對本發明做進一步的詳細說明。
[0037] 實施例1
[0038] 巧光探針分子羅丹明B衍生物R的制備，具體路線圖見下式。
[0039]
[0040] 本發明合成羅丹明B衍生物R的流程式
[0041] (1)羅丹明B酷阱的制備
[0042] 在50mL圓底燒瓶中加入羅丹明B (4.79g，0.0 Imo 1，5mL 80 %水合阱，30mL乙醇，混 合溶液攬拌回流4-化，冷卻后加水析出固體，過濾得到粗產品，干燥后用乙酸乙醋/石油酸 重結晶得到淺粉色粉末固體，即羅丹明B酷阱，收率92%。
[0043] (2)席夫堿的制備
[0044] 在25mL圓底燒瓶中加入羅丹明B酷阱（2.28g，0.005mol)，一水合苯基乙二醒 (1. 〇2g，0.006mo 1)，無水甲醇30mL，攬拌回流化后，過濾、干燥得席夫堿，收率95 %。其核磁 共振氨譜(1h NMR)圖和質譜化SI-MS)圖分別見圖巧日圖3。4 NMR(400MHz，CDCl3)S:8.40(s, lH)，7.89-8.04(m，3H)，7.17-7.59(m，5H)，6.28-6.54(m，6H)，3.35(q，J = 6.細z，細），1.18 (t，J = 6.細Z，12H).ESI-MS(質荷比）：[C36出6N4O3+H+]:理論值為573.28，實測值為573.58.
[0045] (3)羅丹明B衍生物R的制備
[0046] 在25mL圓底燒瓶中加入席夫堿(0.57g，0.0 Olmol)，lOmL四氨巧喃，分批緩慢加入 棚氨化鋼(0.08旨，0.002111〇1)，常溫攬拌化，旋干溶劑，水洗，萃取，用乙酸乙醋石油酸重結晶 得羅丹明B衍生物R，收率82 %。其iH NM時普圖、質譜圖和單晶結構圖分別見圖4、圖5和圖6。iH NMR(400MHz，CDCl3)δ:7.98(d，J = 6.細zlH)，7.53-7.56(m，2H)，7.11-7.21(m，6H)，6.29- 6.66(m，6H)，5.46(s，lH)，4.51-4.69(m，2H)，3.36(q，J=7.2Hz，8H)，2.47-2.49(m，2H), 1.18(t，J = 7.2Hz，12H).ESI-MS(質荷比）：[C3油4()N403+r]:理論值為577.31，實測值為 577.63.
[0047] 實施例2
[004引羅丹明B衍生物R的不同醇/水比的巧光光譜變化
[0049]取實施例1制備的羅丹明B衍生物R溶于乙醇中，制成100μΜ儲備液。分別配制不同 比例的乙醇和水比例的1 ΟμΜ巧光探針溶液，依次加入0.5當量的隸離子，溶液的巧光強度變 化如圖7所示。從圖7可W看出，溶液的巧光強度隨醇/水比的增大而逐漸增強，但當醇/水比 大于6:4的時，溶液巧光強度的增強趨于平緩。因此，醇/水比6:4為最佳測試條件。
[00加]實施例3
[0051 ]羅丹明Β衍生物R在不同抑的巧光光譜變化
[0052]取實施例2配制的儲備液分別配制不同pH的ΙΟμΜ巧光探針溶液，溶液的巧光強度 變化如圖8所示。從圖8可W看出，在ρΗ<6的范圍內，隨著酸性的增加，巧光強度明顯增強； 在pH 6-9范圍內，巧光強度基本處于恒定，說明該探針可適用于生物環境條件下的測試。 [0化3] 實施例4
[0054] 羅丹明B衍生物R巧光探針對隸離子的選擇性
[0055] 金屬離子溶液的配制:所有的金屬離子溶液都由它們的硝酸鹽配制，避光保存備 用。
[0056] 取實施例2配制的儲備液配制成ΙΟμΜ的巧光探針緩沖溶液(pH = 7，10mM4-^乙基 贓嗦乙橫酸的水溶液化E陽S))，分別加入等量的金屬離子化g2+，Fe3+，Co2+，Mg 2+，ai2+，Al3+, Ni2+，Cr3+，Mn2+，Ca2+，Li+，Cd 2+，Cu2+);立即W520nm為激發光檢測溶液的發射光譜變化，結果 見圖9。從圖9可W看出，其它金屬離子對化合物R的巧光幾乎沒有影響，而隸離子溶液的加 入使化合物R的巧光顯著增強。
[0化7] 實施例5
[0058] 巧光探針R對不同濃度隸離子的巧光光譜變化
[0059] 取實施例2配制的儲備液配制成ΙΟμΜ的巧光探針緩沖溶液(pH = 7，10mM皿PES)， 加入不同當量(0-5.5eq)的Hgh標準溶液，W520nm為激發光測量其巧光性質，巧光光譜圖見 圖10。從圖10可W看出，探針在582nm處巧光強度最大；巧光探針R溶液的巧光峰值隨著Hgh 加入當量的增加巧光逐漸增強，到達最大強度時，巧光強度增加了約100倍。圖11的工作曲 線顯示拐點在0.5，表明巧光探針R和隸離子為1:1的配比關系。
[0060] 實施例6
[0061 ]巧光探針R對細胞內隸離子的巧光成像
[0062]我們將本發明的巧光探針R應用于人體胃癌細胞(MGC-803)中的隸離子進行巧光 成像應用。具體結果見圖12。具體操作步驟如下：將20μΜ探針溶液加入到育有MGC-803細胞 的培養液中在二氧化碳培養箱中培養20min后用巧光顯微鏡進行成像。首先用綠光進行激 發觀察未加入隸離子的巧光成像情況，此時觀察不到巧光發射。然后，向體系中加入20μΜ隸 離子的水溶液，培養20min后用綠光進行激發可W觀察到明顯的紅光發射，圖12(b)圖中的 白色部分在彩圖中為紅色巧光的細胞，說明此巧光探針可W對活細胞內的隸離子進行巧光 成像。
【主權項】
1. 一種檢測汞離子的羅丹明B衍生物R的結構式如下所示：2. 根據權利要求1所述的羅丹明B衍生物R的制備方法，其特征在于制備流程如下:將羅 丹明B酰肼和苯基乙二醛(羅丹明B酰肼與苯基乙二醛的摩爾比1:1.2)溶解在在甲醇或乙醇 中，加熱回流至反應完全，冷卻析出固體，過濾即得到席夫堿;將席夫堿溶于四氫呋喃中，緩 慢加入硼氫化鈉(席夫堿與硼氫化鈉的摩爾比1:2)，除去溶劑，重結晶得羅丹明B衍生物R。3. 根據權利要求1所述的羅丹明B衍生物R的應用，其特征在于:羅丹明B衍生物R可以作 為熒光探針。4. 根據權利要求3所述的羅丹明B衍生物R作為熒光探針，其特征在于:羅丹明B衍生物R 可以作為熒光探針實現汞離子的檢測。5. 根據權利要求4所述的羅丹明B衍生物R作為汞離子熒光探針，其特征在于：羅丹明B 衍生物R可以實現活細胞內汞離子的檢測。
【專利摘要】本發明涉及一種檢測汞離子的新型羅丹明熒光探針及其制備方法，屬于熒光探針及其制備方法技術領域。本發明公開了羅丹明熒光探針的結構。本發明還公開了羅丹明熒光探針的制備方法，將羅丹明B與水合肼在乙醇中回流反應生成羅丹明酰肼；然后與苯基乙二醛在乙醇中回流反應，經重結晶得到席夫堿；再經硼氫化鈉還原生成熒光探針。本發明提供的熒光探針合成步驟簡單、收率高，對汞離子的選擇性好、響應時間快，可在生理環境條件下工作，具有應用于生物熒光成像的前景。
【IPC分類】C07D491/107, C09K11/06, G01N21/64
【公開號】CN105670609
【申請號】CN201610112770
【發明人】吳向陽, 肖慧豐, 張海燕, 劉杰, 張敏, 仰榴青
【申請人】江蘇大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年2月29日