一種自拋光型酶基防污涂料的制備方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于海洋生物污損防護技術領域，設及一種自拋光型酶基防污涂料的制備 方法，取哲基硅油改性丙締酸樹脂為成膜物，采用碳納米管吸附固定的從海水中純化培養 的多糖水解酶和從典型污損生物石灰蟲外殼純化培養的兩種蛋白酶作為防污物質的防污 組合物。
【背景技術】：
[0002] 海洋污損對船舶和海洋人工設施造成嚴重的危害，影響其航行速度、燃油經濟性 和安全性，增加保養和維修成本，因此必須采用有效措施防止海洋生物對其造成的污損附 著。傳統的有機錫防污涂料因嚴重危害海洋生態環境，已被禁止使用；目前廣泛使用的含氧 化亞銅、硫氯酸亞銅類防污涂料由于會導致海洋銅元素累積，造成嚴重的海洋生態環境問 題，在一些國家如加拿大和瑞典已被限制使用并面臨禁用的趨勢。因此，開發環境友好型海 洋防污涂料具有重要意義。
[0003] 目前，微生物源防污酶作為天然防污活性物質，可通過降解固著生物的黏附劑、 瓦解生物膜基質、阻斷群體反應信號傳遞、甚至酶催化產生殺聲劑而表現出高效的生物活 性。酶基防污涂料已成為防污領域研究與應用熱點。Pettitt等人研究了包括脂肪酶、纖 維素酶、葡萄糖、淀粉酶、混合酶等24種酶的防污效果，其中絲氨酸蛋白酶在防止綠藻抱子 和藤壺幼蟲附著方面具有最佳效果。公開號為CN102137900A的專利公開了一種氣凝膠中 包埋生物活性劑和酶的防污組合物；公開號為CN102083919B的專利公開了一種包含第一 酶和包封的第二酶的防污組合物，采用0-半乳糖巧酶、膚酶、葡糖淀粉酶及其混合物作 為第一酶，選包封于娃酸鹽中自氧化酶為第二酶；公開號為CN10230795她的專利公開了 基于酶的自拋光涂料組合物，其包括W粘合劑系統形式的粘合劑相和色素相，所述色素相 包括多糖和能輔助所述多糖水解的酶，酶可為葡萄糖淀粉酶，且多糖可為淀粉；公開號為 CN103819983A的專利公開了一種由高分子樹脂、辣椒素、蛇床子素、高凹頂藻醇等防污計和 蛋白酶組成的防污涂料；公開號為CN101284956B的專利公開了一種從藤壺、貽貝中分離純 化獲得蛋白酶產生菌及其蛋白酶基防污涂料的制備方法；另外丹麥的Biolocus公司已開 發出多種應用與海洋防污的酶制劑并與J0TUN公司合作生產了酶涂料，該種涂料已在快艇 上推廣應用；GE肥CORE公司和肥MP化公司合作開發了基于己糖酶和過氧化氨酶聯合生產 過氧化氨進行防污的防污涂料，但該些現有技術普遍存在各種技術和應用方面的缺陷。
【發明內容】
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[0004] 本發明的目的在于克服現有技術存在的缺陷，尋求設計一種自拋光型酶基防污涂 料的制備方法，該酶基防污涂料不含有重金屬污染物，對環境友好且防污效果良好。
[0005] 為了實現上述目的，本發明方法包括多糖水解酶與蛋白酶產生菌的分離純化培 養、防污活性酶制劑制備和酶基防污涂料制備=個步驟：
[0006] (1)、多糖水解酶與蛋白酶產生菌的分離純化培養包括兩個方面
[0007] ①、多糖水解酶產生菌的分離純化與培養，在200ml2216E液體培養基中加入50ml 天然海水，于30°C下富集培養4她，然后將菌液在瓊脂培養基上進行劃線分離并于25°C下 培養72h，用接種針挑取顯著水解瓊脂的菌落在培養基上進行進一步分離純化，直到細胞 菌落形態穩定一致，得到多糖水解酶產生菌；采用2216E液體培養基，控制培養基的鹽度為 3-4%、抑值為7. 0-9. 0,在25-35°C下培養7-15天，獲得含有多糖水解酶的培養液；
[000引②、石灰蟲源蛋白酶產生菌的分離純化與培養，將從潮間帶取得的石灰蟲外殼在 無菌條件下礙碎，放入250ml2216E液體培養基中于30°C下富集培養4她，然后將菌液在 酪蛋白瓊脂培養基上進行劃線分離并于25°C下培養72h，用接種針挑取顯著水解酪蛋白 (水解圈）的菌落在培養基上進行進一步分離純化，直到細胞菌落形態穩定一致，得到2 株蛋白酶產生菌即甜C-1和甜C-2 ;SCH-1采用2216E液體培養基，控制培養基的鹽度為 0. 5-1. 5%、抑值為7. 0-8. 0,在30-40°C下培養7-10天，獲得含有蛋白酶的培養液；SCH-2 采用22166液體培養基，控制培養基的鹽度為0.5-1.5%、抑值為7.0-8.5，在25-351：下培 養7-10天，獲得含有蛋白酶的培養液；
[0009] (2)、防污活性酶制劑制備
[0010] 將源于海水菌株的多糖水解酶和源于石灰蟲外殼菌株的兩種蛋白酶均采用相同 的分離純化工藝，將含有多糖水解酶的培養液和含有蛋白酶的培養液分別在冷凍離屯、機中 于3500rpm/min條件下離屯、40min，取上清液并用硫酸錠飽和溶液鹽析，鹽析液靜置4她后 于8000rpm/min轉速下離屯、40min，將離屯、獲得的沉淀物通過水相層析純化，并吸附于碳納 米管中，減壓冷凍干燥后分別制得相應的防污活性酶制劑；
[0011] (3)、酶基防污涂料制備
[0012] 選用已公開專利化200810014220. 4 -種哲基硅油改性丙締酸樹脂作為自拋光型 成膜物，其結構式為：
[001 引
【主權項】
1. 一種自拋光型酶基防污涂料的制備方法，其特征在于制備方法包括多糖水解酶與蛋 白酶產生菌的分離純化培養、防污活性酶制劑制備和酶基防污涂料制備三個步驟： (1) 、多糖水解酶與蛋白酶產生菌的分離純化培養包括兩個方面 ① 、多糖水解酶產生菌的分離純化與培養，在200ml2216E液體培養基中加入50ml天然 海水，于30°C下富集培養48h，然后將菌液在瓊脂培養基上進行劃線分離并于25°C下培養 72h，用接種針挑取顯著水解瓊脂的菌落在培養基上進行進一步分離純化，直到細胞菌落形 態穩定一致，得到多糖水解酶產生菌；采用2216E液體培養基，控制培養基的鹽度為3-4%、 pH值為7. 0-9. 0,在25-35°C下培養7-15天，獲得含有多糖水解酶的培養液； ② 、石灰蟲源蛋白酶產生菌的分離純化與培養，將從潮間帶取得的石灰蟲外殼在無菌 條件下碾碎，放入250ml2216E液體培養基中于30°C下富集培養48h，然后將菌液在酪蛋白 瓊脂培養基上進行劃線分離并于25°C下培養72h，用接種針挑取顯著水解酪蛋白（水解圈） 的菌落在培養基上進行進一步分離純化，直到細胞菌落形態穩定一致，得到2株蛋白酶產 生菌即SHC-1和SHC-2 ;SCH-1采用2216E液體培養基，控制培養基的鹽度為0. 5-1. 5%、pH 值為7. 0-8. 0,在30-40°C下培養7-10天，獲得含有蛋白酶的培養液；SCH-2采用2216E液 體培養基，控制培養基的鹽度為〇. 5-1. 5%、pH值為7. 0-8. 5,在25-35°C下培養7-10天，獲 得含有蛋白酶的培養液； (2) 、防污活性酶制劑制備 將源于海水菌株的多糖水解酶和源于石灰蟲外殼菌株的兩種蛋白酶均采用相同的分 離純化工藝，將含有多糖水解酶的培養液和含有蛋白酶的培養液分別在冷凍離心機中于 3500rpm/min條件下離心40min，取上清液并用硫酸按飽和溶液鹽析，鹽析液靜置48h后于 8000rpm/min轉速下離心40min，將離心獲得的沉淀物通過水相層析純化，并吸附于碳納米 管中，減壓冷凍干燥后分別制得相應的防污活性酶制劑； (3) 、酶基防污涂料制備 選用已公開專利ZL200810014220. 4 -種羥基硅油改性丙烯酸樹脂作為自拋光型成膜 物，其結構式為：
式中X1、X2為H或CH3 ;R為C1-C7的烷基鏈；m為2-12的自然數，n為1-3的自然數;A為0元素或NH2基團；R1、R2均為C1-C7的烷基鏈；所述的自拋光型酶基防污涂料由各原料 按重量百分比選取羥基硅油改性丙烯酸樹脂55-70%，松香3. 5-8%，有機膨潤土 1-3%，碳 納米管固定多糖水解酶10-15%，碳納米管固定SCH-1蛋白酶5-10%，碳納米管固定SCH-2 蛋白酶10-15 %和以BYK-163潤濕分散劑為0. 5-2 %的助劑組成；該自拋光型酶基防污涂料 制備時，在攪拌狀態下向羥基硅油改性丙烯酸樹脂溶液中加入松香、有機膨潤土，攪拌均勻 后再加入防污活性酶制劑和助劑，將上述物質通過高速分散機分散均勻即制得自拋光型酶 基防污涂料。
2. 根據權利要求1所述的自拋光型酶基防污涂料的制備方法，其特征在于所述多糖水 解酶分解瓊脂測試過程為用接種針蘸取多糖水解酶產生菌培養液在瓊脂培養基上進行劃 線，于25°C下培養3天，觀察瓊脂培養基分解情況。
3. 根據權利要求1所述的自拋光型酶基防污涂料的制備方法，其特征在于所述SCH-1 蛋白酶和SCH-2蛋白酶分解酪蛋白測試過程為用接種針蘸取SCH-1蛋白酶產生菌和SCH-2 蛋白酶產生菌培養液在酪蛋白培養基上進行劃線，于25°C下培養3天，觀察酪蛋白分解情 況。
4. 根據權利要求1所述的自拋光型酶基防污涂料的制備方法，其特征在于所述自拋光 型酶基防污涂料抑制典型污損生物藤壺幼蟲附著測試過程為將本發明實施例5-7制備的 自拋光型酶基防污涂料涂刷于5cmX5cm的馬口鐵片上，涂刷市售的不含防污劑且不具有 自拋光性能的丙烯酸樹脂為對照試樣，每種涂料3個平行樣；涂料干燥后，將試樣片置于直 徑9cm的培養皿中，加入30ml天然海水，每個培養皿中放入50只活潑的藤壺附著期幼蟲， 在黑暗處培養48h，觀察酶基防污涂料抑制典型污損生物藤壺幼蟲附著情況。
【專利摘要】本發明屬于海洋生物污損防護技術領域，涉及一種自拋光型酶基防污涂料的制備方法，包括多糖水解酶與蛋白酶產生菌的分離純化培養、防污活性酶制劑制備和酶基防污涂料制備，多糖水解酶與蛋白酶產生菌分離純化培養包括多糖水解酶產生菌與石灰蟲源蛋白酶產生菌的分離純化與培養，防污活性酶制劑制備是將源于海水菌株的多糖水解酶和石灰蟲外殼菌株的兩種蛋白酶采用相同的分離純化工藝制得相應的防污活性酶制劑；酶基防污涂料制備是選用已公開專利一種羥基硅油改性丙烯酸樹脂作為自拋光型成膜物制得自拋光型酶基防污涂料；其工藝過程簡便，生產成本低，所制備的防污涂料基于生物拮抗效應防污，環境友好，具有較好的防止海洋生物的附著作用。
【IPC分類】C09D7-12, C12N9-50, C09D5-16, C12N9-24, C09D133-08
【公開號】CN104774519
【申請號】CN201510204218
【發明人】王利, 藺存國
【申請人】中國船舶重工集團公司第七二五研究所
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月24日